이 작품은 건강 보조금 GM118085의 국가 학회에 의해 지원되었고 부분적으로 로버트 웰치 재단 (R.M.H.에 F-1811을 부여)에 의해 지원되었습니다.

1. 운동성 결핍 균주에서 억제제 돌연변이의 격리
참고: 이 방법을 광범위한 '캐치-올'로 사용하여 운동성 결함의 일반적인 특성을 식별합니다.
<ol><li>소프트 마고 플레이트 준비 참고: 연골 또는 수영 용으로도 불리는 소프트 에이저는 화학 요법31,32를분석하는 데 오랫동안 사용되었던 낮은 비율의 한천(~0.2-0.35%w/v)입니다.<ol>
<li>바토-한천 3g(0.3% w/v)과 LB 20g을 2L 라운드 하단 플라스크에 넣습니다. 플라스크에 ddH2O(이중 증류수) L 1L을 넣고 교반봉과 자기 교반 플레이트를 사용하여 서스펜션을 균일하게 혼합합니다.</li>
		<li>121 °C에서 20 분 동안 오토 클레이브.</li>
		<li>위와 같이 막대/접시를 사용하여 부드러운 교반으로 식힙니다. 온도가 약 50°C에 도달하면 멸균 페트리 접시(100mm x 15mm)에 25mL을 붓고, 16시간 이내에 사용하기 위해 용융 된 한천을 뚜껑으로 1 시간 이상 제자리에 놓아 두도록 하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>억제제 돌연변이의 문화 준비, 접종 및 격리 참고: 부드러운 천으로 고화된 영양이 풍부한 매체의 중심에 접종된 대장균은 현지에서 영양소를 섭취하여 영양소그라데이션을 생성합니다. 그들은 바깥쪽으로 이동함에 따라, 정의된 '반지'가 나타나며(그림1A)는박테리아가 반응하는 특정 화학 요법과 관련이 있습니다. 치셀라 모터의 화학 요법 시스템 또는 구조 성분의 결함은 이 분석에서 성능을 저하시킬 수 있습니다. 종종, 운동성 이점을 가진 돌연변이는 스크리닝 중에 발생하며, 링 주변을 따라 단일 또는 여러 지점에서 나오는 것을 볼 수 있으며, 어디에서 '플레어'아웃(그림1C). 하나는 수영 전면의 가장 바깥쪽 가장자리가 식민지화되지 않은 처녀 부드러운 한천과 쉽게 대조되는 것을 알 수 있습니다.<ol>
<li>레녹스 브로스(LB; 10g/L 트라이프톤, 5g/L 효모 추출물, 5g/L, 재료테이블)의5mL에서 원하는 운동성 결핍 균주의 하룻밤 배양을 수평 흔들림(220 r.p.m)으로 성장시다. 다음 날, 신선한 LB의 하위 배양(1:100 희석)은 기하급수적 단계(OD600/0.6)와 같은 조건에서 성장한다.</li>
		<li>배양물의 6 μL을 파이펫을 사용하여 부드러운 천판(1.1)의 중심으로 접종하여 적재된 멸균 팁을 한천으로 밀어 넣고 내용물들을 부드럽게 추방합니다. 30°C로 이송하고 인큐베이션(도1B)으로옮겨가며, 운동성 '플레어'가 분명해질 때까지, 전형적으로 24-36h(도1C)에서접종지점 또는 운동성 고리의 주변에서 발산된다. 참고: 운동성 애서에서, 비교를 위해 돌연변이 분리와 함께 야생 형 변형을 접종하십시오. 이 야생형 균주는 특징적인 동심형 화학고리(도1A)를나타내고 8-10h 이내에 플레이트를 채웁니다.</li>
		<li>멸균 와이어 루프를 사용하여 '플레어' 영역에서 세포를 들어 올리고 줄무늬를 사용하여 단일 콜로니를 LB 하드 한천 플레이트에 정화합니다(위와 같이 준비된 LB, 15 g/L bacto-agar로 고화).</li>
		<li>멸균 와이어 루프를 사용하여 줄무늬 플레이트에서 단일 콜로니를 선택하고 단일 콜로니를 줄이면 다시 정화하여 '순수한' 식민지 분리를 보장합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>억제제 돌연변이의 확인 및 특성화
	<ol>
<li>격리된 억제제 돌연변이가 운동성을 복원한지 확인합니다. 연한 천식판(1.1)과 관심있는 균주에 대한 문화(1.2.1)를 준비하여 야생형및 비교를 위한 시작 '운동성 결핍' 균주를 포함한다.</li>
		<li>플레이트(1.2.2에서와 같이)를 접종하고 8-10h에 대해 30°C에서 배양한다.</li>
		<li>가장 바깥쪽 링(원의 모서리)의 직경을 기록하고 어느 격리된 분리가 실질적으로 변성을 회복했는지 를 설정하는 것과 비교합니다. 참고: 실험 시간 과정 내내 플레이트를 촬영하는 것이 좋습니다. 최상의 결과를 얻으려면 디지털 카메라가 광원 위에 장착되어 수영 식민지의 직경을 측정하고 콜로니화되지 않은 천과 구별하는 "빛의 양동이"장치(30)를사용하십시오.</li>
