K.M.R, S.D.M, M.U. e D.L.D são todos funcionários da Promega Corporation

1. Estudos de degradação do desfecho com proteínas-alvo CRISPR HiBiT em formato lítico com análise opcional de fluorescência de viabilidade celular
<ol><li>Preparação e chapeamento de linhagens celulares aderentes ou em suspensão de mamíferos<ol><li>Ajustar a densidade celular para 2,22 x 105/mL por diluição em meio celular apropriado usado para passagem e crescimento celular.</li>
		<li>Dispensar células em placas com um mínimo de 3 poços por condição experimental e de controle. Dispensar 90 μL (20.000 células) por poço de suspensão celular em placas brancas de 96 poços. Para o formato de 384 poços, dispense 36 μL (8.000 células) por poço de suspensão celular em placas brancas de 384 poços.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparação e adição de compostos<ol><li>Preparar placas de ensaio PROTAC ou degradador diluídas em série a uma concentração final de 1.000x em DMSO a 100%. Em seguida, dilua-o até a concentração final de 10x no meio de cultura celular. Adicione um volume igual de DMSO ao meio, para ser usado como um controle DMSO sem composto.</li>
		<li>Para o formato de 96 poços, adicione 10 μL de 10x composto e soluções de controle a 90 μL de células. Para o formato de 384 poços, adicione 4 μL de 10x composto e soluções de controle a 36 μL de células.</li>
		<li>Incubar as placas em uma incubadora a 37 °C e 5% de CO2 pelo tempo desejado ou em condições ideais para o seu crescimento. NOTA: Como este é um ensaio de ponto de extremidade, o teste de vários pontos de tempo exigirá a preparação de placas de degradação separadas para cada ponto de tempo, conforme descrito na etapa 1.1.2 acima. Os tempos de incubação para detectar a degradação mediada por compostos são altamente variáveis e também são provavelmente dependentes da concentração do composto. Os horários iniciais sugeridos seriam 6 h e 24 h.</li>
		<li>Se a medição da deteção luminescente do ponto de extremidade sem a medição opcional da viabilidade celular, avance diretamente para o passo 1.3 abaixo. Se estiver a realizar a multiplexação com medição da viabilidade celular, avance para a secção 1.4 seguinte abaixo.</li>
	</ol></li>
	<li>Medição lítica de células<ol><li>Imediatamente antes das medições líticas de HiBiT, prepare 2x reagente de detecção lítica adicionando 20 μL de substrato lítico e 10 μL de proteína LgBiT por cada 1 mL do tampão lítico. Prepare um reagente de detecção 2x suficiente para o número de poços a serem ensaiados, incluindo volume extra para explicar o erro de pipetagem (ou seja, número de poços + 10%).</li>
		<li>Adicione o reagente de detecção lítica preparado às células. Para o formato de 96 poços, adicione 100 μL de 2x reagente de detecção lítica a cada poço contendo 100 μL de células. Para o formato de 384 poços, adicione 40 μL de 2x reagente de detecção lítica a cada poço contendo 40 μL de células. Misture a placa em um misturador de vórtice de microplaca por 10-20 min a 350 rpm.</li>
		<li>Meça a luminescência em um luminômetro capaz de ler a luminescência em uma placa de 96 ou 384 poços.</li>
	</ol></li>
	<li>Multiplexação opcional de viabilidade celular NOTA: Esta etapa é executada usando um kit CellTiter-Fluor (CTF) disponível comercialmente (consulte Tabela de Materiais).<ol><li>30-40 min antes da medição do desfecho desejado, prepare uma solução de reagente de detecção de viabilidade celular 6x adicionando 10 μL do substrato a 2 mL do tampão de ensaio. Prepare 6x reagente suficiente para cada poço a ser ensaiado, incluindo volume extra para erro de pipetagem (ou seja, número de poços + 10%).</li>
		<li>Adicione o reagente preparado aos poços. Para o formato de 96 poços, adicione 20 μL de reagente 6x a cada poço que já contenha um volume de 100 μL. Para o formato de 384 poços, adicione 8 μL de reagente 6x a cada poço contendo 40 μL de células. Misture brevemente em um misturador de vórtice de microplacas e, em seguida, incube a placa por 30 min em uma incubadora de 37 °C.</li>
		<li>No ponto final desejado de medição (ou seja, 6 ou 24 horas após o tratamento, etapa 1.2.3), meça a fluorescência em um instrumento capaz de ler a fluorescência (380-400nmEx/505nmEm) no formato de 96 ou 384 poços.</li>
		<li>Preparar 2x reagente de detecção lítica adicionando 20 μL de substrato lítico e 10 μL de proteína LgBiT por 1 mL de tampão lítico. Prepare um reagente de detecção 2x suficiente para o número de poços a serem ensaiados, incluindo volume extra para explicar o erro de pipetagem (por exemplo, número de poços + 10%).</li>
		<li>Adicione o reagente de detecção lítica preparado aos poços. Para o formato de 96 poços, adicione 120 μL de 2x de reagente de detecção lítica a cada poço que já contenha um volume de 120 μL. Para o formato de 384 poços, adicione 48 μL de 2x de reagente de detecção lítica a cada poço que já contenha um volume de 48 μL. Misture a placa em um misturador de vórtice de microplaca por 10-20 min.</li>
		<li>Meça a luminescência em um luminômetro capaz de ler a luminescência em placas de 96 ou 384 poços.</li>
	</ol></li>
	<li>Quantificação da degradação e viabilidade celular<ol><li>Média das unidades de luz relativa (RLU) do controle DMSO no ponto de tempo medido. Use esse valor como o nível de proteína basal do alvo para calcular a degradação fracionada normalizando todos os outros tratamentos testados nesse mesmo momento e apontar para esse valor. Por exemplo, se a RLU média para os poços de controle DMSO em 6 h fosse de 10.000, e a RLU para um determinado tratamento composto em 6 h fosse de 5.000, a degradação fracionada seria calculada como 5.000 ÷ 10.000 = 0,5 (Equação 1). Equação 1: <img alt="Equation " src="/files/ftp_upload/61787/61787equ01.jpg"></li>
		<li>Determine a porcentagem de degradação da RLU Fracionária: Equação 2: <img alt="Equation " src="/files/ftp_upload/61787/61787equ02.jpg"></li>
		<li>Plotar RLU fracionada ou % de degradação em pontos de tempo específicos para classificar a atividade dos compostos.</li>
		<li>Opcionalmente, analise os dados da unidade relativa de fluoressecência (RFU) para a medição do ensaio de viabilidade celular, comparando os valores de todos os tratamentos com o controle DMSO. Se um declínio significativo na RFU for observado para qualquer tratamento em relação ao controle DMSO, os dados de degradação podem ser adicionalmente normalizados para os dados do ensaio de viabilidade celular para determinar mudanças no nível de proteína em relação às perdas na viabilidade celular.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Degradação cinética em tempo real das proteínas-alvo CRISPR HiBiT e ensaio opcional de luminescência de viabilidade celular
