Este trabalho foi apoiado pelo Instituto Nacional de Saúde de subvenção GM118085 e em parte pela Fundação Robert Welch (conceder F-1811 a R.M.H.).

1. Isolamento de mutantes supressores em cepas deficientes de motilidade
NOTA: Use este método como um amplo "catch-all" para identificar a natureza geral do defeito de motilidade.
<ol><li>Preparação de placas de ágar macio NOTA: O ágar macio, também chamado de ágar de motilidade ou natação, é um ágar de baixa porcentagem (~0,2-0,35% w/v), muito usado para avaliarquimiotaxis 31,32.<ol>
<li>Adicione 3 g de bacto-agar (0,3% w/v) e 20 g de LB a um frasco fundo redondo de 2 L. Adicione 1 L de ddH2O (água duplamente destilada) ao frasco e misture uniformemente a suspensão usando uma haste de mexida e placa de agitação magnética.</li>
		<li>Autoclave por 20 min a 121 °C.</li>
		<li>Deixe esfriar com agitação suave usando a haste/placa como acima. Quando a temperatura atingir aproximadamente 50 °C, despeje 25 mL em placas estéreis de Petri (100 mm x 15 mm), e permita que o ágar derretido coloque a tampa no lugar por pelo menos 1h, para uso dentro de 16 h.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparação cultural, inoculação e isolamento de mutantes supressores NOTA: E. coli inoculado no centro de mídia rica em nutrientes solidificada com ágar macio consome nutrientes localmente, criando um gradiente de nutrientes que eles seguem. À medida que se movem para fora, aparecem 'anéis' definidos(Figura 1A), que estão relacionados a quimioattractants específicos a que as bactérias respondem. Defeitos no sistema de quimiotaxis ou componentes estruturais do motor flagela podem comprometer o desempenho neste ensaio. Muitas vezes, mutantes com uma vantagem de motilidade surgem durante a exibição, e podem ser vistos emergindo de um único ou de vários pontos ao longo da periferia do anel, de onde eles 'flare' para fora(Figura 1C). Nota-se que a borda mais externa da frente de natação contrasta prontamente contra o ágar macio virgem não colonizado.<ol>
<li>Cresça culturas noturnas da variedade deficiente de motilidade desejada em 5 mL de Caldo de Lennox (LB; triptona de 10 g/L, extrato de levedura de 5 g/L e 5 g/L NaCl, Tabela de Materiais) a 30 °C com agitação horizontal (220 r.p.m.). No dia seguinte, subcultura (diluição de 1:100) em LB fresco, crescendo sob as mesmas condições para fase exponencial (OD600 de 0,6).</li>
		<li>Inocular 6 μL da cultura no centro de uma placa de ágar macio (1.1) usando uma pipeta, empurrando a ponta estéril carregada para dentro do ágar para expulsar suavemente o conteúdo. Transfira para 30 °C e incubar(Figura 1B),até que as "erupções" de motilidade sejam evidentes, emanando do ponto de inoculação ou da periferia dos anéis de motilidade, tipicamente em 24-36 h(Figura 1C). NOTA: Nos ensaios de motilidade, inocular uma cepa do tipo selvagem ao lado dos isolados mutantes para comparação. Esta cepa de tipo selvagem mostrará os anéis quimotacticos concêntricos característicos(Figura 1A) e encherá a placa dentro de 8-10 h.</li>
		<li>Use um laço de arame estéril para levantar as células da região 'flare' e listras para purificar colônias únicas em uma placa de ágar duro LB (LB preparado como acima, solidificado com 15 g/L bacto-ágar).</li>
		<li>Escolha colônias únicas da placa de raia usando um laço de arame estéril e re purifique, redimensionando-se para colônias únicas para garantir o isolamento de uma colônia "pura".</li>
	</ol></li>
	<li>Confirmação e caracterização de mutantes supressores
	<ol>
<li>Confirme que os mutantes isolados do supressor restauraram a motilidade. Prepare placas de ágar macio (1.1) e culturas para cepas de interesse (como em 1.2.1), incluindo o tipo selvagem e a tensão inicial "deficiente de motilidade" para comparação.</li>
		<li>Inocular as placas (como em 1.2.2) e incubar a 30 °C por 8-10 h.</li>
		<li>Regissuir o diâmetro do anel mais externo (borda do círculo) e compare para estabelecer qual dos isolados restaurou substancialmente a motilidade. NOTA: Recomenda-se que as placas sejam fotografadas durante todo o período de tempo do experimento. Para obter melhores resultados, use um dispositivo "balde de luz"30,onde uma câmera digital é montada acima de uma fonte de luz para melhor iluminação para medir o diâmetro da colônia de natação e distingui-lo do ágar não colonizado.</li>
