Preparação de andaimes renais descelularizados em ratos

Este protocolo permite desenvolver andaimes vascularizados usando rins em um modelo de rato. O rim é o órgão mais adequado para andaimes de células-tronco diferenciadas. Este é um protocolo altamente bem sucedido para descelularização do rim.

Ele efetivamente remove os núcleos com destruição mínima da ultraestrutura ECM. Essa técnica pode ser aplicada à medicina de transplante e engenharia de tecidos. Demonstrando o procedimento estará Kim Joo Hyoung, professor associado de Cirurgia Plástica do meu laboratório.

Para começar, coloque o rato Sprague Dawley de oito semanas de idade em uma almofada de aquecimento, e posicione uma sonda de termômetro retal no reto para monitorar a temperatura do núcleo. Depois de anestesiar o rato, coloque-o em uma posição supina, e fixe os quatro membros na mesa com fita. Raspe e limpe o abdômen com sabão germicidal.

Aplique 2% Betadine por pelo menos um a dois minutos, depois limpe-o com uma solução de 70% de etanol. Repita esta sequência três vezes. Cubra o campo operacional com uma cortina estéril e fenestrada.

Faça uma incisão abdominal vertical, e exponha o rim esquerdo, ureter, aorta abdominal e veia cava inferior. Disseque o tecido pouco antes de cortar o pedículo. Prepare 50 mililitros de solução de perfusão por rato misturando PBS com aproximadamente 10 unidades por mililitro heparina.

Misture volumes iguais de 8% PFA com PBS para fazer a solução 4%PFA. Estenda a incisão abdominal vertical cranialmente, certificando-se de retirar a tesoura dos órgãos ao cortar para evitar danos. Continue a incisão através da caixa torácica, e depois corte através do diafragma levantando o esterno.

Retire o retalho solto da pele para fora do caminho com um grampo Allis, e liberte o coração rasgando qualquer tecido conjuntivo com os fórceps. Abra a linha PBS e certifique-se de que ela está fluindo antes de colocar a agulha no ventrículo esquerdo. Segure o coração suavemente com fórceps sem cortes, e use um hemostat para controlar a agulha.

A agulha deve ser inserida não mais do que um quarto de polegada. Enquanto sustenta o coração com a agulha e o hemostat, localize o átrio direito, e corte-o com uma tesoura de iridectomia. Descanse o hemostat sobre o corpo do rato, e certifique-se de que a agulha ainda está posicionada dentro do coração.

Continue perfundiando PBS por quatro minutos ou mais se ainda houver sangue visível no rim e fígado. Colher o rim esquerdo com a aorta abdominal e veia cava inferior. Ligate o ureter, aorta torácica, veia cava superior, e ramos da aorta abdominal.

Mantenha o órgão hidratado em DPBS em uma placa de Petri de 10 centímetros. Cannulate a aorta abdominal e a veia cava inferior com um cateter de calibre 23. Para remover o sangue residual, conecte a cânula com uma bomba peristáltica e lave o órgão com 500 mililitros de DPBS e 16 unidades por mililitro heparina por 90 minutos a cinco rpm e 37 graus Celsius.

Para descelularizar o rim, perfunde-o com 1%Triton X-100 por três horas e, em seguida, com solução de SDS de 0,75% por seis horas a uma pressão constante de 40 mililitros de mercúrio. Para remover sds residuais, perfundir a amostra com 1%de penicilina em água destilada por 18 horas e, em seguida, com DPBS estéreis e 16 unidades por mililitro heparina por 90 minutos. A morfologia bruta dos rins de rato era vermelho escuro.

Após a descelularização, o rim ficou pálido e translúcido. O DNA genômico residual foi quantificado em andaimes renais descelularizados e comparado com o dos rins nativos, confirmando que o DNA genômico tecidual foi quase eliminado após a descelularização. De 14 casos, o conteúdo médio de DNA foi de 115,05 nanogramas por microliter para o controle e 1,96 nanogramas por microliter para o andaime descelularizado.

No total, 98,3% do DNA foi removido. A estrutura tridimensional foi mantida, e glomeruli acelular foram preservados no parênquim cortical. Ao inserir a agulha no ventrículo esquerdo, ela deve ser inserida não mais do que um quarto de polegada.

Qualquer outra inserção pode sair do outro lado. Temos confiança de que essa técnica abrirá uma nova perspectiva no campo da engenharia de tecidos.