NOTA: A capacidade de realizar triagem cinética e degradação requer a co-expressão da proteína LgBiT na célula, o que já foi descrito anteriormente18,19,63. Isso pode ser alcançado através da transfecção transitória de um vetor LgBiT, uso de BacMam LgBiT, ou realizando a inserção de CRISPR HiBiT em uma linhagem celular estável LgBiT.
<ol><li>Banhamento de linhagens celulares aderentes.<ol><li>Remover o meio do balão celular por aspiração, lavar as células com DPBS, dissociar as células com tripsina-EDTA a 0,05% e permitir que as células se dissociem do fundo do frasco. Para as linhas de células de suspensão, passar ao ponto 2.2.</li>
		<li>Neutralize a tripsina usando meio de cultura celular contendo soro, misture para coletar e ressuspender as células e transfira a suspensão celular para um tubo cônico.</li>
		<li>Gire as células a 125 x g por 5 min. Rejeitar o meio de cultura celular e ressuspender num volume igual de meio de cultura de células frescas.</li>
		<li>Células de placa em placas de ensaio com um mínimo de poços triplicados por condição experimental e de controle. Para a contagem do formato de 96 poços para estimar a densidade celular, ajuste a densidade para 2 x 105 células/mL em meio de ensaio e dispense 100 μL (20.000 células) por poço em uma placa de 96 poços. Para a contagem do formato de 384 poços para estimar a densidade celular, ajuste a densidade para 4,44 x 105 células/mL no meio de ensaio e dispense 18 μL (8.000 células) por poço.</li>
		<li>Incubar as placas a 37 °C, 5% de CO2 durante a noite ou em condições ideais para o seu crescimento.</li>
	</ol></li>
	<li>Chapeamento de células de suspensão<ol><li>Ajustar a densidade celular para 2,22 x 105 células/mL em meio independente de CO2 suplementado com 10% FBS e 1x Endurazina (diluição 1:100 do reagente de estoque).</li>
		<li>Células de placa em placas de ensaio com um mínimo de 3 poços por condição experimental e de controle. Para o formato de 96 poços dispense 90 μL (20.000 células) por poço. Para o formato de 384 poços, dispense 36 μL (8.000 células) por poço. NOTA: Para linhas de células de suspensão que têm baixa luminescência de sinal para fundo (S:B), por exemplo, ao trabalhar com pools CRISPR em vez de clones, é possível aumentar a luminescência aumentando o número de células chapeadas, até 100.000 células/poço no formato de 96 poços ou 40.000 células/poço no formato de 384 poços.</li>
	</ol></li>
	<li>Ensaios de degradação cinética usando células CRISPR HiBiT expressando LgBiT<ol><li>Para as células de suspensão que já contenham Endurazina, que foi incluída na fase de chapeamento do ponto 2.2., passar directamente para a fase 2.3.3. Para linhagens celulares aderentes preparar solução de Nano-Glo Endurazine. Para o formato de 96 poços, prepare uma solução 1x de Endurazina diluindo o reagente de estoque 1:100 em meio independente de CO2 suplementado com 10% de FBS. Para o formato de 384 poços, prepare uma solução 2x de Endurazina diluindo o reagente de estoque 1:50 em meio independente de CO2 suplementado com 10% de FBS.</li>
		<li>Adicione a solução de endurazina a cada poço de células aderentes. Para o formato de 96 poços, aspirar o meio e adicionar 90 μL de 1x solução de Endurazina. Para o formato de 384 poços, adicione 18 μL de solução de endurazina 2x a 18 μL de células. Não aspirar o meio, pois o ensaio de degradação é realizado em uma mistura 50:50 de meio de cultura e meio independente de CO2 em formato de 384 poços.</li>
		<li>Incubar a suspensão ou as placas celulares aderentes contendo Endurazina durante 2,5 h numa incubadora a 37 °C e 5% de CO2 para permitir o equilíbrio da luminescência.</li>
		<li>Preparar uma concentração de 10x de titulação PROTAC de ensaio em meio independente de CO2 e adicionar 10 μL a cada poço de placa de 96 poços ou 4 μL para placa de 384 poços. Para compostos com eficácia desconhecida, recomenda-se uma concentração final de 1-10 μM no ponto mais alto como ponto de partida.</li>
		<li>Coletar medições cinéticas de luminescência em luminômetro pré-equilibrado a 37 °C por um período entre 0-48 h. Os incrementos de tempo de medição podem ser personalizados para cada experimento, mas um experimento inicial recomendado seria medições de luminescência a cada 5-15 min por 24 horas ou a quantidade desejada de tempo.</li>
	</ol></li>
	<li>Análise multiplex de mesmo poço de viabilidade celular opcional após medição cinética final NOTA: Este ensaio é realizado com um kit CellTiter-Glo (CTG) comercialmente disponível (ver Tabela de Materiais).<ol><li>Equilibrar o reagente CTG à temperatura ambiente.</li>
		<li>Após a medição da degradação no último ponto de tempo da análise cinética, adicionar 100 μL (placa de 96 poços) ou 40 μL (placa de 384 poços) do reagente por poço da placa e misturar em um agitador de placas a 500-700 rpm (placa de 96 poços) ou um misturador de vórtice de microplacas (placa de 384 poços) por 5 min.</li>
		<li>Incubar a placa à temperatura ambiente durante 30 minutos para permitir a lise celular e a têmpera do sinal HiBiT.</li>
		<li>Meça a luminescência total em um luminômetro seguindo a recomendação do fabricante.</li>
	</ol></li>
	<li>Quantificação dos perfis de degradação cinética<ol><li>Usando as medições de luminescência cinética coletadas, normalize os RLUs brutos para cada concentração de PROTAC para a condição DMSO média replicada em cada ponto de tempo para explicar as mudanças na concentração de furimazina livre ao longo do tempo. Calcule a RLU Fracionada usando a Equação 1. Equação 1: <img alt="Equation " src="/files/ftp_upload/61787/61787equ01.jpg"></li>
		<li>A partir das curvas de degradação, ajuste um modelo de decaimento exponencial de componente único usando a Equação 2 à porção de degradação inicial de cada curva até o ponto em que os dados atinjam um platô. NOTA: Pode ser útil excluir do ajuste os primeiros pontos de dados, pois pode haver um breve atraso antes que a degradação seja observada. Equação 2: <img alt="Equation " src="/files/ftp_upload/61787/61787equ03.jpg"></li>
		<li>A partir da Equação 2, determine o parâmetro ƛ, que representa a constante da taxa de degradação e o Planalto, que representa a menor quantidade de proteína restante.</li>
		<li>Calcule Dmax, que é a quantidade fracionada máxima de proteína degradada e é calculada como 1-Plateau.</li>
		<li>Gráfico Dmax para cada concentração de PROTAC para determinar uma curva de potência de degradação independente do tempo.</li>
		<li>Determinar o valor de Dmax50 para a parcela em 2.3.5 para analisar a eficácia dos compostos. NOTA: Para determinar um DC50 em um ponto de tempo específico, plote a porcentagem de degradação calculada para cada concentração no momento escolhido. Isso pode ser especificado como DC 50 t=4 h ou DC50 t=12 h.</li>
	</ol></li>
</ol>