		<li>O sujeito verificou isolados para WGS conforme necessário, permitindo uma "cobertura de sequência" suficiente para identificar positivamente as mutações que restauraram a função do tipo selvagem.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Quantificar o comportamento motor de flagela através da amarração celular
NOTA: Use este método quando o comportamento normal de queda de corrida (quimiotaxis) parece estar comprometido.
<ol><li>
Preparação cultural e flagela tesoura
	<ol>
<li>Prepare uma cultura de fase exponencial da tensão de interesse, conforme descrito na etapa 1.2.1.</li>
		<li>Pelota 10 mL de células por centrifugação a 2.000 x g por 3 minutos antes de reutilizar em 10 mL de tampão de motilidade esterilizado por filtro (MB; Tampão fosfato de potássio de 10 mM [0,0935 M K2HPO4, 0,0065 M KH2PO4, pH 7.0], 0,1 mM EDTA [pH 7.0], 10 mM NaCl, 75 mM KCl). NOTA: MB suporta motilidade, mas não suporta crescimento bacteriano</li>
		<li>Repita o passo 2.1.2 mais duas vezes antes de reutilizar a pelota final em 1 mL de MB.</li>
		<li>Transfira a suspensão da célula para uma seringa de 1 mL e conecte uma agulha 23G até o final. Monte um aparelho de seringa/agulha idêntico e conecte os dois juntos através de 6 polegadas de tubos de polietileno (diâmetro interno de 0,58 mm) firmemente em baia sobre cada ponta de agulha.</li>
		<li>Tesoura a flagela (eles são frágeis e quebram facilmente) passando suavemente a suspensão da célula para frente e para trás de uma seringa para a outra 50x, com 1 min pausas entre cada 10 passes.</li>
		<li>Centrifugar as células desarmadas a 2.000 x g por 3 min e resuspend em um volume final de 500 μL de MB.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparação de slides e amarração celular
	<ol>
<li>Prepare uma câmara de fixação celular empilhando uma tampa de 18 mm x 18 mm sobre um slide de microscópio de vidro de 3 polegadas x 1 polegada x 1 mm, separado por fita dupla face(Figura S1).</li>
		<li>Lave a câmara com solução de poli-lise de poli-lise de 0,01% (w/v) aplicando-se ao topo da câmara. Incline a borda inferior (a mancha de cobertura alinhada com o slide do microscópio) em um limpador de tarefas (papel de tecido) para ajudar a desenhar a solução através da câmara(Figura S1). Em seguida, incubar em temperatura ambiente por 10 minutos.</li>
		<li>Lave a câmara três vezes com 40 μL de MB usando como descrito na etapa 2.2.2</li>
		<li>Adicione 40 μL da suspensão da célula de corte (preparada acima) ao topo da câmara e incubar à temperatura ambiente por 10 minutos para permitir que as células se conectem ao deslizamento de tampas.</li>
		<li>Lave suavemente a câmara com 40 μL de MB como em 2.2.3 para remover células nãoectadas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Gravação e quantificação de rotação celular
	<ol>
<li>Transfira o slide do microscópio carregado com células amarradas para o estágio do microscópio.</li>
		<li>Utilizando microscopia de contraste de fase e um objetivo de 100x, escaneie a população em busca de células fixadas no lugar e gire em um único eixo, ou seja, rotações suaves em um ponto fixo em vez de apresentar em um ângulo onde a célula se move dentro e fora de foco(Vídeo 1).</li>
		<li>Use um microscópio comercial e uma câmera associada. Abra o software associado, garanta que as células de interesse estejam em foco e clique na aquisição de vídeo para gravar a rotação do celular por um minuto (a 10 quadros por segundo ou superior).</li>
		<li>A partir da reprodução de vídeo, quantifique o número de rotações completas por minuto e o número de vezes que a célula muda de direção (frequência de comutação). NOTA: As velocidades de rotação e a frequência de comutação podem ser muito rápidas para medir olho por olho, por isso é recomendado usar software de vídeo que ofereça reprodução lenta/fina, ou adote um sistema de software automatizado para quantificar padrões de rotação33. Uma alternativa seria aumentar a viscosidade do MB usando celulose de metila (ou agente similar) para ajudar a retardar e resolver a rotação de bactérias mais rápidas ou compensar quando câmeras com esquadragens baixas estão em uso.</li>
		<li>Repita o passo 2.3.2 com réplicas biológicas para compilar uma representação da população de interesse.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Preparação de enxames em um ensaio de travessia de fronteiras