		<li>피험자는 필요에 따라 WGS로 격리되어 야생 형 기능을 복원한 돌연변이를 긍정적으로 식별하기에 충분한 '서열 범위'를 허용합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>2. 셀 테더링을 통한 플래그텔라 모터 거동 정량화
참고: 정상적인 텀블 동작(화학 요법)이 손상된 것처럼 보이는 경우 이 메서드를 사용합니다.
<ol><li>
문화 준비 및 플래그젤라 전단
	<ol>
<li>1.2.1 단계에서 설명된 바와 같이 관심있는 변형의 기하급수적 위상 배양을 준비한다.</li>
		<li>10mL의 필터 멸균 운동완충(MB)에서 재중단하기 전에 3분 동안 2,000 x g에서 원심분리에 의한 세포의 펠릿 10mL; 10mM 칼륨 인산염 버퍼 [0.0935 M K2HPO4,0.0065 M KH2PO4,pH 7.0], 0.1 mM EDTA [pH 7.0], 10mM NaCl, 75mM KCl). 참고 : MB는 운동성을지원하지만 세균 성장을 지원하지 않습니다</li>
		<li>MB의 1mL에서 최종 펠릿을 다시 중단하기 전에 2.1.2 단계를 두 번 더 반복하십시오.</li>
		<li>셀 서스펜션을 1mL 주사기로 옮기고 23G 바늘을 끝까지 부착한다. 동일한 주사기/바늘 장치를 조립하고 각 바늘 끝에 단단히 피포링 된 6 인치 폴리에틸렌 튜브 (내경 0.58mm)를 통해 두 가지를 함께 부착하십시오.</li>
		<li>10번의 패스마다 1분 동안 일시 정지하여 셀 서스펜션을 한 주사기에서 다른 50x로 부드럽게 전달하여 플래그젤라(쉽게 깨지기 쉽고 쉽게 파손)를 전단합니다.</li>
		<li>3 분 동안 2,000 x g에서 전경 세포를 원심 분리하고 MB의 500 μL의 최종 부피로 다시 중단합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
슬라이드 준비 및 셀 테더링
	<ol>
<li>3인치 x 1인치 x 1mm 유리 현미경 슬라이드 위에 18mm x 18mm 커버슬립을 적층하여 양면테이프(도면 S1)로분리하여 셀 고정 챔버를 준비합니다.</li>
		<li>챔버의 상단에 적용하여 0.01 % (w / v) 폴리 리신 용액으로 챔버를 플러시하십시오. 바닥 가장자리(현미경 슬라이드로 커버슬립 플러시)를 작업 와이퍼(tissue paper)에 기울여챔버(도 S1)를통해 용액을 끌어들이는 데 도움을 줍니다. 그런 다음 실온에서 10 분 동안 배양하십시오.</li>
		<li>2.2.2 단계에 설명된 대로 MB의 40 μL로 챔버를 세 번 세척</li>
		<li>시어드 셀 서스펜션(위 준비)의 40μL을 챔버 상단에 넣고 실온에서 10분 동안 배양하여 세포가 커버슬립에 부착할 수 있도록 합니다.</li>
		<li>2.2.3에서와 같이 MB의 40 μL로 챔버를 부드럽게 플러시하여 부착되지 않은 세포를 제거합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
셀 회전 기록 및 정량화
	<ol>
<li>테더드 셀로 로드된 현미경 슬라이드를 현미경 단계로 옮는다.</li>
		<li>위상-대비 현미경 검사법과 100x 목표를 사용하여, 제자리에 고정된 셀의 인구를 스캔하고, 단일 축, 즉, 고정된 지점에서 매끄러운 회전을 하는 대신 초점이 안팎으로 이동하는 각도로 제시한다(비디오1).</li>
		<li>상업용 현미경 및 관련 카메라를 사용합니다. 관련 소프트웨어를 열고 관심 있는 셀이 포커스에 있는지 확인하고 비디오 수집을 클릭하여 1분 동안 셀 회전을 기록합니다(초당 10프레임 이상).</li>
		<li>비디오 재생에서 분당 전체 회전 수와 셀이 방향을 변경하는 횟수(스위칭 주파수)를 정량화합니다. 참고: 회전 속도 및 스위칭 주파수는 눈으로 측정하기에너무 빠를 수 있으므로 느리고 미세한 재생을 제공하는 비디오 소프트웨어를 사용하거나 회전패턴을정량화하기 위해 자동화된 소프트웨어 시스템을 채택하는 것이 좋습니다. 대안은 메틸 셀룰로오스 (또는 유사한 에이전트)를 사용하여 MB의 점도를 증가시켜 빠른 박테리아의 회전을 늦추고 해결하거나 프레임 레이트가 낮은 카메라가 사용중일 때 보상하는 것입니다.</li>
		<li>반복 단계 2.3.2 생물학적 복제와 관심의 인구의 표현을 컴파일합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 국경을 넘은 분석에서 떼 준비