A Promega Corporation é a proprietária comercial por cessão de patentes das tecnologias e aplicações HiBiT e NanoLuc.

Apresentamos aqui dois métodos de triagem da atividade composta de degradação no formato lítico do ponto final ou no modo cinético de células vivas. Essas abordagens são baseadas nos mesmos princípios de medição luminescentes, mas fornecem diferentes níveis de detalhe e compreensão. A escolha de qualquer uma das abordagens provavelmente dependerá das metas de triagem e do tamanho da biblioteca composta. Para grandes plataformas de triagem composta ou telas primárias para observar qualquer degradação detectável, a triagem lítica de endpoint oferece compatibilidade sensível e eficiente de alto rendimento onde outras abordagens de endpoint, como western blot ou espectrometria de massa, podem ser impraticáveis ou difíceis de adaptar14. Um ponto de partida para essas telas poderia ser realizado com um número limitado de concentrações e pontos de tempo. As concentrações iniciais recomendadas para testar estão na faixa de 100 nM-10 μM, para explicar os degradadores iniciais com baixa potência, baixa permeabilidade ou, em alguns casos, com compostos altamente potentes, a presença de um efeito gancho. Recomenda-se ainda que um mínimo de dois pontos de tempo diferentes deve ser testado para estabelecer a degradação de início precoce em 4-6 h e degradação latente ou sustentada em 18-24 h. Compostos que exibem alta potência de degradação e mecanismo no alvo são prontamente observados dentro de um período de tempo de 4-6 h, enquanto a degradação ou perda aparente de proteína observada apenas em pontos de tempo posteriores pode ser devido a uma variedade de mecanismos. É altamente recomendável monitorar a viabilidade celular em ambos os pontos de tempo precoce e tardio, de modo que a perda de proteína pode ser desacoplada da perda devido à morte celular. Semelhante a qualquer tipo de ensaio luminescente ou fluorescente, há um potencial para compostos dentro de bibliotecas interferirem ou inibirem o sinal, portanto, experimentos ortogonais de acompanhamento com compostos de chumbo usando fusões não relacionadas ou abordagens alternativas para monitorar o nível de proteína serão importantes para avaliar que a perda de RLU nesses ensaios está associada diretamente à degradação da proteína alvo.
A capacidade de triagem em formato cinético de células vivas durante longos períodos de tempo depende fortemente do sinal de ensaio para o fundo (S: B). Os fatores que contribuem para S: B incluem o nível de expressão da própria proteína alvo, que pode abranger várias ordens de magnitude, a eficiência da expressão de LgBiT na linhagem celular escolhida para a inserção de peptídeos, e a disponibilidade do alvo marcado para complementação em seus diversos complexos nativos. Estabelecemos um requisito geral de corte que consiste em um S: B de 15 para medir com sucesso a degradação no modo cinético com Endurazina ou Vivazina. O S:B é determinado medindo o sinal basal das células editadas por HiBiT que co-expressam LgBiT em relação às células parentais não editadas que expressam LgBiT isoladamente na presença de substratos celulares vivos de Endurazina ou Vivizina. A vivazina produzirá um sinal luminescente mais alto, mas decairá mais rapidamente do que a Endurazine e pode limitar a aquisição de sinal a 24 horas ou menos. Além disso, o S:B também pode ser altamente dependente do uso de pools ou clones CRISPR. Para alvos em linhagens celulares que são mais receptivos e têm alta eficiência para a engenharia CRISPR/Cas9, uma população heterogênea de células editadas do pool CRISPR pode ter S:B suficiente para análise cinética. Para alvos em linhagens celulares mais difíceis, onde a integração genômica menos eficiente via CRISPR resulta em pools com baixo S:B, o isolamento de clones CRISPR pode ser necessário para enriquecer populações editadas e alcançar um S:B suficientemente alto para análise cinética. Para qualquer um desses cenários, se S:B for menor que 15 com substratos de Endurazina ou Vivazine, recomenda-se a triagem lítica de desfecho.
Para melhor compreensão e caracterização dos compostos, incluindo a determinação de um perfil de degradação com parâmetros quantitativos, a análise cinética em tempo real em células vivas é a abordagem de triagem recomendada14,18. Como a análise de desfechos discutida acima, a triagem cinética inicial pode ser feita com um número limitado de concentrações na faixa de 100nM-10μM de forma de alto rendimento. No formato de 384 poços, mais de 100 compostos podem ser prontamente rastreados em triplicado em uma concentração em uma única placa. Os perfis de degradação resultantes fornecerão orientação não apenas sobre a extensão da degradação observada, mas a taxa de degradação, a duração da degradação e a potencial recuperação da proteína14,18 (Figura 2 e Figura 3). As formas do perfil de degradação também produzem informações valiosas. Degradadores específicos e potentes geralmente mostram uma rápida perda inicial da proteína-alvo para um platô em questão de horas18,53, enquanto outros mecanismos, como feedback transcricional ou toxicidade composta, normalmente resultam em perda mais linear da proteína ao longo do tempo. Esses detalhes e nuances são perdidos com a análise lítica de endpoint, e com a análise em tempo real ao longo de 24-48 horas, não é necessário prever o tempo para capturar o verdadeiro Dmax dentro de conjuntos de compostos novos ou desconhecidos.
A cinética em tempo real também permite uma triagem eficiente da resposta à dose para entender melhor a eficácia dos compostos, como a concentração de compostos afeta a taxa de degradação inicial e oferece possibilidades de classificar os compostos com base em mais de um parâmetro. As medições clássicas da potência de degradação envolvem cálculos DC50 em um ponto específico no tempo com base nos máximos de degradação aparente. Em contraste, nossa abordagem cinética para avaliar a potência incorpora o verdadeiro máximo de degradação em cada concentração, independentemente de quando ocorre no tempo18. Chamamos essa medida de potência de degradação cinética, de Dmax5018. A análise desta forma é responsável por compostos que podem iniciar a degradação mais lentamente em concentrações mais baixas e, portanto, levar mais tempo pós-tratamento para atingir seu Dmax. Pode ser especialmente informativo classificar os compostos tanto na taxa de degradação quanto no Dmax. Para os degradadores mais potentes, isso diferenciará ainda mais os degradadores lentos, mas potentes, daqueles que são rápidos e potentes. Juntas, a triagem cinética de células líticas e vivas utilizando linhagens celulares CRISPR HiBiT são abordagens poderosas que produzem uma imagem mais abrangente da degradação proteica direcionada, função composta e permitem o processo de triagem desde a avaliação inicial da atividade até a otimização química a jusante através do aprimoramento dos principais parâmetros de degradação.