NOTA: Use este método para avaliar o impacto de uma mutação ou condição na motilidade do grupo. Swarm-agar refere-se ao ágar onde a porcentagem é tipicamente maior do que a do ágar macio. Em ágar macio (0,3%), as células nadam individualmente dentro do ágar. No ágar enxame (0,5% ou mais), as células se movem como um grupo na superfície. Enquanto as placas de enxame devem ser usadas como detalhadas aqui, as placas de natação têm uma vida útil mais longa, e podem ser usadas por vários dias. Nossa preferência pessoal é usar em 1-2 dias.
<ol><li>
Preparação do enxame ágar
	<ol>
<li>Adicione 5 g de agar Eiken (0,5% c/v) e 20 g de LB a um frasco fundo redondo de 2 L. Adicione 1 L de ddH2O ao frasco e misture uniformemente a suspensão usando uma haste de mexida e placa de agitação magnética.</li>
		<li>Autoclave por 20 min a 121 °C.</li>
		<li>Deixe esfriar com agitação suave para evitar quaisquer bolhas de ar usando a haste/placa como acima. Quando aproximadamente 50 °C, adicione glicose esterilizada por filtro para uma concentração final de 0,5 %.</li>
		<li>Despeje 25 mL em placas de Petri estéreis (100 mm x 15 mm) e deixe fixar em temperatura ambiente por pelo menos 14 h e não mais do que 20 h. Não guarde para uso futuro.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Inoculação e incubação de placas de enxame
	<ol>
<li>Inocular 6 μL de uma cultura exponencial média (preparada como em 1,2) ao detectar em cima do ágar.</li>
		<li>Deixe a tampa desligada por 5-10 min e substitua quando o inóculo secar na superfície do ágar.</li>
		<li>Incubar a 30 °C por 8 h. Evite a tentação de inspecionar o progresso do enxame removendo a tampa, pois isso contribuirá para a secagem do ágar e prejudicará o enxame. NOTA: O tempo de incubação pode variar dependendo do fenótipo da cepa. Algumas mutações isoladas podem dificultar a capacidade de enxame e exigirão uma porcentagem reduzida de ágar ou um período mais prolongado de incubação.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Elaboração de placas de ensaio de travessia de fronteira NOTA: Este ensaio utiliza uma placa de Petri modificada, onde uma divisão de plástico (borda) cria duas câmaras, em vez de uma(Figura 2A). Cada câmara pode ser preparada independentemente da outra, oferecendo condições diferentes para enxame, antes de "conectar" as duas. Dependendo do design experimental, a primeira câmara (designada à esquerda) pode ser preparada com ágar nadador (0,3% c/v) ou ágar enxame (0,5% c/v) de onde as bactérias podem migrar através da fronteira para a câmara direita contendo ágar enxame +/- qualquer suplemento ou desafio necessário (por exemplo, antibióticos). A migração em ambos os ágars é tipicamente medida/comparada registrando o diâmetro mais amplo da colonização bacteriana (borda a borda) do ponto original da inoculação.<ol>
<li>Prepare o ágar de natação, conforme descrito em 1.1, se necessário.</li>
		<li>Prepare o ágar do enxame, como descrito em 3.1.</li>
		<li>Despeje ~30 mL de ágar enxame (com suplementação desejada, se necessário) na câmara direita de uma placa de Petri de compartimento duplo (100 mm x 15 mm), ao ponto em que está nivelado com o divisor de plástico entre as câmaras, mas não transbordando para a esquerda(Figura 2B).</li>
		<li>Depois que o ágar endurecer, encha a câmara esquerda com ~30 mL de natação ou ágar enxame, novamente ao ponto de contato com a divisão de plástico(Figura 2C). Antes de definir, use uma ponta de pipeta estéril para arrastar suavemente o ágar sobre a borda para conectar os dois lados com uma ponte de ágar de ~1 mm de altura que abrange toda a extensão da divisão(Figura 2D).</li>
		<li>Deixe a placa secar à temperatura ambiente (3.1). NOTA: Um método alternativo de criação de ponte é permitir que o ágar da câmara esquerda seque e, em seguida, lentamente pipeta ~100 μL de ágar enxame derretido ao longo do divisor de plástico para fazer a ponte das duas câmaras (3.4). Inocular as placas na câmara esquerda como detalhada acima para natação (1.2.2) ou enxame (3.2) ágar, antes de incubar a 30 °C por 12-16 h, ou até que enxames tenham feito progresso suficiente sobre a câmara direita para permitir comparações entre cepas de interesse.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