참고: 돌연변이 또는 상태의 영향을 그룹 운동성에 평가하는 이 방법을 사용합니다. 군단-한천은 보통 연한 한천보다 비율이 높은 한천을 말합니다. 부드러운 한천(0.3%)에서 세포는 한천 내부에서 개별적으로 수영합니다. 무리 한천 (0.5% 이상)에서 세포는 표면에 그룹으로 이동합니다. 군단 플레이트는 여기에 상세한 대로 사용해야 하지만, 수영 플레이트는 유통 기한이 길어지며 며칠 동안 사용할 수 있습니다. 우리의 개인적인 취향은 1-2 일에 사용하는 것입니다.
<ol><li>
무리 의 천의 준비
	<ol>
<li>에이켄 한천 5g(0.5% w/v)과 LB 20g을 2L 라운드 하단 플라스크에 넣습니다. 플라스크에 ddH2O 1L을 넣고 교반봉과 자기 교반 플레이트를 사용하여 서스펜션을 균일하게 혼합합니다.</li>
		<li>121 °C에서 20 분 동안 오토 클레이브.</li>
		<li>위와 같이 막대/플레이트를 사용하여 기포를 피하기 위해 부드러운 교반으로 식힙니다. 약 50°C의 경우, 0.5%의 최종 농도를 위해 필터 멸균 포도당을 첨가한다.</li>
		<li>멸균 페트리 접시 (100mm x 15mm)에 25 mL을 붓고 적어도 14 시간 이상 20 시간 이하의 실온에서 설정할 수 있습니다. 나중에 사용할 수 있는 저장 하지 마십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
떼 판의 접종 및 배양
	<ol>
<li>중기 기하 급수 문화의 6 μL (1.2에서와 같이 준비)은 한천 위에 발견하여 접종합니다.</li>
		<li>뚜껑을 5-10분 간 방치하고 접종이 천 표면으로 건조되면 교체하십시오.</li>
		<li>8 시간 동안 30 °C에서 배양하십시오. 이것은 천의 건조에 기여하고 무리를 손상으로, 뚜껑을 제거하여 무리 진행을 검사하는 유혹을 피하십시오. 참고: 인큐베이션 시간은 변형 표현형에 따라 달라질 수 있습니다. 몇몇 고립된 돌연변이는 떼어내고 있는 능력을 방해할 수 있고 한천의 감소된 백분율 또는 잠복의 더 긴 기간을 요구할 것입니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
국경 횡단 분석 판의 준비 참고:이 분석은 플라스틱 분할(테두리)이하나(그림 2A)가아닌 두 개의 챔버를 생성하는 수정된 페트리 접시를 사용합니다. 각 챔버는 서로 독립적으로 준비할 수 있으며, 두 챔버를 '연결'하기 전에 서로 다른 조건을 제공합니다. 실험 설계에 따라, 제1 챔버(왼쪽 지정)는 박테리아가 국경을 넘어 강측으로 이동하여 포트 라고 +/- 필요한 보충제 또는 챌린지(예: 항생제)를 포함하는 오른쪽 챔버로 이동할 수 있는 수영 한천(0.3%w/v) 또는 군단 한천(0.5%w/v)으로 제조될 수 있습니다. 어느 한 천에 의이동은 일반적으로 접종의 원래 지점에서 세균 식민지 (가장자리에서 가장자리)의 가장 넓은 직경을 기록하여 측정 / 비교된다.<ol>
<li>필요한 경우 1.1에 설명된 대로 수영 한고를 준비하십시오.</li>
		<li>3.1에 설명된 대로 무리 한천을 준비한다.</li>
		<li>-30mL의 떼 한천(필요한 경우 원하는 보충제)을 이중 구획 페트리 접시(100mm x 15mm)의 오른쪽 챔버에 부어 챔버 사이의 플라스틱 분배기로 수평이 되지만 왼쪽으로 넘쳐나지는않습니다(그림 2B).</li>
		<li>한천이 경화된 후, 왼쪽 챔버를 ~30mL의 수영 또는 무리 한천으로 채우고, 플라스틱분할(도 2C)과의접촉 지점까지 다시 채우십시오. 설정하기 전에 멸균 파이펫 팁을 사용하여 원고를 테두리 위로 부드럽게 드래그하여 분할의 전체 길이에 걸쳐 있는 ~1mm 높이의 천교다리(도2D)와양면을 연결합니다.</li>
		<li>접시가 실온(3.1)에서 건조되도록 합니다. 참고: 다리를 만드는 다른 방법은 왼쪽 챔버 한가르가 건조한 다음 플라스틱 칸막이를 따라 용융 된 군단 천자의 100 μL을 천천히 피펫하여 두 챔버 (3.4)를 교개할 수 있도록 합니다. 수영 (1.2.2) 또는 군단 (3.2) 천에 대해 위에 상세한 바와 같이 왼쪽 챔버의 플레이트를 접종하고, 12-16 h에 대한 30 °C에서 배양하기 전에, 또는 무리가 관심있는 균주 사이의 비교를 허용하기 위해 오른쪽 챔버를 통해 충분한 진전을 이루었다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없습니다.