A degradação proteica direcionada emergiu como uma das áreas de crescimento mais rápido na descoberta de medicamentos de pequenas moléculas, reforçada grandemente pelo sucesso terapêutico de compostos de cola molecular imunomoduladores (por exemplo, IMiD) para o tratamento do câncer e promissores dados de ensaios clínicos iniciais de compostos de quimera de proteólise direcionada a quimera 1,2,3,4,5,6,7,8, 9,10,11,12. Os compostos de degradação proteica direcionada funcionam aproximando-se uma proteína-alvo com proteínas de máquinas de ligase E3 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 . Este recrutamento induzido por composto da proteína-alvo para a ligase E3 leva à ubiquitinação e degradação da proteína-alvo através da via proteassómica da ubiquitina (UPP)1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 . Historicamente, os programas de triagem de descoberta de medicamentos de pequenas moléculas têm contado com ensaios bioquímicos iniciais para avaliar a atividade e classificar os compostos de ordem. Isso, no entanto, tem apresentado um desafio significativo para os degradadores de proteínas alvo cuja atividade final, a degradação através do proteassoma, depende de uma cascata de eventos celulares 1,2,4,5,6,11,12,13,14,15,16,17, 18. As múltiplas vias e a complexidade dos complexos proteicos necessários para o sucesso da degradação do alvo requerem abordagens de ensaio celular para triagem precoce e triagem de compostos iniciais. Atualmente, a disponibilidade de tecnologias para monitorar a degradação de proteínas-alvo de forma de alto rendimento no contexto do ambiente celular é severamente deficiente14. Aqui apresentaremos protocolos para avaliação da atividade de degradação lítica cinética de células vivas cinéticas ou endpoint em tempo real usando linhagens celulares alvo de HiBiT endogenamente marcadas CRISPR/Cas9 18,19,20 para monitorar a perda da proteína-alvo via medição luminescente após tratamento com compostos degradantes10,11,18,19.
Para alcançar a degradação bem-sucedida de alvos terapêuticos e expandir o proteoma medicamentoso, surgiram inúmeras abordagens e tipos de degradadores que podem atingir uma ampla gama de proteínas para destruição, incluindo aquelas localizadas na membrana plasmática ou na membrana plasmática, lisossomos, membranas mitocondriais, citoplasma e núcleo21–57. As duas classes primárias de compostos mais amplamente estudadas são colas moleculares e proteínas direcionadas a cimeras 2,4,5,6,7,12,26. As colas moleculares são monovalentes, portanto, tipicamente menores em tamanho, e facilitam uma nova interface de interação proteína:proteína com uma proteína-alvo ao se ligar a um componente da ligase E3 2,12,26. Eles são mais comumente degradadores que se ligam ao componente 2,12,26,55,56,56,56,57 da ligase Cereblon (CRBN). Recentemente, novos exemplos empolgantes utilizando outras máquinas de ligase E3, como DCAF15 58,59,60 e CDK / Cyclin recrutamento para DDB145 mostram o potencial de expansão desta classe de compostos. Em contraste, os PROTACs são moléculas maiores e bivalentes, consistindo de um ligante de ligação alvo, na maioria das vezes um inibidor, ligado através de um ligador químico a um cabo de ligase E3 1,3,4,5,7,13. Como tal, esses compostos são capazes de se ligar diretamente tanto à ligase E3 quanto à proteína-alvo 1,3,4,5,7,13. Numerosas proteínas têm se mostrado degradadas por meio dessas moléculas bivalentes, e os manipuladores de ligase E3 mais utilizados recrutam CRBN ou Von Hippel Lindau (BVS)1,3,4,5,7,13. No entanto, o número de alças disponíveis para o recrutamento de ligase E3 em quimeras visando o projeto de proteólise está crescendo rapidamente, expandindo as capacidades dessa classe de compostos com o potencial de degradar diversas classes-alvo, bem como melhorar a especificidade do tipo celular ou tecidual 24,48,61,62 . Combinado com o requisito mínimo de envolver uma proteína-alvo, mesmo com afinidade marginal, os compostos de degradação são promissores para expandir o proteoma medicamentoso.
Caracterizar a dinâmica celular da perda de proteínas, bem como a potencial recuperação de proteínas pós-tratamento, é fundamental para a compreensão da função e eficácia do composto de degradação. Embora seja possível estudar as mudanças endógenas do nível de proteína em sistemas celulares relevantes com ensaios de anticorpos western blot ou espectrometria de massa, essas abordagens são difíceis de adaptar a formatos de triagem de alto rendimento, têm capacidade limitada de quantificação ou capacidade de medir mudanças cinéticas em muitos pontos de tempo14. Para enfrentar esses desafios, desenvolvemos um sistema luminescente celular baseado em placas para monitorar mudanças nos níveis endógenos de proteína, que utiliza a inserção genômica via CRISPR/Cas9 da tag de 11 aminoácidos, HiBiT, aos loci de quaisquer alvos chave de degradação18,19,20. Este peptídeo complementa com alta afinidade ao seu parceiro de ligação, LgBiT, para produzir luminescência brilhante na presença de seu substrato 18,19,20,63, tornando essas proteínas endógenas marcadas luminescentes em células ou lisados 18,19,20,63 . As unidades de luz relativa (RLUs) medidas com um instrumento de luminômetro são diretamente proporcionais aos níveis de proteína-alvo marcados 18,19,20,63. Com o desenvolvimento de substratos de luciferase estabilizados, medidas do nível cinético de proteína em tempo real ao longo de períodos de 24-48 h são possíveis 18,53,64. Isso permite a determinação de um perfil de degradação completo para qualquer alvo em qualquer concentração de composto, incluindo análise quantitativa da taxa de degradação inicial, do máximo de degradação (Dmax) e da recuperação após o tratamento do composto18,53. Se a triagem de grandes bibliotecas de compostos de degradação, no entanto, a análise de desfecho também pode ser prontamente realizada no formato de 384 poços em várias concentrações de drogas e horários designados.
Os protocolos apresentados neste manuscrito representam estratégias de triagem celular para compostos de degradação proteica direcionados, aplicáveis a todos os tipos de degradadores. O uso de linhagens celulares HiBiT CRISPR juntamente com esses protocolos, no entanto, não se limita à degradação proteica, mas são ferramentas gerais para o monitoramento de qualquer nível endógeno de proteína-alvo que poderia ser modulado pós-tratamento para estudar o impacto de compostos ou mesmo mecanismos de resistência 20,65,66. Um pré-requisito para esses métodos de detecção baseados em luminescentes é uma linhagem celular alvo HiBiT endogenamente marcada CRISPR, o que é crítico, pois permite a detecção luminescente sensível, mantendo a expressão endógena do alvo e a regulação do promotor nativo18,19,20. Avanços significativos têm sido realizados na utilização de CRISRP/Cas9 para inserção de tags genômicas, particularmente na escalabilidade 20 e com alta sensibilidade de detecção, em diversos formatos, incluindo pools CRISPR ou clones com inserções alélicas heterozigotas ou homozigotas18,19,20. O uso de expressão exógena de HiBiT ou outras fusões de repórteres em células em vez de marcação endógena é possível, mas deve-se ter cautela significativa usando sistemas com superexpressão proteica14,18. Estes podem levar a artefatos na compreensão da verdadeira potência do composto e da dinâmica de recuperação de proteínas14,18, incluindo potenciais loops de feedback transcricional ativados após a degradação do alvo. Além disso, compostos em estágio inicial com baixa potência podem ser perdidos e se apresentam como falsos negativos na triagem. Como a perda de proteína pode resultar da toxicidade induzida por compostos e da morte celular, os protocolos descritos aqui contêm ensaios luminescentes ou fluorescentes de viabilidade celular altamente recomendados, mas opcionais, emparelhados com o protocolo de degradação. Existem duas seções principais para o protocolo, o ponto de extremidade lítico e a triagem cinética de células vivas. Dentro de cada uma dessas seções, são incluídas opções para medições de viabilidade celular multiplexada em formatos de ponto final ou cinéticos. O monitoramento das mudanças da proteína endógena marcada requer complementação com LgBiT nas células. Portanto, a seção de triagem cinética referencia protocolos importantes para a introdução deste, que pode ser alcançado via expressão transitória ou estável e é essencial para a realização das medições luminescentes de células vivas. Todas as abordagens aqui apresentadas permitem a rápida ordenação de classificação e avaliação da atividade dos compostos, permitindo esforços de triagem de compostos em estágio inicial e identificação mais rápida de degradadores de chumbo.
Este protocolo é projetado para o estudo de compostos de degradação em conjunto com uma linhagem celular CRISPR HiBiT. Protocolos para geração de inserções de CRISPR HiBiT para inúmeros alvos têm sido delineados em diversas publicações recentes18,19,20.