O isolamento e a caracterização das mutações supressoras contribuíram com sucesso para identificar componentes-chave do sistema de quimioterapia35,36,37, bem como da própria máquina motora38,39,40. Ao usar o Protocolo 1, é importante incluir múltiplas réplicas independentes para garantir o isolamento de um grande espectro de p...

As bactérias empregam muitos apêndices para movimentação e dispersão em seus nichos ecológicos1. A motilidade conduzida por Flagella é a mais rápida delas, promovendo a colonização de locais favoráveis em resposta aos sinais ambientais, contribuindo significativamente para a capacidade patogênica de algumas espécies2,3. Bactérias flageladas podem nadar individualmente em líquido a granel, ou enxame como um coletivo sobre uma superfície semissólida4. A flagela extracelular se prende e é conduzida por motores rotativos embutidos na membrana, que aproveitam a potência dos gradientes de íons para gerar torque que causa rotação1,2,4,5,6,7,8. Em E. coli, cujos motores funcionam em um torque constante9, a saída do motor pode ser categorizada em termos de velocidade rotacional e comutação do rotor entre as direções no sentido anti-horário (CCW) e sentido horário (CW). A rotação CCW promove a formação de um feixe de flagelar coerente que impulsiona a célula para a frente (corrida), enquanto um interruptor transitório na direção rotacional (CW) faz com que o feixe se desmonte parcial ou totalmente10, e a célula reoriente sua direção de natação (tombo). E. coli normalmente corre por um segundo e cai por um décimo de segundo. A frequência de comutação do rotor ou do "viés de queda" é controlada pelo sistema de sinalização de quimiotaxis, onde os quimoreceptores transmembrano detectam sinais químicos externos e transmitem-nos via fosfora ao motor flagelador para estender as corridas em resposta aos atrativos, ou suprimi-los em resposta a produtos químicos tóxicos11,12. A motilidade da natação é avaliada em 0,3% de ágar macio.
Durante o enxame, as bactérias navegam em uma superfície semissólida como um coletivo denso, onde pacotes de bactérias fluem em um movimento contínuo de redemoinho2,13,14,15. Os enxames de E. coli apresentam fisiologia quimioensory alterada (viés de queda mais baixo), maiores velocidades e maior tolerância a antimicrobianos sobre células que nadam em líquido a granel16,17. Os enxames variam em sua implantação de uma infinidade de estratégias que auxiliam o movimento, incluindo produção surfactante, hiperflagellação e alongamento celular2. O swarming oferece às bactérias uma vantagem competitiva nos ambientes ecológicos e clínicos18,19,20. Existem duas categorias de bactérias em enxame: enxames temperados, que só podem enxamear na mídia solidificada com 0,5-0,8% de ágar, e enxames robustos, que podem navegar através de concentrações de ágar mais altas21.
Existem uma variedade de ensaios para interrogar a motilidade da natação e sua regulamentação. Quando prejudicada por mutações ou condições ambientais, a própria motilidade oferece uma forte seleção para identificar mutações supressoras de ganho de função. Esses supressores podem ser revertentes genuínos da mutação original, ou pseudo-revertentes, onde uma segunda mutação restaura a funcionalidade. Tais mutantes podem ser identificados por sequenciamento de genomas inteiros (WGS). Uma alternativa à seleção de supressores imparcial é uma estratégia de mutagênese direcionada tendenciosa (por exemplo, mutagênese PCR). Essas metodologias muitas vezes lançam luz sobre a função ou regulação ambiental do aparelho de motilidade. Se o objetivo é estudar a função motora, então a restauração da motilidade do tipo selvagem medida em ágar macio pode não necessariamente indicar a restauração da saída do motor do tipo selvagem. O ensaio de amarração celular, no qual as células são anexadas a uma superfície de vidro por um único flagellum e a rotação do corpo celular é posteriormente monitorada, pode ser o ensaio inicial de escolha para avaliar o comportamento motor. Embora metodologias mais sofisticadas estejam agora disponíveis para monitorar as propriedades do motor, a configuração necessária da câmera de alta velocidade e a aplicação de pacotes de software para análise de movimento limitam seu uso generalizado22,23,24,25. O ensaio de amarração da célula requer apenas que a flagela seja amarrada, permitindo a fixação dos filamentos curtos a um slide de vidro, seguido de filmagem da rotação do corpo celular. Embora as velocidades motoras registradas sejam baixas neste ensaio devido à alta carga que o corpo celular exerce sobre o flagelo, este ensaio contribuiu, no entanto, para insights valiosos sobre as respostas chemotactic26,27,28,29, e continua sendo uma ferramenta investigativa válida como discutido abaixo.
A motilidade repleta representa um conjunto diferente de desafios para os pesquisadores. A seleção de supressores de ganho de função só funciona em enxames que produzem surfactantes abundantes e enxames prontamente13. Não-produtores surfactantes como o E. coli são exigentes com relação à escolha do ágar, composição da mídia e umidade do ambiente2,13,14,21. Uma vez estabelecidas as condições de enxame, o ensaio de travessia de fronteiras17 é uma metodologia útil para interrogar a capacidade de um enxame de navegar em novas/condições duras. Embora os protocolos apresentados abaixo se relacionem com E. coli,eles podem ser prontamente adaptados para aplicação em outras espécies.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bacto Dehydrated Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0140-15-4</td><td></td></tr><tr><td>EDTA Disodium Salt, Dihydrate</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-002-786</td><td></td></tr><tr><td>Eiken agar</td><td>Eiken Chemical Co. Japan</td><td>E-MJ00</td><td>Essential for E. coli swarming</td></tr><tr><td>Glucose D (+)</td><td>Fisher Scientific</td><td>410955000</td><td></td></tr><tr><td>LB (Lennox) Broth</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1427-500</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-lysine Solution (0.1%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride (KCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>18-605-496</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Phosphate monobasic (KH2PO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP362-500</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Phosphate dibasic (K2HPO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP363-500</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride (NaCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-500</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Materials and Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CellSense microscope imaging software (V. 1.6)</td><td>Olympus</td><td></td><td>Or equivalent software for microscope used</td></tr><tr><td>Electron Microscopy Sciences Scotch 666 Doube Sided Tape</td><td>Fisher</td><td>50-285-28</td><td></td></tr><tr><td>Frosted microscope slides 3x1x1mm</td><td>Fisher</td><td>12-550-343</td><td></td></tr><tr><td>Olympus BX53 microscope</td><td>Olympus</td><td>BX53</td><td>Any upright or inverted phase microscope can be used</td></tr><tr><td>Petri dishes (100 mm diameter)</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td>For soft-agar assays</td></tr><tr><td>Polyethylene Nebulizer Capillary Tubing (0.58mm x 99mm 3.0m)</td><td>Perkin Elmer</td><td>9908265</td><td></td></tr><tr><td>Round Petri Dish with 2 Compartments</td><td>VWR</td><td>89200-944</td><td>For border-crossing assays</td></tr><tr><td>Safety Hypodermic Needles (23G)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-826A</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Syringe - 1 mL</td><td>Fisher scientific</td><td>14-955-450</td><td></td></tr><tr><td>Task/Tissue wipes</td><td>Fisher scientific</td><td>06-666</td><td>Or equivalent single use tissue wipes</td></tr><tr><td>VWR micro cover-glass 18x18mm</td><td>VWR</td><td>48366205</td><td></td></tr><tr><td>XM10 camera</td><td>Olympus</td><td>XM10</td><td>Or equivalent microscope camera</td></tr></tbody></table>

investigating flagella-driven motility in escherichia coli by applying three established techniques in a series