억제제 돌연변이의 격리 및 특성화는화학기관시스템(35,36,37)의주요 성분을 식별하는 데 성공적으로 기여했으며, 모터기계자체(38,39,40)를확인하였다. 프로토콜 1을 사용하는 동안, 운동성의 손실을 보상 할 수있는 가능한 돌연변이의 큰 스펙트럼의 격리를 ?...

박테리아는 그들의 생태 틈새 시장1에서운동과 분산을 위해 많은 부속물을 사용합니다. Flagella 구동 운동성은 이들 중 가장 빠르며, 환경 신호에 대응하여 유리한 로케일의 식민지화를 촉진하고, 일부 종의 병원성 능력에 크게 기여하고있다2,3. 표기 박테리아는 벌크 액체에서 개별적으로 수영할 수 있으며, 반고체 표면4를통해 집단으로 떼지어질 수 있다. 세포외 기색은 멤브레인에 내장된 회전 모터에 의해 구동되며, 이온 그라데이션의 힘을 이용하여 회전1,2,4,5,6,7,8을유발하는 토크를 생성한다. 모터가 일정한 토크9에서실행되는 대장균에서모터 출력은 시계 반대 방향(CCW)과 시계 방향(CW) 방향으로 회전 속도 및 회전기의 전환 측면에서 분류될 수 있습니다. CCW 회전은 셀을 앞으로 추진하는 일관된 플래그엘라 번들의 형성을 촉진(run), 회전 방향(CW)의 일시적인 스위치는 번들이 부분적으로 또는 완전히10을분해하고, 셀은 수영 방향(tumble)을 재조정하도록 합니다. 대장균은 일반적으로 1초 동안 실행되고 10분의 1초 동안 공중제비합니다. 로터 또는 '텀블 바이어스'의 스위칭 주파수는 화학물질 신호 시스템에 의해 제어되며, 여기서 막 이상 화학 수용체는 외부 화학 신호를 감지하고 인포릴레이를 통해 기광모터로 전송하여 유인제에 대한 응답으로 실행을 확장하거나, 독성화학물질(11,12)에대응하여 이를 억제한다. 수영 운동성은 0.3% 부드러운 화창으로 분석됩니다.
무리하는 동안 박테리아는 조밀한 집단으로 반고체 표면을 탐색하며, 박테리아 팩은 연속 소용돌이 동작2,13,14,15로흐를 수 있습니다. 대장균 떼는 화학감각 생리학(낮은 텀블 바이어스), 더 높은 속도, 대량 액체16,17에서수영하는 세포에 대한 항균제에 대한 높은 내성을 나타낸다. Swarmers는 계면 활성제 생산, 과대 깃발 및 세포 연신2를포함하여 운동을 돕는 과다한 전략의 배치에 따라 다릅니다. S워밍업은 생태학적 및임상 설정18,19,20모두에서 박테리아에게 경쟁 우위를 제공합니다. swarmbacteria의 두 가지 범주가 있다: 온대 swarms, 0.5-0.8% 한천으로 고화 된 미디어에만 떼수, 그리고 강력한 swarms, 높은 한천 농도 를 통해 탐색할 수 있는21.
다양한 소의가 수영 운동성과 그 규제를 심문하기 위해 존재합니다. 돌연변이 또는 환경 조건에 의해 손상될 때, 운동성 자체는 기능의 이득 억제기 돌연변이를 확인하기 위한 강한 선택을 제공합니다. 이러한 억제제는 두 번째 돌연변이가 기능을 복원하는 원래 돌연변이 또는 의사 복귀제의 정품 역구일 수 있다. 이러한 돌연변이는 전체 게놈 시퀀싱(WGS)에 의해 식별될 수 있다. 편견없는 억제제 선택에 대한 대안은 편향된 표적 돌연변이 발생 전략(예를 들어, PCR 돌연변이 발생)입니다. 이러한 방법론은 종종 운동성 장치의 기능 또는 환경 조절에 빛을 비추는다. 모터 기능을 연구하는 것이 목표라면, 부드러운 한천에서 측정된 야생형 운동성의 복원이 반드시 야생형 모터 출력의 복원을 나타내는 것은 아닐 수 있습니다. 세포 테더링 분석, 세포가 단일 깃발에 의해 유리 표면에 부착되고 세포 체체의 회전이 이후에 모니터링되는, 모터 거동을 평가하기위한 선택의 초기 분석이 될 수 있습니다. 이제 모터 특성을 모니터링할 수 있는 보다 정교한 방법론이 가능하지만 모션 분석을 위해 필요한 고속 카메라 설정 및 적용으로인해 22,23,24,25의광범위한 사용이 제한됩니다. 셀 테더링 분석법은 기색증을 분리하여 유리 슬라이드에 짧은 필라멘트의 부착을 허용한 다음 셀 바디의 회전을 비디오 녹화해야 합니다. 기록된 모터 속도는 셀 체가 깃음에 미치는 높은 부하 때문에 이 분석에서 낮지만, 그럼에도 불구하고 이 분석은 화학 반응26,27,28,29에대한 귀중한 통찰력에 기여했으며, 아래에서 설명한 바와 같이 유효한 조사 도구로 남아 있다.
모성도를 따뜻하게 하는 것은 연구자에게 다른 도전과제를 제기합니다. 기능의 이득 억제기의 선택은 풍부한 계면 활성제와 쉽게13을생산하는 swarms에서만 작동합니다. 대장균과 같은 계면활성제 비생산자는환경의한천, 미디어 구성 및 습도의 선택에 대하여 까다로운2,13,14,21. 번들 조건이 설정되면, 국경 횡단 분석17은 새로운 / 가혹한 조건을 탐색 하는 군단의 능력을 심문 하는 유용한 방법론. 아래에 제시된 프로토콜은 대장균과관련이 있지만 다른 종의 응용 프로그램에 쉽게 적응할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bacto Dehydrated Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0140-15-4</td><td></td></tr><tr><td>EDTA Disodium Salt, Dihydrate</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-002-786</td><td></td></tr><tr><td>Eiken agar</td><td>Eiken Chemical Co. Japan</td><td>E-MJ00</td><td>Essential for E. coli swarming</td></tr><tr><td>Glucose D (+)</td><td>Fisher Scientific</td><td>410955000</td><td></td></tr><tr><td>LB (Lennox) Broth</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1427-500</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-lysine Solution (0.1%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride (KCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>18-605-496</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Phosphate monobasic (KH2PO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP362-500</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Phosphate dibasic (K2HPO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP363-500</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride (NaCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-500</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Materials and Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CellSense microscope imaging software (V. 1.6)</td><td>Olympus</td><td></td><td>Or equivalent software for microscope used</td></tr><tr><td>Electron Microscopy Sciences Scotch 666 Doube Sided Tape</td><td>Fisher</td><td>50-285-28</td><td></td></tr><tr><td>Frosted microscope slides 3x1x1mm</td><td>Fisher</td><td>12-550-343</td><td></td></tr><tr><td>Olympus BX53 microscope</td><td>Olympus</td><td>BX53</td><td>Any upright or inverted phase microscope can be used</td></tr><tr><td>Petri dishes (100 mm diameter)</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td>For soft-agar assays</td></tr><tr><td>Polyethylene Nebulizer Capillary Tubing (0.58mm x 99mm 3.0m)</td><td>Perkin Elmer</td><td>9908265</td><td></td></tr><tr><td>Round Petri Dish with 2 Compartments</td><td>VWR</td><td>89200-944</td><td>For border-crossing assays</td></tr><tr><td>Safety Hypodermic Needles (23G)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-826A</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Syringe - 1 mL</td><td>Fisher scientific</td><td>14-955-450</td><td></td></tr><tr><td>Task/Tissue wipes</td><td>Fisher scientific</td><td>06-666</td><td>Or equivalent single use tissue wipes</td></tr><tr><td>VWR micro cover-glass 18x18mm</td><td>VWR</td><td>48366205</td><td></td></tr><tr><td>XM10 camera</td><td>Olympus</td><td>XM10</td><td>Or equivalent microscope camera</td></tr></tbody></table>