<table><tbody><tr><td>CellTiter-Glo 2.0 reagent</td><td>Promega</td><td>G9241</td><td>Cell Viability luminescent assay</td></tr><tr><td>CellTiter-Fluor Cell Viability Assay</td><td>Promega</td><td>G6080</td><td>Cell Viability fluorescent assay</td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;-independent medium</td><td>ThermoFisher</td><td>18045-088</td><td>Cell culture</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650</td><td>For compound dilution and control</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190</td><td>Cell culture</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Seradigm</td><td>89510-194</td><td>Cell culture</td></tr><tr><td>HEK293 LgBiT stable cell line</td><td>Promega</td><td>N2672</td><td>For complementation with HiBiT to generate luminescence</td></tr><tr><td>HiBiT CRISPR mammalian cell line</td><td>Promega</td><td></td><td>&lt;u&gt;https://www.promega.com/crispr-tpd&lt;/u&gt;</td></tr><tr><td>Hygromycin B solution</td><td>Gibco</td><td>10-687-010</td><td>Cell culture</td></tr><tr><td>LgBiT BacMam</td><td>Promega</td><td>CS1956C01</td><td>For complementation with HiBiT to generate luminescence</td></tr><tr><td>LgBiT Expression Vector</td><td>Promega</td><td>N2681</td><td>For complementation with HiBiT to generate luminescence</td></tr><tr><td>Luminometer Plate Reader</td><td></td><td></td><td>Luminomenter capable of measuring luminescence and fluorescence (e.g. GloMax Discover System, Promega GM3000)</td></tr><tr><td>NanoGlo Endurazine live cell substrate</td><td>Promega</td><td>N2570</td><td>Kinetic HiBiT reagent</td></tr><tr><td>NanoGlo Vivazine live cell substrate</td><td>Promega</td><td>N2580</td><td>Kinetic HiBiT reagent</td></tr><tr><td>NanoGlo HiBiT Lytic Detection system</td><td>Promega</td><td>N3030</td><td>Enpoint lytic HiBiT reagent</td></tr><tr><td>Opti-MEM Reduced Serum Medium, no phenol red (ThermoFisher)</td><td>ThermoFisher</td><td>11058-021</td><td>Cell culture</td></tr><tr><td>Tissue culture plates, white, 96 well plate</td><td>Costar</td><td>3917</td><td>Cell culture</td></tr><tr><td>Tissue culture plates, white, 384 well plate</td><td>Corning</td><td>3570</td><td>Cell culture</td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300</td><td>Cell culture</td></tr></tbody></table>

high-throughput cellular profiling of targeted protein degradation compounds using hibit crispr cell lines

Compostos direcionados de degradação de proteínas, incluindo colas moleculares ou proteólise visando quimeras, são uma nova modalidade terapêutica empolgante na descoberta de medicamentos de pequenas moléculas. Esta classe de compostos induz a degradação da proteína, aproximando a proteína alvo e as proteínas da maquinaria da ligase E3 necessárias para ubiquitinar e, finalmente, degradar a proteína-alvo através da via ubiquitina-proteassomal (UPP). O perfil da degradação da proteína-alvo de forma de alto rendimento, no entanto, permanece altamente desafiador, dada a complexidade das vias celulares necessárias para alcançar a degradação. Aqui apresentamos um protocolo e estratégia de triagem baseado no uso de marcação endógena CRISPR/Cas9 de proteínas-alvo com a tag HiBiT de 11 aminoácidos que complementa com alta afinidade à proteína LgBiT, para produzir uma proteína luminescente. Essas linhagens celulares direcionadas à CRISPR com etiquetas endógenas podem ser usadas para medir a degradação induzida por compostos em tempo real, cinética de células vivas ou modos líticos de extremidade, monitorando o sinal luminescente usando um leitor baseado em placa luminescente. Aqui descrevemos os protocolos de triagem recomendados para os diferentes formatos, e também descrevemos o cálculo dos principais parâmetros de degradação da taxa, Dmax, DC50, Dmax50, bem como a multiplexação com ensaios de viabilidade celular. Essas abordagens permitem a rápida descoberta e triagem de compostos em estágio inicial, mantendo a expressão endógena e a regulação de proteínas-alvo em fundos celulares relevantes, permitindo a otimização eficiente de compostos terapêuticos de chumbo.

Para demonstrar a análise de degradação lítica de um único ponto final, várias proteínas-alvo CDK; CDK2, CDK4, CDK7 e CDK10 foram endogenamente marcados com HiBiT em seu terminal C em células HEK293 e tratados com uma concentração de 1 μM do PROTAC à base de pan-quinase Cereblon, TL12-18654 (Figura 1A). O nível de proteína CDK foi medido em diferentes momentos e o RLU fracionado em relação ao controle do DMSO foi determinado (Figura 1A). Cada proteína CDK apresentou diferentes graus de degradação em resposta ao tratamento com composto e aos vários pontos de tempo (Figura 1A). Para entender como as proteínas CDK se compararam diretamente em termos de perda de proteínas, as RLUs fracionárias da Figura 1A foram calculadas como % total de degradação e plotadas para cada ponto de tempo na Figura 1B. Isso mostra que, mesmo nos primeiros momentos, 2 ou 4 h, alguns dos membros da família CDK apresentam altos níveis de degradação que continuam a tender para cima ao longo do tempo (Figura 1B).
Para demonstrar a análise de degradação cinética, cada uma das proteínas dos membros da família BET; BRD2, BRD3 e BRD4 foram endogenamente marcados com HiBiT em seu terminal N em células HEK293 expressando de forma estável a proteína LgBiT18. Estes foram então tratados com três concentrações diferentes dos PROTACs pan-BET; o dBET650 baseado em Cereblon (Figura 2A) e o ARV-77141 baseado em BVS (Figura 2B). As medidas cinéticas foram coletadas durante um período de 24 horas e, a partir dos perfis em cada concentração, as diferenças na resposta dos membros da família BET são prontamente aparentes. A capacidade do BRD2 de iniciar uma resposta de recuperação mais rápida pós-tratamento de compostos de degradação (Figura 2A,B) foi previamente observada com outros PROTACs pan-BET e é provavelmente devido a uma resposta de feedback transcricional competitiva ao processo de degradação18.
Tanto o desfecho quanto a análise cinética podem ser feitos com tratamentos completos de resposta à dose composta. Na Figura 3 são mostrados os perfis cinéticos de degradação da resposta à dose do tratamento de células Ikaros/IKZF1-HiBiT CRISPR Jurkat expressando de forma estável a proteína LgBiT com quatro compostos de cola molecular diferentes 2,26,55,57; lenalidomida (Figura 3A), iberdomida (CC-220) (Figura 3B), talidomida (Figura 3C) e pomalidomida (Figura 3D). Esses degradadores apresentam diferenças significativas na resposta à degradação entre os compostos, bem como entre as séries de concentração (Figura 3).
Para avaliar quantitativamente a degradação e ordenar os compostos da Figura 3, os perfis de resposta à dose foram utilizados para calcular os principais parâmetros de degradação, incluindo os valores de taxa de degradação (Figura 4A), Dmax (Figura 4B) e Dmax50 (Figura 4B). Essas análises mostram que a iberdomida (CC-220) e a pomalidomida têm taxas de degradação inicial rápidas muito semelhantes (Figura 4A), mas a iberdomida (CC-220) tem a maior potência, como já foi visto anteriormente em estudos ortogonais55,57 (Figura 4B). Uma vez que a iberdomida apresenta uma potência tão elevada, e todas as concentrações testadas apresentam uma degradação superior a 50%, o valor de Dmax50 obtido para a iberdomida representa uma estimativa baseada na limitação no ajuste preciso dos dados. A partir dos gráficos da Figura 3C,D e da Figura 4B, nem a lenalidomida nem a talidomida degradam o alvo Ikaros/IKZF1 até à conclusão nas concentrações mais elevadas testadas. Devido à muito pouca degradação observada com a talidomida, os traços de degradação não puderam ser ajustados com precisão a um modelo de decaimento exponencial, portanto, a taxa de degradação não foi quantificada para este tratamento. Para o degradador mais potente, a iberdomida (CC-220)55,57 (Figura 4B). Os ensaios multiplex de viabilidade celular não mostraram perda na viabilidade celular para as concentrações testadas (Figura 4C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61787/61787fig01.jpg"> Figura 1: Degradação e toxicidade do parâmetro CDK com pan-quinase PROTAC, TL12-18654. (A) Selecionar painel de proteínas-alvo CDK endógenas fundidas com HiBiT no terminal C via CRISPR/Cas9 e avaliadas quanto à degradação com 1 μM TL12-186 PROTAC 54 no tratamento de 2 h, 4 h, 8 h e24 h. Os valores são representados como RLU Fracionada em relação a um controle DMSO medido em cada ponto de tempo. As barras de erro representam DP da média de 3 replicações técnicas. (B) Porcentagem de degradação do painel de proteínas-alvo CDK calculada a partir de (A) representando a quantidade de degradação de cada membro da família observada nos momentos de 2, 4, 8 e 24 h. As barras de erro representam DP da média de 3 replicações técnicas. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/61787/61787fig01large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61787/61787fig02.jpg"> Figura 2: Perfil da seletividade da degradação cinética de membros da família BET com degradadores BET, dBET650 e ARV-77141. Perfis de degradação cinética de membros endógenos da família BET, BRD2, BRD3 e BRD4, marcados com HiBiT no terminal N via CRISPR/Cas9 com tratamento de concentrações únicas de 1 nM (esquerda), 10 nM (meio) ou 100 nM (direita) dBET650 (A) ou ARV-77141 (B) PROTACs. Os valores são representados como RLU Fracionada calculada a partir de um controle DMSO em cada ponto de tempo cinético. As barras de erro representam DP da média de 4 repetições técnicas. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/61787/61787fig02large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61787/61787fig03.jpg"> Figura 3: Perfis de resposta à dose de degradação cinética de células vivas de Ikaros/IKZF1-HiBiT com um painel de cola molecular 2,26,55,57. As células Jurkat expressando de forma estável a proteína LgBiT foram modificadas usando CRISPR/Cas9 para marcar o terminal C de Ikaros/IKZF1 com o peptídeo HiBiT. As células foram tratadas com uma série de concentrações de resposta à dose de 8 pontos, incluindo DMSO de quatro diferentes compostos moleculares de cola 2,26,55,57: (A) lenalidomida, (B) iberdomida (CC-220), (C) talidomida ou (D) pomalidomida. A luminescência foi medida a cada 5 min para um total de 19,5 h. Os dados da unidade de luz relativa (RLU) de (A-D) foram convertidos em RLU fracionária, conforme descrito na Etapa 2.4.1, e representados graficamente em função do tempo. As barras de erro representam SD de 3 replicações técnicas. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/61787/61787fig03large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61787/61787fig04.jpg"> Figura 4: Cálculo da taxa de degradação e Dmax50 para Ikaros/IKZF1-HiBiT, e ensaios de saúde celular multiplexadora. Os dados de degradação cinética da Figura 3 foram utilizados para calcular os parâmetros quantitativos de degradação. (A) As taxas de degradação e (B) os valores máximos de degradação (Dmax) são representados graficamente em cada concentração de fármaco para os compostos de cola molecular indicados 2,26,55,57. (B) Os valores de Dmax50 para cada composto foram calculados usando um modelo dose-resposta com inclinação de Hill restrita de 1, que pode ser usado para classificar compostos de degradação de ordem para um alvo. (C) Os ensaios de viabilidade celular com a resposta à dose de degradação da iberdomida (CC-220)55,57 da Figura 3B foram realizados como uma medição final após a conclusão das medições de degradação cinética. As barras de erro representam SD de 3 replicações técnicas. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/61787/61787fig04large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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High-Throughput Cellular Profiling of Targeted Protein Degradation Compounds Using HiBiT CRISPR Cell Lines

