A fixação dinâmica pode modificar ou introduzir qualquer corrente de membrana em um neurônio. Introduzimos e modificamos a bomba de potássio de sódio e a corrente de sódio persistente em um internaeuron cardíaco vivo de uma sanguessuga. O uso de uma lâmpada dinâmica permite um controle completo com uma tecla da dinâmica e amplitude de qualquer corrente introduzida em um neurônio em tempo real.
O desenvolvimento de sistemas interativos em tempo real, como o grampo dinâmico, sustenta todas as pesquisas do IMC. Todos os aspectos dos estudos celulares sobre a atividade elétrica de neurônios e redes podem potencialmente se beneficiar do uso de grampo dinâmico. Os principais desafios dessa técnica são desenvolver os modelos em tempo real no neurônio e calibrar os ajustes dinâmicos de cãibra no neurônio selecionado para estudo.
Para o isolamento do gânglio 7 de um fio nervoso de sanguessuga, encha um prato de dissecação de linha de resina preta com cerca de um centímetro de soro gelado suplementado com cloreto de sódio, cloreto de potássio, cloreto de cálcio, D-glicose e HEPES em água desionizada e fixar um lado dorsal de sanguessuga anestinada fria na câmara. Use um microscópio estéreo em uma ampliação de 20X com iluminação guia de luz oblíqua e uma tesoura de mola de cinco milímetros para fazer um corte longitudinal de pelo menos três centímetros de comprimento através da parede do corpo na terceira porção rostral do corpo. Use pinos para separar o tecido da parede do corpo para expor os órgãos internos e aspirar o sangue para ter uma visão melhor.
Isole um gânglio médio individual 7. Usando fórceps nítidos para ajudar a orientar o corte e segurar o seio, use a tesoura para abrir o seio em que o fio nervoso reside, tomando o cuidado de dividir o seio dorsalmente e ventrally. Mantendo o seio ligado a cada uma das duas raízes nervosas bilaterais que emergem do gânglio, corte os feixes de nervos rostral e caudal para remover o gânglio do corpo e corte as raízes laterais para onde emergem do seio.
Use fórceps antigos de número cinco para fixar as tiras sinusal e tecido solto com pinos de inseto Minutien encurtados do lado ventral para cima em placas de Petri claras revestidas de resina. Fixar os conectivos rostral e caudal o mais longe possível do gânglio e fixar as raízes com segurança. Aumente a ampliação do microscópio estéreo para 40X ou mais e ajuste a iluminação oblíqua de modo que os corpos das células neuronais possam ser facilmente observados no lado ventral do gânglio logo abaixo do perineúrio.
Usando micro tesoura, comece a cortar a baia peroneal solta entre as raízes de um lado do gânglio, continuando o corte lateralmente para o outro lado e certificando-se de manter a lâmina da tesoura superficial sem prejudicar os corpos celulares neuronais diretamente abaixo da baia. Faça um corte superficial semelhante caudally do corte lateral ao longo da linha média e use fórceps de número cinco fino para puxar um retalho lateral caudal de bainha longe do gânglio de cada vez para permitir que cada um seja extirpado. Quando ambos os retalhos tiverem sido removidos, ambos os internos do coração devem ser expostos.
Coloque o prato na configuração de gravação e superfuse a amostra com soro fisiológico a uma taxa de fluxo de cinco mililitros por minuto à temperatura ambiente. Para identificar os interneurônios na configuração de gravação, selecione uma ampliação de 50 a 100X com iluminação de campo escuro abaixo e localize um neurônio HN 7 do par bilateral por sua localização canônica na posição posteriolateral no gânglio médio do corpo 7. Em seguida, use um micro manipulador para posicionar um micro eletrodo afiado preenchido com dois acetato de potássio molar e 20 milmolars de cloreto de potássio micro eletrodo muito perto do corpo da célula alvo e use um eletroômetro neurofisiológico para observar continuamente o potencial registrado.
Defina esse potencial para zero milvolts e penetre o neurônio com o microeletrodo usando o manipulador para conduzir lentamente o eletrodo ao longo de seu longo eixo. Use uma função de zumbido de 100 milissegundos até que seja observada uma mudança negativa no potencial da membrana e uma atividade vigorosa de espinagem. Defina o eletrometro em pelo menos três quilohertz em modo de fixação de corrente descontínua para registrar simultaneamente o potencial da membrana enquanto passa a corrente para o neurônio.
Use um osciloscópio para monitorar a configuração do eletrodo e use um injetor de corrente constante para injetar uma corrente constante de menos 0,1 nanoampes por um a dois minutos para estabilizar a gravação. O neurônio HN 7 pode ser identificado por sua forma característica de pico e atividade de estouro fraca. Para condução dinâmica de grampos e implementação atual, abra um programa de software de grampo dinâmico personalizado construído para a placa de processamento de sinal digital.
E enquanto o modelo estiver em funcionamento, ajuste a corrente máxima da bomba para 0,1 a 0,2 nanoamps e aumente gradualmente a condução máxima da corrente de sódio persistente até que o estouro regular se segue. Sistematicamente co-variam essas correntes em incrementos de nanoampa de 0,1 para a saída máxima da corrente da bomba e um incremento de nanosiemens para a condutância máxima da corrente de sódio persistente e avaliar os efeitos desses aumentos na frequência de pico, intervalo entre rajadas, duração da explosão e período de estouro. Segure a condução máxima da corrente de sódio a um valor fixo específico e varre em um incremento de nanoampa sobre uma gama de correntes máximas de bomba para suportar a atividade de estouro regular antes de aumentar o valor fixo da condução de sódio por um nanosiemens e varrer uma segunda gama de correntes máximas de bomba.
Para cada par de parâmetros implementado, colete dados contendo pelo menos oito rajadas para que medidas médias confiáveis da frequência de pico, intervalo entre rajadas, duração da explosão e período de explosão possam ser feitas. Em seguida, colete dados de vários neurônios adicionais como apenas demonstrado para gerar um gráfico composto. Usando este modelo, a corrente da bomba externa oscila ao longo do ciclo de estouro como a concentração interna de sódio em torno de um nível de linha de base.
Esta corrente da bomba contribui para o término do estouro durante a fase de estouro. A hiperpolarização produzida pela corrente da bomba ativa a hiperpolarização ativada corrente interna durante o intervalo entre rajadas. O modelo de interneurônio cardíaco em tempo real indica que a corrente persistente de sódio em interneurônios cardíacos contribui para grande parte da entrada de sódio que afeta fortemente a concentração interna do sódio e, portanto, a corrente da bomba.
Como a corrente de sódio persistente está ativa em potenciais de membrana relativamente negativos, ela se opõe à corrente da bomba durante os intervalos de estouro e inter-rajadas. Como ilustrado, o estouro robusto é restaurado em interneurônios cardíacos tonicamente ativos pela co-adição de correntes persistentes de bomba de sódio e potássio de sódio com um grampo dinâmico. Resultados preliminares indicam uma forte interação complicada entre as duas correntes, que podem ser ainda mais exploradas usando o modelo.
Um experimento bem sucedido depende da boa desheathing do gânglio e condução cuidadosamente direcionada, penetrante e zumbido da microeletrídra. Aumentamos o grampo dinâmico implementando uma corrente de bomba dependente de sódio que é calculada estimando a concentração intracelular de um íon. Tais estimativas podem ser usadas para injetar qualquer corrente dependente de íons em um neurônio.