investigating flagella-driven motility in escherichia coli by applying three established techniques in a series

운동성은 많은 세균 종의 생존과 성공에 매우 중요합니다. 많은 방법론이 확산경로를 이해하고, 기조부품의 기능과 어셈블리를 해명하고, 움직임패턴을 조사하고 이해하기 위해 모틸성을 악용하기 위해 존재한다. 여기서 우리는 이러한 방법론의 세 가지 의 조합을 보여줍니다. 연한 한천의 운동성은 가장 오래된 것으로, 운동성 장애균의 기능 형 억제제 돌연변이를 격리하기 위한 강력한 선택을 제공하며, 여기서 운동성 조절은 두 번째 돌연변이를 통해 회복됩니다. 기체 모터의 회전 특성을 입증하기 위해 처음 채택된 셀 테더링 기술은 신호 이펙터가 모터 속도에 미치는 영향과 회전 방향을 전환하는 능력을 평가하는 데 사용할 수 있습니다. "국경 횡단"분석은 수영 박테리아가 무리로 집합적으로 이동으로 전환 할 준비가 될 수있는 최신입니다. 이 프로토콜은 함께 운동성 기계의 구성 요소를 식별하고 수영과 무리의 다양한 면에서 자신의 역할을 특성화하는 체계적이고 강력한 접근 방식을 나타냅니다. 그(것)들은 그밖 세균성 종에 있는 운동성을 공부하기 위하여 쉽게 적응될 수 있습니다.

그 운동성 신호 분자 c-di-GMP의 높은 수준에 의해 손상되는 대장균 긴장에서 의사 복귀제의 격리는, 우리의 실험실에서 최근 작업에서 상세히 되었다34. 이 균주(JP1442)는 ΔyhjH 및 ΔycgR의두 가지 돌연변이를 수용하였다. YhjH는 대장균에서c-di-GMP를 저하시키는 가장 활동적인 인포디세타이소입니다. YhjH의 부재는 상승 된 c-di-GMP 수준과 운동성의 억제로 이어...

Watch this Scientific Journal Video about Investigating Flagella-Driven Motility in Escherichia coli by Applying Three Established Techniques in a Series at JoVE.com

Investigating Flagella-Driven Motility in Escherichia coli by Applying Three Established Techniques in a Series

많은 박테리아는 자신의 환경을 탐색하고 개별적으로 및 집단으로 모두 유리한 환경을 식민지화하기 위해 플래그텔라 구동 운동성을 사용합니다. 여기에 수영과 모성에 기여하는 구성 요소 / 경로를 식별하기 위해 선택 도구로 운동성을 활용하는 세 가지 확립 된 방법의 사용이 입증된다.