Este protocolo descreve a detecção luminescente quantitativa da cinética de degradação de proteínas em células vivas que foram modificadas usando CRISPR/Cas9 para expressar a etiqueta de detecção endógena livre de anticorpos fundida a uma proteína-alvo. Instruções detalhadas para calcular e obter parâmetros quantitativos de degradação, taxa, Dmax, DC 50 e Dmax50 estão incluídas.

Perfil celular de alto rendimento de compostos de degradação de proteínas direcionadas usando linhas celulares CRISPR HiBiT

Targeted protein degradation compounds, including molecular glues or proteolysis targeting chimeras, are an exciting new therapeutic modality in small ...

high-throughput-cellular-profiling-targeted-protein-degradation

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Cancer Research

9.2K visualizações.  Promega Corporation. Este protocolo descreve a detecção luminescente quantitativa da cinética de degradação de proteínas em células vivas que foram modificadas usando CRISPR/Cas9 para expressar a etiqueta de detecção endógena livre de anticorpos fundida a uma proteína-alvo. Instruções detalhadas para calcular e obter parâmetros quantitativos de degradação, taxa, Dmax, DC 50 e Dmax50 estão incluídas.

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Using a Fluorescent PCR-capillary Gel Electrophoresis Technique to Genotype CRISPR/Cas9-mediated Knockout Mutants in a High-throughput Format

The development of programmable genome-editing tools has facilitated the use of reverse genetics to understand the roles specific genomic sequences play in the functioning of cells and whole organisms. This cause has been tremendously aided by the recent introduction of the CRISPR/Cas9 system-a versatile tool that allows researchers to manipulate the genome and transcriptome in order to, among other things, knock out, knock down, or knock in genes in a targeted manner. For the purpose of knocking out a gene, CRISPR/Cas9-mediated double-strand breaks recruit the non-homologous end-joining DNA repair pathway to introduce the frameshift-causing insertion or deletion of nucleotides at the break site. However, an individual guide RNA may cause undesirable off-target effects, and to rule these out, the use of multiple guide RNAs is necessary. This multiplicity of targets also means that a high-volume screening of clones is required, which in turn begs the use of an efficient high-throughput technique to genotype the knockout clones. Current genotyping techniques either suffer from inherent limitations or incur high cost, hence rendering them unsuitable for high-throughput purposes. Here, we detail the protocol for using fluorescent PCR, which uses genomic DNA from crude cell lysate as a template, and then resolving the PCR fragments via capillary gel electrophoresis. This technique is accurate enough to differentiate one base-pair difference between fragments and hence is adequate in indicating the presence or absence of a frameshift in the coding sequence of the targeted gene. This precise knowledge effectively precludes the need for a confirmatory sequencing step and allows users to save time and cost in the process. Moreover, this technique has proven to be versatile in genotyping various mammalian cells of various tissue origins targeted by guide RNAs against numerous genes, as shown here and elsewhere.

The genotyping technique described here, which couples fluorescent polymerase chain reaction (PCR) to capillary gel electrophoresis, allows for high-throughput genotyping of nuclease-mediated knockout clones. It circumvents limitations faced by other genotyping techniques and is more cost effective than sequencing methods.

Usando uma técnica de PCR fluorescente-capilar Electroforese em Gel de genótipo CRISPR / cas9 mediada KO mutantes em um formato de elevado rendimento

The development of programmable genome-editing tools has facilitated the use of reverse genetics to understand the roles specific genomic sequences play ...

Genética

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide RNA (sgRNA) that confers specificity, the Cas9 protein cleaves both DNA strands at the targeted locus. The DNA break can trigger either non-homologous end joining (NHEJ) or homology directed repair (HDR). NHEJ can introduce small deletions or insertions which lead to frame-shift mutations, while HDR allows for larger and more precise perturbations. Here, we present protocols for generating knockout cell lines by coupling established CRISPR/Cas9 methods with two options for downstream selection/screening. The NHEJ approach uses a single sgRNA cut site and selection-independent screening, where protein production is assessed by dot immunoblot in a high-throughput manner. The HDR approach uses two sgRNA cut sites that span the gene of interest. Together with a provided HDR template, this method can achieve deletion of tens of kb, aided by the inserted selectable resistance marker. The appropriate applications and advantages of each method are discussed.