A motilidade é crucial para a sobrevivência e o sucesso de muitas espécies bacterianas. Existem muitas metodologias para explorar a motilidade para entender caminhos de sinalização, para elucidar a função e montagem de partes flageladoras, e para examinar e entender padrões de movimento. Aqui demonstramos uma combinação de três dessas metodologias. A motilidade no ágar macio é a mais antiga, oferecendo uma forte seleção para isolar mutações supressoras de ganho de função em cepas prejudicadas pela motilidade, onde a motilidade é restaurada através de uma segunda mutação. A técnica de amarração celular, primeiramente empregada para demonstrar a natureza rotativa do motor flagelador, pode ser usada para avaliar o impacto dos efeitos de sinalização na velocidade do motor e sua capacidade de alternar a direção rotacional. O ensaio de "travessia de fronteiras" é mais recente, onde bactérias nadando podem ser preparadas para a transição para se mover coletivamente como um enxame. Em combinação, esses protocolos representam uma abordagem sistemática e poderosa para identificar componentes da maquinaria de motilidade, e para caracterizar seu papel em diferentes facetas da natação e do enxame. Eles podem ser facilmente adaptados para estudar motilidade em outras espécies bacterianas.

O isolamento de pseudo-revertentes em uma cepa de E. coli cuja motilidade é prejudicada por altos níveis da molécula de sinalização c-di-GMP, foi detalhado em trabalhos recentes do nosso laboratório34. Esta cepa (JP1442) abrigava duas mutações: ΔyhjH e ΔycgR. YhjH é o fosfodiesterase mais ativo que degrada c-di-GMP em E. coli. A ausência de YhjH leva a níveis elevados de c-di-GMP e inibição da motilidade. YcgR é um efeito c-di-GMP. Em complexo co...

Watch this Scientific Journal Video about Investigating Flagella-Driven Motility in Escherichia coli by Applying Three Established Techniques in a Series at JoVE.com

Investigating Flagella-Driven Motility in Escherichia coli by Applying Three Established Techniques in a Series

Muitas bactérias usam motilidade impulsionada por flagela para navegar em seu ambiente e colonizar ambientes favoráveis tanto individualmente quanto como coletivos. Demonstrado aqui é o uso de três métodos estabelecidos que exploram a motilidade como ferramenta de seleção para identificar componentes/caminhos que contribuem para a natação e a motilidade.

Investigando a Motilidade Impulsionada por Flagella em Escherichia coli aplicando três técnicas estabelecidas em uma série

Motility is crucial to the survival and success of many bacterial species. Many methodologies exist to exploit motility to understand signaling pathways, ...

investigating-flagella-driven-motility-escherichia-coli-applying

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

Investigating Flagella-Driven Motility in Escherichia coli by Applying Three Established Techniques in a Series

7.5K visualizações.  The University of Texas at Austin. Muitas bactérias usam motilidade impulsionada por flagela para navegar em seu ambiente e colonizar ambientes favoráveis tanto individualmente quanto como coletivos. Demonstrado aqui é o uso de três métodos estabelecidos que exploram a motilidade como ferramenta de seleção para identificar componentes/caminhos que contribuem para a natação e a motilidade.

Vídeo: Investigating Flagella-Driven Motility in Escherichia coli by Applying Three Established Techniques in a Series

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Full insight into the mechanisms of living cells can be achieved only by investigating the key processes that elicit and direct events at a cellular level. To date the shear complexity of biological systems has caused precise single-molecule experimentation to be far too demanding, instead focusing on studies of single systems using relatively crude bulk ensemble-average measurements. However, many important processes occur in the living cell at the level of just one or a few molecules; ensemble measurements generally mask the stochastic and heterogeneous nature of these events. Here, using advanced optical microscopy and analytical image analysis tools we demonstrate how to monitor proteins within a single living bacterial cell to a precision of single molecules and how we can observe dynamics within molecular complexes in functioning biological machines. The techniques are directly relevant physiologically. They are minimally-perturbative and non-invasive to the biological sample under study and are fully attuned for investigations in living material, features not readily available to other single-molecule approaches of biophysics. In addition, the biological specimens studied all produce fluorescently-tagged protein at levels which are almost identical to the unmodified cell strains ("genomic encoding"), as opposed to the more common but less ideal approach for generating significantly more protein than would occur naturally ('plasmid expression'). Thus, the actual biological samples which will be investigated are significantly closer to the natural organisms, and therefore the observations more relevant to real physiological processes.

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Here we demonstrate the protocols for performing single-molecule fluorescence microscopy on living bacterial cells to enable functional molecular complexes to be detected, tracked and quantified.

Visualizando Único complexos moleculares In Vivo Usando microscopia de fluorescência avançada

Full insight into the mechanisms of living cells can be achieved only by investigating the key processes that elicit and direct events at a cellular ...