에슈리치아 대장균에서 모토렐라 구동 운동성 조사

Motility is crucial to the survival and success of many bacterial species. Many methodologies exist to exploit motility to understand signaling pathways, ...

investigating-flagella-driven-motility-escherichia-coli-applying

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

Investigating Flagella-Driven Motility in Escherichia coli by Applying Three Established Techniques in a Series

7.5K 조회수.  The University of Texas at Austin. 많은 박테리아는 자신의 환경을 탐색하고 개별적으로 및 집단으로 모두 유리한 환경을 식민지화하기 위해 플래그텔라 구동 운동성을 사용합니다. 여기에 수영과 모성에 기여하는 구성 요소 / 경로를 식별하기 위해 선택 도구로 운동성을 활용하는 세 가지 확립 된 방법의 사용이 입증된다.

비디오: Investigating Flagella-Driven Motility in Escherichia coli by Applying Three Established Techniques in a Series

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Full insight into the mechanisms of living cells can be achieved only by investigating the key processes that elicit and direct events at a cellular level. To date the shear complexity of biological systems has caused precise single-molecule experimentation to be far too demanding, instead focusing on studies of single systems using relatively crude bulk ensemble-average measurements. However, many important processes occur in the living cell at the level of just one or a few molecules; ensemble measurements generally mask the stochastic and heterogeneous nature of these events. Here, using advanced optical microscopy and analytical image analysis tools we demonstrate how to monitor proteins within a single living bacterial cell to a precision of single molecules and how we can observe dynamics within molecular complexes in functioning biological machines. The techniques are directly relevant physiologically. They are minimally-perturbative and non-invasive to the biological sample under study and are fully attuned for investigations in living material, features not readily available to other single-molecule approaches of biophysics. In addition, the biological specimens studied all produce fluorescently-tagged protein at levels which are almost identical to the unmodified cell strains ("genomic encoding"), as opposed to the more common but less ideal approach for generating significantly more protein than would occur naturally ('plasmid expression'). Thus, the actual biological samples which will be investigated are significantly closer to the natural organisms, and therefore the observations more relevant to real physiological processes.

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Here we demonstrate the protocols for performing single-molecule fluorescence microscopy on living bacterial cells to enable functional molecular complexes to be detected, tracked and quantified.

단일 분자 단지를 떠올리 VIVO에서 고급 형광 현미경을 사용하여

Full insight into the mechanisms of living cells can be achieved only by investigating the key processes that elicit and direct events at a cellular ...

연구

생물학

A Microfluidic Device for Quantifying Bacterial Chemotaxis in Stable Concentration Gradients

Chemotaxis allows bacteria to approach sources of attractant chemicals or to avoid sources of repellent chemicals. Bacteria constantly monitor the concentration of specific chemoeffectors by comparing the current concentration to the concentration detected a few seconds earlier. This comparison determines the net direction of movement. Although multiple, competing gradients often coexist in nature, conventional approaches for investigating bacterial chemotaxis are suboptimal for quantifying migration in response to concentration gradients of attractants and repellents. Here, we describe the development of a microfluidic chemotaxis model for presenting precise and stable concentration gradients of chemoeffectors to bacteria and quantitatively investigating their response to the applied gradient. The device is versatile in that concentration gradients of any desired absolute concentration and gradient strength can be easily generated by diffusive mixing. The device is demonstrated using the response of Escherichia coli RP437 to gradients of amino acids and nickel ions.

This protocol describes the development of a microfluidic device for investigating bacterial chemotaxis in stable concentration gradients of chemoeffectors.

안정적인 농도 기울기에 박테리아 Chemotaxis을 Quantifying위한 Microfluidic 장치

Chemotaxis allows bacteria to approach sources of attractant chemicals or to avoid sources of repellent chemicals. Bacteria constantly monitor the ...

Quantifying Bacterial Surface Swarming Motility on Inducer Gradient Plates

Bacterial swarming motility is a common microbiological phenotype that bacterial communities use to migrate over semisolid surfaces. In investigations of induced swarming motility, specific concentration&#160;of an inducer may not be able to report events occurring within the optimal concentration range to elicit the desired responses from a species. Semisolid plates containing multiple concentrations are commonly used to investigate the response within an inducer concentration range. However, separate semisolid plates increase variations in medium viscosity and moisture content within each plate due to nonuniform solidification time.
This paper describes a one-step method to simultaneously test surface swarming motility on a single gradient plate, where the isometrically arranged test wells allow the simultaneous acquisition of multiconcentration responses. In the present work, the surface swarming of Escherichia coli K12 and Pseudomonas aeruginosa PAO1 were evaluated in response to a concentration gradient of inducers such as resveratrol and arabinose. Periodically, the swarm morphologies were imaged using an imaging system to capture the entire surface swarming process.
The quantitative measurement of the swarm morphologies was acquired using ImageJ software, providing analyzable information of the swarm area. This paper presents a simple gradient swarm plate method that provides qualitative and quantitative information about the inducers&#39; effects on surface swarming, which can be extended to study the effects of other inducers on a broader range of motile bacterial species.

Here, we describe the use of inducer gradient plates to evaluate bacterial swarming motility while simultaneously obtaining multiple concentration responses.