Recent advances in the ability to genetically manipulate somatic cell lines hold great potential for basic and applied research. Here, we present two approaches for CRISPR/Cas9 generated knockout production and screening in mammalian cell lines, with and without the use of selectable markers.

Geração independente dependente da seleção e de genes independentes de CRISPR / Cas9 em células de mamíferos

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

Investigation of Genetic Dependencies Using CRISPR-Cas9-based Competition Assays

Gene perturbation studies have been extensively used to investigate the role of individual genes in AML pathogenesis. For achieving complete gene disruption, many of these studies have made use of complex gene knockout models. While these studies with knockout mice offer an elegant and time-tested system for investigating genotype-to-phenotype relationships, a rapid and scalable method for assessing candidate genes that play a role in AML cell proliferation or survival in AML models will help accelerate the parallel interrogation of multiple candidate genes. Recent advances in genome-editing technologies have dramatically enhanced our ability to perform genetic perturbations at an unprecedented scale. One such system of genome editing is the CRISPR-Cas9-based method that can be used to make rapid and efficacious alterations in the target cell genome. The ease and scalability of CRISPR/Cas9-mediated gene-deletion makes it one of the most attractive techniques for the interrogation of a large number of genes in phenotypic assays. Here, we present a simple assay using CRISPR/Cas9 mediated gene-disruption combined with high-throughput flow-cytometry-based competition assays to investigate the role of genes that may play an important role in the proliferation or survival of human and murine AML cell lines.

This manuscript describes a Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR) CRISPR-Cas9-based method for simple and expeditious investigation of the role of multiple candidate genes in Acute Myeloid Leukemia (AML) cell proliferation in parallel. This technique is scalable and can be applied in other cancer cell lines as well.

Investigação de dependências genéticas utilizando ensaios de competição baseados em CRISPR-Cas9

Gene perturbation studies have been extensively used to investigate the role of individual genes in AML pathogenesis. For achieving complete gene ...

Pesquisa do câncer

Pooled CRISPR-Based Genetic Screens in Mammalian Cells

Genome editing using the CRISPR-Cas system has vastly advanced the ability to precisely edit the genomes of various organisms. In the context of mammalian cells, this technology represents a novel means to perform genome-wide genetic screens for functional genomics studies. Libraries of guide RNAs (sgRNA) targeting all open reading frames permit the facile generation of thousands of genetic perturbations in a single pool of cells that can be screened for specific phenotypes to implicate gene function and cellular processes in an unbiased and systematic way. CRISPR-Cas screens provide researchers with a simple, efficient, and inexpensive method to uncover the genetic blueprints for cellular phenotypes. Furthermore, differential analysis of screens performed in various cell lines and from different cancer types can identify genes that are contextually essential in tumor cells, revealing potential targets for specific anticancer therapies. Performing genome-wide screens in human cells can be daunting, as this involves the handling of tens of millions of cells and requires analysis of large sets of data. The details of these screens, such as cell line characterization, CRISPR library considerations, and understanding the limitations and capabilities of CRISPR technology during analysis, are often overlooked. Provided here is a detailed protocol for the successful performance of pooled genome-wide CRISPR-Cas9 based screens.

CRISPR-Cas9 technology provides an efficient method to precisely edit the mammalian genome in any cell type and represents a novel means to perform genome-wide genetic screens. A detailed protocol discussing the steps required for the successful performance of pooled genome-wide CRISPR-Cas9 screens is provided here.

Telas genéticas com base em CRISPR agrupadas em células de mamíferos

Genome editing using the CRISPR-Cas system has vastly advanced the ability to precisely edit the genomes of various organisms. In the context of mammalian ...

Cell Surface Receptor Identification Using Genome-Scale CRISPR/Cas9 Genetic Screens

Intercellular communication mediated by direct interactions between membrane-embedded cell surface receptors is crucial for the normal development and functioning of multicellular organisms. Detecting these interactions remains technically challenging, however. This manuscript describes a systematic genome-scale CRISPR/Cas9 knockout genetic screening approach that reveals cellular pathways required for specific cell surface recognition events. This assay utilizes recombinant proteins produced in a mammalian protein expression system as avid binding probes to identify interaction partners in a cell-based genetic screen. This method can be used to identify the genes necessary for cell surface interactions detected by recombinant binding probes corresponding to the ectodomains of membrane-embedded receptors. Importantly, given the genome-scale nature of this approach, it also has the advantage of not only identifying the direct receptor but also the cellular components that are required for the presentation of the receptor at the cell surface, thereby providing valuable insights into the biology of the receptor.

This manuscript describes a genome-scale cell-based screening approach to identify extracellular receptor-ligand interactions.

Identificação do receptor de superfície celular usando telas genéticas CRISPR/Cas9 em escala de genoma

Intercellular communication mediated by direct interactions between membrane-embedded cell surface receptors is crucial for the normal development and ...

Functional Assessment of BRCA1 variants using CRISPR-Mediated Base Editors

Recent studies have investigated the risks associated with BRCA1 gene mutations using various functional assessment methods such as fluorescent reporter assays, embryonic stem cell viability assays, and therapeutic drug-based sensitivity assays. Although they have clarified a lot of BRCA1 variants, these assays involving the use of exogenously expressed BRCA1 variants are associated with overexpression issues and cannot be applied to post-transcriptional regulation. To resolve these limitations, we previously reported a method for functional analysis of BRCA1 variants via CRISPR-mediated cytosine base editor that induce targeted nucleotide substitution in living cells. Using this method, we identified variants whose functions remain ambiguous, including c.-97C&#62;T, c.154C&#62;T, c.3847C&#62;T, c.5056C&#62;T, and c.4986+5G&#62;A, and confirmed that CRISPR-mediated base editors are useful tools for reclassifying the variants of uncertain significance in BRCA1. Here, we describe a protocol for functional analysis of BRCA1 variants using CRISPR-based cytosine base editor. This protocol provides guidelines for the selection of target sites, functional analysis and evaluation of BRCA1 variants.

Functional Assessment of BRCA1 variants using CRISPR-Mediated Base Editors

People with BRCA1 mutations have a higher risk of developing cancer, which warrants accurate evaluation of the function of BRCA1 variants. Herein, we described a protocol for functional assessment of BRCA1 variants using CRISPR-mediated cytosine base editors that enable targeted C:G to T:A conversion in living cells.

Avaliação funcional das variantes BRCA1 usando editores de base mediados pelo CRISPR

Recent studies have investigated the risks associated with BRCA1 gene mutations using various functional assessment methods such as fluorescent reporter ...

Profiling Ubiquitin and Ubiquitin-like Dependent Post-translational Modifications and Identification of Significant Alterations

Ubiquitin (ub) and ubiquitin-like (ubl) dependent post-translational modifications of proteins play fundamental biological regulatory roles within the cell by controlling protein stability, activity, interactions, and intracellular localization. They enable the cell to respond to signals and to adapt to changes in its environment. Alterations within these mechanisms can lead to severe pathological situations such as neurodegenerative diseases and cancers. The aim of the technique described here is to establish ub/ubls dependent PTMs profiles, rapidly and accurately, from cultured cell lines. The comparison of different profiles obtained from different conditions allows the identification of specific alterations, such as those induced by a treatment for example. Lentiviral mediated cell transduction is performed to create stable cell lines expressing a two-tags (6His and Flag) version of the modifier (ubiquitin or a ubl such as SUMO1 or Nedd8). These tags permit the purification of ubiquitin and therefore of ubiquitinated proteins from the cells. This is done through a two-step purification process: The first one is performed in denaturing conditions using the 6His tag, and the second one in native conditions using the Flag tag. This leads to a highly specific and pure isolation of modified proteins which are subsequently identified and semi-quantified by liquid chromatography followed by tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) technology. Easy informatics analysis of MS data using Excel software enables the establishment of PTM profiles by eliminating background signals. These profiles are compared between each condition in order to identify specific alterations which will then be studied more specifically, starting with their validation by standard biochemistry techniques.

