このプロトコルは、例えば、昆虫抵抗性およびマラリア寄生虫の発生を含む様々な生理学的経路に関与する蚊遺伝子の役割の特性評価を支持する。この方法は、導入遺伝子を事前に特徴付けた単一のゲノム位置に挿入することを促進し、したがって、代替導入遺伝子から生じる表現型を直接比較することを可能にする。この方法は、公衆衛生上および農業上重要な様々な昆虫種に適用することができ、その用途は細菌から哺乳動物細胞まで幅広く及ぶ。
まず、優性蛍光マーカー、attB組換え部位、および所望の導入遺伝子貨物を運ぶattBドナープラスミドを設計することから始めます。トランスジェニックカセットを保持するプラスミド全体の集積には単一のattB部位を使用するか、カセット交換には2つの逆性attB部位を使用する。エンドトキシンフリー精製キットを使用してドナープラスミドとヘルパープラスミドを精製します。
目的の導入遺伝子を担持したattBタグ付きドナープラスミドとインテグラーゼを担持したヘルパープラスミドを組み合わせて、終濃度がドナープラスミド1マイクロリットルあたり350ナノグラム、ヘルパープラスミド1マイクロリットルあたり150ナノグラムの混合物を得た。0.1倍量の3モルの酢酸ナトリウムおよび2.5倍量の氷冷100%エタノールを加えてDNAを沈殿させ、次いでボルテックスを加える。白い沈殿物がすぐに見えるはずです。
ペレットを洗浄し、注入バッファーに再懸濁して、マイクロリットルあたり500ナノグラムの総最終濃度に達する。次に、それぞれ10〜15マイクロリットルのアリコートを準備し、それらを摂氏マイナス20度で保存する。血液は、マイクロ注射の72時間前に、所望のドッキングラインおよびそれらの野生型の対応物から4〜7日齢の蚊に給餌する。
Anopheles gambiae胚のマイクロ注射を25ミリモルの塩化ナトリウムで行い、胚の後極を45度の角度で標的とする。Anopheles stephensi胚をハロカーボン油にマイクロインジェクションし、後極を30度の角度で標的にすることによって行う。注射直後に、卵を滅菌蒸留水で満たされたペトリ皿に移し、昆虫状態に戻す。
孵化したら、G0幼虫を塩漬けの蒸留水を入れたトレイに毎日移し、蛹に後方に移します。ステレオスコープの下で性別でG0の蛹をソートします。男性が3〜5人のグループで別々のケージに出現するのを許し、年齢に合った野生タイプの女性の10倍を超えるものを追加します。
雌を10〜15人のグループで別々のケージに出現させ、年齢が一致した野生型の雄を同数加える。大人が4〜5日間交尾し、女性に血液の食事を提供することを許可します。卵を集めて、次世代のG1を育てましょう。
G1、L3、およびL4の幼虫を、湿ったろ紙を敷いたペトリ皿または顕微鏡スライド上に集め、蛍光ステレオスコープを使用して、attBタグ付き貨物で導入されたマーカーの存在をスクリーニングする。単一の attB デザインの場合、新規マーカーと既存マーカーの有無をスクリーニングします。カセット交換用のダブルattBデザインの場合、新しいマーカーの存在と既存のマーカーの損失をスクリーニングします。
G1の蛹を性別で分類し、異性の年齢に合った野生のタイプの個体と一斉に交差させる。大人が4〜5日間交尾し、血液の食事を提供するのを許してください。単一の統合実験では、塊状の十字架から直接卵を収集します。
カセット交換実験では、単一の雌から卵子を収集し、2つの代替カセット配向の潜在的な存在のために分子評価が完了するまで子孫を別々に維持する。G2子孫に蛍光マーカーの存在をスクリーニングし、分子分析のためにG2陽性個体のサブセットを脇に置いておく。残りを大人に育てる。
テキスト原稿に記載されているように、PCRで挿入部位の分子検証を行います。単一の組み込みの場合、予測された挿入部位が元のドッキング構築物に加えて、2つのハイブリッド部位attLおよびattR間のドナープラスミドの全配列を含むことを確認してください。カセット交換の場合、予測された挿入部位が、ハイブリッド反転 attL サイトが元の反転 attP サイトを置き換え、交換テンプレートがそれらの間に元々存在するカセットを置き換えるドッキングラインの挿入部位と同一であることを確認します。
このプロトコルは、約10週間で安定したアノフェレストランスジェニックラインを生成するために使用された。形質転換の表現型検証は、3xP3プロモーターによって調節される蛍光マーカーのスクリーニングによって行われ、ここに示されている。新しいAnopheles stephensiラインは、CFPでマークされたドッキングラインにDS赤色のマークされたカセットを挿入することによって得られ、その結果、G1子孫は、眼内の赤色および青色の蛍光によって示されるように両方のマーカーを発現した。
カセット交換設計は、もともとドッキングラインに挿入されたマーカーをドナープラスミドのマーカーと交換する結果となる。このマーカー交換は、CFPマーカーが失われ、YFPマーカーが獲得され、黄色の目および神経索蛍光をもたらしたAnopheles gambiaeドッキングラインで実証された。時折、RMCEは、幼虫が元のCFPマーカーと新しいYFPマーカーの両方でマークされている所望のトランスジェニックカセットの交換の代わりに、単一の統合事象をもたらす可能性がある。
蛍光マーカーの存在をスクリーニングする場合、そのシグナルをバックグラウンド自己蛍光の可能性と区別することが重要です。真のCFP陽性個体を同定するには、倍率を高め、蛍光がプロモーターによって駆動されると予想される組織および器官に焦点を当てることが必要である。個々の形質転換体もまた、予想される挿入部位を確認するためにPCRを介して分子的に評価した。
交換されたAnopheles gambiae系統からの個体におけるPCRバリデーションがここに示されている。適切なマイクロインジェクション技術であっても、ドナーおよびヘルパープラスミドの正確な設計および調製、ならびに適切な蚊飼育スキームに従うことは、トランスジェニック個体を得るための鍵である。この手順は、遺伝子の過剰発現またはサイレンシングを引き起こす要素、例えばGAL4/UASシステム、ならびに蚊の遺伝子制御のための遺伝子駆動要素および抗病原体分子を挿入するために使用することができる。