Biologia

A Microfluidic Device for Quantifying Bacterial Chemotaxis in Stable Concentration Gradients

Chemotaxis allows bacteria to approach sources of attractant chemicals or to avoid sources of repellent chemicals. Bacteria constantly monitor the concentration of specific chemoeffectors by comparing the current concentration to the concentration detected a few seconds earlier. This comparison determines the net direction of movement. Although multiple, competing gradients often coexist in nature, conventional approaches for investigating bacterial chemotaxis are suboptimal for quantifying migration in response to concentration gradients of attractants and repellents. Here, we describe the development of a microfluidic chemotaxis model for presenting precise and stable concentration gradients of chemoeffectors to bacteria and quantitatively investigating their response to the applied gradient. The device is versatile in that concentration gradients of any desired absolute concentration and gradient strength can be easily generated by diffusive mixing. The device is demonstrated using the response of Escherichia coli RP437 to gradients of amino acids and nickel ions.

This protocol describes the development of a microfluidic device for investigating bacterial chemotaxis in stable concentration gradients of chemoeffectors.

Um dispositivo micro para Quantificar Quimiotaxia bacteriana em gradientes de concentração estável

Chemotaxis allows bacteria to approach sources of attractant chemicals or to avoid sources of repellent chemicals. Bacteria constantly monitor the ...

Quantifying Bacterial Surface Swarming Motility on Inducer Gradient Plates

Bacterial swarming motility is a common microbiological phenotype that bacterial communities use to migrate over semisolid surfaces. In investigations of induced swarming motility, specific concentration&#160;of an inducer may not be able to report events occurring within the optimal concentration range to elicit the desired responses from a species. Semisolid plates containing multiple concentrations are commonly used to investigate the response within an inducer concentration range. However, separate semisolid plates increase variations in medium viscosity and moisture content within each plate due to nonuniform solidification time.
This paper describes a one-step method to simultaneously test surface swarming motility on a single gradient plate, where the isometrically arranged test wells allow the simultaneous acquisition of multiconcentration responses. In the present work, the surface swarming of Escherichia coli K12 and Pseudomonas aeruginosa PAO1 were evaluated in response to a concentration gradient of inducers such as resveratrol and arabinose. Periodically, the swarm morphologies were imaged using an imaging system to capture the entire surface swarming process.
The quantitative measurement of the swarm morphologies was acquired using ImageJ software, providing analyzable information of the swarm area. This paper presents a simple gradient swarm plate method that provides qualitative and quantitative information about the inducers&#39; effects on surface swarming, which can be extended to study the effects of other inducers on a broader range of motile bacterial species.

Here, we describe the use of inducer gradient plates to evaluate bacterial swarming motility while simultaneously obtaining multiple concentration responses.

Quantificando a motilidade de enxame de superfície bacteriana em placas de gradiente indutor

Bacterial swarming motility is a common microbiological phenotype that bacterial communities use to migrate over semisolid surfaces. In investigations of ...

Bioquímica

Visualization of Twitching Motility and Characterization of the Role of the PilG in Xylella fastidiosa

Xylella fastidiosa is a Gram-negative non-flagellated bacterium that causes a number of economically important diseases of plants. The twitching motility provides X. fastidiosa a means for long-distance intra-plant movement and colonization, contributing toward pathogenicity in X. fastidiosa. The twitching motility of X. fastidiosa is operated by type IV pili. Type IV pili of Xylella fastidiosa are regulated by pilG, a chemotaxis regulator in Pil-Chp operon encoding proteins that are involved with signal transduction pathways. To elucidate the roles of pilG in the twitching motility of X. fastidiosa, a pilG-deficient mutant Xf&#916;pilG and its complementary strain Xf&#916;pilG-C containing native pilG were developed. A microfluidic chambers integrated with a time-lapse image recording system was used to observe twitching motility in Xf&#916;pilG, Xf&#916;pilG-C and its wild type strain. Using this recording system, it permits long-term spatial and temporal observations of aggregation, migration of individual cells and populations of bacteria via twitching motility. X. fastidiosa wild type and complementary Xf&#916;pilG-C strain showed typical twitching motility characteristics directly observed in the microfluidic flow chambers, whereas mutant Xf&#916;pliG exhibited the twitching deficient phenotype. This study demonstrates that pilG contributes to the twitching motility of X. fastidiosa. The microfluidic flow chamber is used as a means for observing twitching motility.

Visualization of Twitching Motility and Characterization of the Role of the PilG in Xylella fastidiosa

In this study, a nano-microfluidic flow chamber was employed to visualize and functionally characterize the twitching motility of Xylella fastidiosa, a bacterium that causes Pierce&#39;s disease in grapevine.

Visualização de Twitching motilidade e Caracterização do papel da<em&gt; PilG</em&gt; in<em&gt; Xylella fastidiosa</em

Xylella fastidiosa is a Gram-negative non-flagellated bacterium that causes a number of economically important diseases of plants. The twitching motility ...