This protocol aims at establishing ubiquitin (Ub) and ubiquitin-likes (Ubls) specific proteomes in order to identify alterations of these kind of post-translational modifications (PTMs), associated with a specific condition such as a treatment or a phenotype.

Perfil de Ubiquitin e Ubiquitin-like Modificações pós-translacionais dependentes e identificação de alterações significativas

Ubiquitin (ub) and ubiquitin-like (ubl) dependent post-translational modifications of proteins play fundamental biological regulatory roles within the ...

Bioquímica

Studying Proteolysis of Cyclin B at the Single Cell Level in Whole Cell Populations

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies during chromosome separation are a hallmark of malignancy and associated with progressive disease 2-4. The spindle assembly checkpoint (SAC) is a mitotic surveillance mechanism that holds back cells at metaphase until every single chromosome has established a stable bipolar attachment to the mitotic spindle1. The SAC exerts its function by interference with the activating APC/C subunit Cdc20 to block proteolysis of securin and cyclin B and thus chromosome separation and mitotic exit. Improper attachment of chromosomes prevents silencing of SAC signaling and causes continued inhibition of APC/CCdc20 until the problem is solved to avoid chromosome missegregation, aneuploidy and malignant growths1.
Most studies that addressed the influence of improper chromosomal attachment on APC/C-dependent proteolysis took advantage of spindle disruption using depolymerizing or microtubule-stabilizing drugs to interfere with chromosomal attachment to microtubules. Since interference with microtubule kinetics can affect the transport and localization of critical regulators, these procedures bear a risk of inducing artificial effects 5.
To study how the SAC interferes with APC/C-dependent proteolysis of cyclin B during mitosis in unperturbed cell populations, we established a histone H2-GFP-based system which allowed the simultaneous monitoring of metaphase alignment of mitotic chromosomes and proteolysis of cyclin B 6.
To depict proteolytic profiles, we generated a chimeric cyclin B reporter molecule with a C-terminal SNAP moiety 6 (Figure 1). In a self-labeling reaction, the SNAP-moiety is able to form covalent bonds with alkylguanine-carriers (SNAP substrate) 7,8 (Figure 1). SNAP substrate molecules are readily available and carry a broad spectrum of different fluorochromes. Chimeric cyclin B-SNAP molecules become labeled upon addition of the membrane-permeable SNAP substrate to the growth medium 7 (Figure 1). Following the labeling reaction, the cyclin B-SNAP fluorescence intensity drops in a pulse-chase reaction-like manner and fluorescence intensities reflect levels of cyclin B degradation 6 (Figure 1). Our system facilitates the monitoring of mitotic APC/C-dependent proteolysis in large numbers of cells (or several cell populations) in parallel. Thereby, the system may be a valuable tool to identify agents/small molecules that are able to interfere with proteolytic activity at the metaphase to anaphase transition. Moreover, as synthesis of cyclin B during mitosis has recently been suggested as an important mechanism in fostering a mitotic block in mice and humans by keeping cyclin B expression levels stable 9,10, this system enabled us to analyze cyclin B proteolysis as one element of a balanced equilibrium 6.

Metaphase to anaphase transition is triggered through anaphase-promoting complex (APC/C)-dependent ubiquitination and subsequent destruction of cyclin B. Here, we established a system which, following pulse-chase labeling, allows monitoring cyclin B proteolysis in entire cell populations and facilitates the detection of interference by the mitotic checkpoint.

Estudar proteólise de ciclina B no nível da célula individual em populações de células inteiras

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies ...

Biologia

Production of Human CRISPR-Engineered CAR-T Cells

Adoptive cell therapies using chimeric antigen receptor T cells (CAR-T cells) have demonstrated remarkable clinical efficacy in patients with hematological malignancies and are currently being investigated for various solid tumors. CAR-T cells are generated by removing T cells from a patient's blood and engineering them to express a synthetic immune receptor that redirects the T-cells to recognize and eliminate target tumor cells. Gene editing of CAR-T cells has the potential to improve safety of current CAR-T cell therapies and further increase the efficacy of CAR-T cells. Here, we describe methods for the activation, expansion, and characterization of human CRISPR-engineered CD19 directed CAR-T cells. This comprises transduction of the CAR lentiviral vector and use of single guide RNA (sgRNA) and Cas9 endonuclease to target genes of interest in T cells. The methods described in this protocol can be universally applied to other CAR constructs and target genes beyond the ones used for this study. Furthermore, this protocol discusses strategies for gRNA design, lead gRNA selection and target gene knockout validation to reproducibly achieve high-efficiency, multiplex CRISPR-Cas9 engineering of clinical grade human T cells.

Here, we present a protocol for gene editing in primary human T cells using CRISPR Cas Technology to modify CAR-T cells.

Produção de células CAR-T projetadas por CRISPR humanas

Adoptive cell therapies using chimeric antigen receptor T cells (CAR-T cells) have demonstrated remarkable clinical efficacy in patients with ...

Imunologia e Infecção

Electroporation-Based CRISPR-Cas9-Mediated Gene Knockout in THP-1 Cells and Single-Cell Clone Isolation

The human acute monocytic leukemia (AML) THP-1 cell line is widely used as a model to study the functions of human monocyte-derived macrophages, including their interplay with significant human pathogens such as the human immunodeficiency virus (HIV). Compared to other immortalized cell lines of myeloid origin, THP-1 cells retain many intact inflammatory signaling pathways and display phenotypic characteristics that more closely resemble those of primary monocytes, including the ability to differentiate into macrophages when treated with phorbol-12-myristate 13-acetate (PMA). The use of CRISPR-Cas9 technology to engineer THP-1 cells through targeted gene knockout (KO) provides a powerful approach to better characterize immune-related mechanisms, including virus-host interactions. This article describes a protocol for efficient CRISPR-Cas9-based engineering using electroporation to deliver pre-assembled Cas9:sgRNA ribonucleoproteins into the cell nucleus. Using multiple sgRNAs targeting the same locus at slightly different positions results in the deletion of large DNA fragments, thereby increasing editing efficiency, as assessed by the T7 endonuclease I assay. CRISPR-Cas9-mediated editing at the genetic level was validated by Sanger sequencing followed by Inference of CRISPR Edits (ICE) analysis. Protein depletion was confirmed by immunoblotting coupled with a functional assay. Using this protocol, up to 100% indels in the targeted locus and a decrease of over 95% in protein expression were achieved. The high editing efficiency makes it convenient to isolate single-cell clones by limiting dilution.

The THP-1 cell line is widely used as a model to investigate the functions of human monocytes/macrophages across various biology-related research areas. This article describes a protocol for efficient CRISPR-Cas9-based engineering and single-cell clone isolation, enabling the production of robust and reproducible phenotypic data.

Nocaute de gene mediado por CRISPR-Cas9 baseado em eletroporação em células THP-1 e isolamento de clone de célula única

The human acute monocytic leukemia (AML) THP-1 cell line is widely used as a model to study the functions of human monocyte-derived macrophages, including ...