유도기 그라디언트 플레이트의 박테리아 표면 떼 운동성 정량화

Bacterial swarming motility is a common microbiological phenotype that bacterial communities use to migrate over semisolid surfaces. In investigations of ...

생화학

Visualization of Twitching Motility and Characterization of the Role of the PilG in Xylella fastidiosa

Xylella fastidiosa is a Gram-negative non-flagellated bacterium that causes a number of economically important diseases of plants. The twitching motility provides X. fastidiosa a means for long-distance intra-plant movement and colonization, contributing toward pathogenicity in X. fastidiosa. The twitching motility of X. fastidiosa is operated by type IV pili. Type IV pili of Xylella fastidiosa are regulated by pilG, a chemotaxis regulator in Pil-Chp operon encoding proteins that are involved with signal transduction pathways. To elucidate the roles of pilG in the twitching motility of X. fastidiosa, a pilG-deficient mutant Xf&#916;pilG and its complementary strain Xf&#916;pilG-C containing native pilG were developed. A microfluidic chambers integrated with a time-lapse image recording system was used to observe twitching motility in Xf&#916;pilG, Xf&#916;pilG-C and its wild type strain. Using this recording system, it permits long-term spatial and temporal observations of aggregation, migration of individual cells and populations of bacteria via twitching motility. X. fastidiosa wild type and complementary Xf&#916;pilG-C strain showed typical twitching motility characteristics directly observed in the microfluidic flow chambers, whereas mutant Xf&#916;pliG exhibited the twitching deficient phenotype. This study demonstrates that pilG contributes to the twitching motility of X. fastidiosa. The microfluidic flow chamber is used as a means for observing twitching motility.

Visualization of Twitching Motility and Characterization of the Role of the PilG in Xylella fastidiosa

In this study, a nano-microfluidic flow chamber was employed to visualize and functionally characterize the twitching motility of Xylella fastidiosa, a bacterium that causes Pierce&#39;s disease in grapevine.

의 역할의 꿈틀 운동성의 시각화 및 특성<em&gt; PilG</em&gt;에서<em&gt; Xylella의 fastidiosa</em

Xylella fastidiosa is a Gram-negative non-flagellated bacterium that causes a number of economically important diseases of plants. The twitching motility ...

면역학 및 감염병학

Single-Molecule Analysis of Sf9 Purified Superprocessive Kinesin-3 Family Motors

A complex cellular environment poses challenges for single-molecule motility analysis. However, advancement in imaging techniques have improved single-molecule studies and has gained immense popularity in detecting and understanding the dynamic behavior of fluorescent-tagged molecules. Here, we describe a detailed method for&#160;in vitro single-molecule studies of kinesin-3 family motors using Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy. Kinesin-3 is a large family that plays critical roles in cellular and physiological functions ranging from intracellular cargo transport to cell division to development. We have shown previously that constitutively active dimeric kinesin-3 motors exhibit fast and superprocessive motility with high microtubule affinity at the single-molecule level using cell lysates prepared by expressing motor in mammalian cells. Our lab studies kinesin-3 motors and their regulatory mechanisms using cellular, biochemical and biophysical approaches, and such studies demand purified proteins at a large scale. Expression and purification of these motors using mammalian cells would be expensive and time-consuming, whereas expression in a prokaryotic expression system resulted in significantly aggregated and&#160;inactive protein. To overcome the limitations posed by bacterial purification systems and mammalian cell lysate, we have established a robust Sf9-baculovirus expression system to express and purify these motors. The kinesin-3 motors are C-terminally tagged with 3-tandem fluorescent proteins (3xmCitirine or 3xmCit) that provide enhanced signals and decreased photobleaching. In vitro single-molecule and multi-motor gliding analysis of Sf9 purified proteins demonstrate that kinesin-3 motors are fast and superprocessive akin to our previous studies using mammalian cell lysates. Other applications using these assays include detailed knowledge of oligomer conditions of motors, specific binding partners paralleling biochemical studies, and their kinetic state.

This study details purification of KIF1A(1-393LZ), a member of kinesin-3 family, using Sf9-baculovirus expression system. In vitro single-molecule and multi-motor gliding analysis of these purified motors exhibited robust motility properties comparable to motors from mammalian cell lysate. Thus, Sf9-baculovirus system is amenable to express and purify motor protein of interest.

Sf9 정제 초공정 키네신-3 제품군 모터의 단일 분자 분석

A complex cellular environment poses challenges for single-molecule motility analysis. However, advancement in imaging techniques have improved ...