Imunologia e Infecção

Single-Molecule Analysis of Sf9 Purified Superprocessive Kinesin-3 Family Motors

A complex cellular environment poses challenges for single-molecule motility analysis. However, advancement in imaging techniques have improved single-molecule studies and has gained immense popularity in detecting and understanding the dynamic behavior of fluorescent-tagged molecules. Here, we describe a detailed method for&#160;in vitro single-molecule studies of kinesin-3 family motors using Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy. Kinesin-3 is a large family that plays critical roles in cellular and physiological functions ranging from intracellular cargo transport to cell division to development. We have shown previously that constitutively active dimeric kinesin-3 motors exhibit fast and superprocessive motility with high microtubule affinity at the single-molecule level using cell lysates prepared by expressing motor in mammalian cells. Our lab studies kinesin-3 motors and their regulatory mechanisms using cellular, biochemical and biophysical approaches, and such studies demand purified proteins at a large scale. Expression and purification of these motors using mammalian cells would be expensive and time-consuming, whereas expression in a prokaryotic expression system resulted in significantly aggregated and&#160;inactive protein. To overcome the limitations posed by bacterial purification systems and mammalian cell lysate, we have established a robust Sf9-baculovirus expression system to express and purify these motors. The kinesin-3 motors are C-terminally tagged with 3-tandem fluorescent proteins (3xmCitirine or 3xmCit) that provide enhanced signals and decreased photobleaching. In vitro single-molecule and multi-motor gliding analysis of Sf9 purified proteins demonstrate that kinesin-3 motors are fast and superprocessive akin to our previous studies using mammalian cell lysates. Other applications using these assays include detailed knowledge of oligomer conditions of motors, specific binding partners paralleling biochemical studies, and their kinetic state.

This study details purification of KIF1A(1-393LZ), a member of kinesin-3 family, using Sf9-baculovirus expression system. In vitro single-molecule and multi-motor gliding analysis of these purified motors exhibited robust motility properties comparable to motors from mammalian cell lysate. Thus, Sf9-baculovirus system is amenable to express and purify motor protein of interest.

Análise de molécula única de motores da família Sf9 superprocessiva superprocessiva cinesina-3

A complex cellular environment poses challenges for single-molecule motility analysis. However, advancement in imaging techniques have improved ...

Continuous Measurement of Biological Noise in Escherichia Coli Using Time-lapse Microscopy

The protocol developed here offers a tool to enable computer tracking of Escherichia coli division and fluorescent levels over several hours. The process starts by screening for colonies that survive on minimal media, assuming that only Escherichia coli harboring the correct plasmid will be able to thrive in the specific conditions. Since the process of building large genetic circuits, requiring the assembly of many DNA parts, is challenging, circuit components are often distributed between multiple plasmids at different copy numbers requiring the use of several antibiotics. Mutations in the plasmid can destroy transcription of the antibiotic resistance genes and interject with resources management in the cell leading to necrosis. The selected colony is set on a glass-bottom Petri dish and a few focus planes are selected for microscopy tracking in both bright field and fluorescent domains. The protocol maintains the image focus for more than 12 hours under initial conditions that cannot be regulated, creating a few difficulties. For example, dead cells start to accumulate in the lenses' field of focus after a few hours of imaging, which causes toxins to buildup and the signal to blur and decay. Depletion of nutrients introduces new metabolic processes and hinder the desired response of the circuit. The experiment's temperature lowers the effectivity of inducers and antibiotics, which can further damage the reliability of the signal. The minimal media gel shrinks and dries, and as a result the optical focus changes over time. We developed this method to overcome these challenges in Escherichia coli, similar to previous works developing analogous methods for other micro-organisms. In addition, this method offers an algorithm to quantify the total stochastic noise in unaltered and altered cells, finding that the results are consistent with flow analyzer predictions as shown by a similar coefficient of variation (CV).

Continuous Measurement of Biological Noise in Escherichia Coli Using Time-lapse Microscopy

This work presents a microscopy method that allows live imaging of a single cell of Escherichia coli for analysis and quantification of the stochastic behavior of synthetic gene circuits.

Medição contínua do ruído biológico em Escherichia Coli Usando microscopia de lapso de tempo

The protocol developed here offers a tool to enable computer tracking of Escherichia coli division and fluorescent levels over several hours. The process ...

Bioengenharia

Generation of Null Mutants to Elucidate the Role of Bacterial Glycosyltransferases in Bacterial Motility

The study of glycosylation in prokaryotes is a rapidly growing area. Bacteria harbor different glycosylated structures on their surface whose glycans constitute a strain-specific barcode. The associated glycans show higher diversity in sugar composition and structure than those of eukaryotes and are important in bacterial-host recognition processes and interaction with the environment. In pathogenic bacteria, glycoproteins have been involved in different stages of the infectious process, and glycan modifications can interfere with specific functions of glycoproteins. However, despite the advances made in the understanding of glycan composition, structure, and biosynthesis pathways, understanding of the role of glycoproteins in pathogenicity or interaction with the environment remains very limited. Furthermore, in some bacteria, the enzymes required for protein glycosylation are shared with other polysaccharide biosynthetic pathways, such as lipopolysaccharide and capsule biosynthetic pathways. The functional importance of glycosylation has been elucidated in several bacteria through mutation of specific genes thought to be involved in the glycosylation process and the study of its impact on the expression of the target glycoprotein and the modifying glycan. Mesophilic Aeromonas have a single and O-glycosylated polar flagellum. Flagellar glycans show diversity in carbohydrate composition and chain length between Aeromonas strains. However, all strains analyzed to date show a pseudaminic acid derivative as the linking sugar that modifies serine or threonine residues. The pseudaminic acid derivative is required for polar flagella assembly, and its loss has an impact on adhesion, biofilm formation, and colonization. The protocol detailed in this article describes how the construction of null mutants can be used to understand the involvement of genes or genome regions containing putative glycosyltransferases in the biosynthesis of a flagellar glycan. This includes the potential to understand the function of the glycosyltransferases involved and the role of the glycan. This will be achieved by comparing the glycan deficient mutant to the wild-type strain.

Here, we describe the construction of null mutants of Aeromonas in specific glycosyltransferases or regions containing glycosyltransferases, the motility assays, and flagella purification performed to establish the involvement and function of their encoded enzymes in the biosynthesis of a glycan, as well as the role of this glycan in bacterial pathogenesis.

Geração de Mutantes Nulos para Elucidar o Papel das Glicosyltransferases Bacterianas na Motilidade Bacteriana

The study of glycosylation in prokaryotes is a rapidly growing area. Bacteria harbor different glycosylated structures on their surface whose glycans ...

Preparation, Imaging, and Quantification of Bacterial Surface Motility Assays

Bacterial surface motility, such as swarming, is commonly examined in the laboratory using plate assays that necessitate specific concentrations of agar and sometimes inclusion of specific nutrients in the growth medium. The preparation of such explicit media and surface growth conditions serves to provide the favorable conditions that allow not just bacterial growth but coordinated motility of bacteria over these surfaces within thin liquid films. Reproducibility of swarm plate and other surface motility plate assays can be a major challenge. Especially for more &#8220;temperate swarmers&#8221; that exhibit motility only within agar ranges of 0.4%-0.8% (wt/vol), minor changes in protocol or laboratory environment can greatly influence swarm assay results. &#8220;Wettability&#8221;, or water content at the liquid-solid-air interface of these plate assays, is often a key variable to be controlled. An additional challenge in assessing swarming is how to quantify observed differences between any two (or more) experiments. Here we detail a versatile two-phase protocol to prepare and image swarm assays. We include guidelines to circumvent the challenges commonly associated with swarm assay media preparation and quantification of data from these assays. We specifically demonstrate our method using bacteria that express fluorescent or bioluminescent genetic reporters like green fluorescent protein (GFP), luciferase (lux operon), or cellular stains to enable time-lapse optical imaging. We further demonstrate the ability of our method to track competing swarming species in the same experiment.

Swarming motility is influenced by physical and environmental factors. We describe a two-phase protocol and guidelines to circumvent the challenges commonly associated with swarm assay preparation and data collection. A macroscopic imaging technique is employed to obtain detailed information on swarm behavior that is not provided by current analysis techniques.

Preparação, Imaging, e quantificação de Motilidade Ensaios superfície da bactéria

Bacterial surface motility, such as swarming, is commonly examined in the laboratory using plate assays that necessitate specific concentrations of agar ...

Biophysical Characterization of Flagellar Motor Functions

The role of flagellar motors in bacterial motility and chemotaxis is well-understood. Recent discoveries suggest that flagellar motors are able to remodel in response to a variety of environmental stimuli and are among the triggers for surface colonization and infections. The precise mechanisms by which motors remodel and promote cellular adaptation likely depend on key motor attributes. The photomultiplier-based bead-tracking technique presented here enables accurate biophysical characterization of motor functions, including adaptations in motor speeds and switch-dynamics. This approach offers the advantage of real-time tracking and the ability to probe motor behavior over extended durations. The protocols discussed can be readily extended to study flagellar motors in a variety of bacterial species.

Recent findings suggest that bacterial flagellar motors sense a variety of environmental signals and remodel in response. The bead-assays discussed here are expected to help explain the role of remodeling in cellular adaptation to environmental stressors.

Caracterização biofísica das funções Flagellar motor

The role of flagellar motors in bacterial motility and chemotaxis is well-understood. Recent discoveries suggest that flagellar motors are able to remodel ...

Visualizing Bacterial Motility Based on a Color Reaction

Bacterial motility is crucial for bacterial pathogenicity, biofilm formation, and drug resistance. Bacterial motility is crucial for the invasion and/or dissemination of many pathogenic species. Therefore, it is important to detect bacterial motility. Bacterial growth conditions, such as oxygen, pH, and temperature, can affect bacterial growth and the expression of bacterial flagella. This can lead to reduced motility or even loss of motility, resulting in the inaccurate evaluation of bacterial motility. Based on the color reaction of 2,3,5-triphenyl tetrazolium chloride (TTC) by intracellular dehydrogenases of living bacteria, TTC was added to traditional semisolid agar for bacterial motility detection. The results showed that this TTC semisolid agar method for the detection of bacterial motility is simple, easy to operate, and does not involve large and expensive instruments. The results also showed that the highest motility was observed in semisolid medium prepared with 0.3% agar. Compared with the traditional semisolid medium, the results are easier to evaluate and more accurate.

Here, we present a protocol to detect bacterial motility based on a color reaction. Key advantages of this method are that it is easy to evaluate and more accurate, and does not require specialized equipment.

Visualizando a motilidade bacteriana com base em uma reação de cor

Bacterial motility is crucial for bacterial pathogenicity, biofilm formation, and drug resistance. Bacterial motility is crucial for the invasion and/or ...