Continuous Measurement of Biological Noise in Escherichia Coli Using Time-lapse Microscopy

The protocol developed here offers a tool to enable computer tracking of Escherichia coli division and fluorescent levels over several hours. The process starts by screening for colonies that survive on minimal media, assuming that only Escherichia coli harboring the correct plasmid will be able to thrive in the specific conditions. Since the process of building large genetic circuits, requiring the assembly of many DNA parts, is challenging, circuit components are often distributed between multiple plasmids at different copy numbers requiring the use of several antibiotics. Mutations in the plasmid can destroy transcription of the antibiotic resistance genes and interject with resources management in the cell leading to necrosis. The selected colony is set on a glass-bottom Petri dish and a few focus planes are selected for microscopy tracking in both bright field and fluorescent domains. The protocol maintains the image focus for more than 12 hours under initial conditions that cannot be regulated, creating a few difficulties. For example, dead cells start to accumulate in the lenses' field of focus after a few hours of imaging, which causes toxins to buildup and the signal to blur and decay. Depletion of nutrients introduces new metabolic processes and hinder the desired response of the circuit. The experiment's temperature lowers the effectivity of inducers and antibiotics, which can further damage the reliability of the signal. The minimal media gel shrinks and dries, and as a result the optical focus changes over time. We developed this method to overcome these challenges in Escherichia coli, similar to previous works developing analogous methods for other micro-organisms. In addition, this method offers an algorithm to quantify the total stochastic noise in unaltered and altered cells, finding that the results are consistent with flow analyzer predictions as shown by a similar coefficient of variation (CV).

Continuous Measurement of Biological Noise in Escherichia Coli Using Time-lapse Microscopy

This work presents a microscopy method that allows live imaging of a single cell of Escherichia coli for analysis and quantification of the stochastic behavior of synthetic gene circuits.

시간 경과 현미경 검사를 사용하여 대장균에서 생물학적 소음의 지속적인 측정

The protocol developed here offers a tool to enable computer tracking of Escherichia coli division and fluorescent levels over several hours. The process ...

생체공학

Generation of Null Mutants to Elucidate the Role of Bacterial Glycosyltransferases in Bacterial Motility

The study of glycosylation in prokaryotes is a rapidly growing area. Bacteria harbor different glycosylated structures on their surface whose glycans constitute a strain-specific barcode. The associated glycans show higher diversity in sugar composition and structure than those of eukaryotes and are important in bacterial-host recognition processes and interaction with the environment. In pathogenic bacteria, glycoproteins have been involved in different stages of the infectious process, and glycan modifications can interfere with specific functions of glycoproteins. However, despite the advances made in the understanding of glycan composition, structure, and biosynthesis pathways, understanding of the role of glycoproteins in pathogenicity or interaction with the environment remains very limited. Furthermore, in some bacteria, the enzymes required for protein glycosylation are shared with other polysaccharide biosynthetic pathways, such as lipopolysaccharide and capsule biosynthetic pathways. The functional importance of glycosylation has been elucidated in several bacteria through mutation of specific genes thought to be involved in the glycosylation process and the study of its impact on the expression of the target glycoprotein and the modifying glycan. Mesophilic Aeromonas have a single and O-glycosylated polar flagellum. Flagellar glycans show diversity in carbohydrate composition and chain length between Aeromonas strains. However, all strains analyzed to date show a pseudaminic acid derivative as the linking sugar that modifies serine or threonine residues. The pseudaminic acid derivative is required for polar flagella assembly, and its loss has an impact on adhesion, biofilm formation, and colonization. The protocol detailed in this article describes how the construction of null mutants can be used to understand the involvement of genes or genome regions containing putative glycosyltransferases in the biosynthesis of a flagellar glycan. This includes the potential to understand the function of the glycosyltransferases involved and the role of the glycan. This will be achieved by comparing the glycan deficient mutant to the wild-type strain.

Here, we describe the construction of null mutants of Aeromonas in specific glycosyltransferases or regions containing glycosyltransferases, the motility assays, and flagella purification performed to establish the involvement and function of their encoded enzymes in the biosynthesis of a glycan, as well as the role of this glycan in bacterial pathogenesis.

박테리아 운동성에서 박테리아 글리코실트랜스퍼라제의 역할을 밝히기 위한 Null 돌연변이체의 생성

The study of glycosylation in prokaryotes is a rapidly growing area. Bacteria harbor different glycosylated structures on their surface whose glycans ...

Preparation, Imaging, and Quantification of Bacterial Surface Motility Assays

Bacterial surface motility, such as swarming, is commonly examined in the laboratory using plate assays that necessitate specific concentrations of agar and sometimes inclusion of specific nutrients in the growth medium. The preparation of such explicit media and surface growth conditions serves to provide the favorable conditions that allow not just bacterial growth but coordinated motility of bacteria over these surfaces within thin liquid films. Reproducibility of swarm plate and other surface motility plate assays can be a major challenge. Especially for more &#8220;temperate swarmers&#8221; that exhibit motility only within agar ranges of 0.4%-0.8% (wt/vol), minor changes in protocol or laboratory environment can greatly influence swarm assay results. &#8220;Wettability&#8221;, or water content at the liquid-solid-air interface of these plate assays, is often a key variable to be controlled. An additional challenge in assessing swarming is how to quantify observed differences between any two (or more) experiments. Here we detail a versatile two-phase protocol to prepare and image swarm assays. We include guidelines to circumvent the challenges commonly associated with swarm assay media preparation and quantification of data from these assays. We specifically demonstrate our method using bacteria that express fluorescent or bioluminescent genetic reporters like green fluorescent protein (GFP), luciferase (lux operon), or cellular stains to enable time-lapse optical imaging. We further demonstrate the ability of our method to track competing swarming species in the same experiment.

Swarming motility is influenced by physical and environmental factors. We describe a two-phase protocol and guidelines to circumvent the challenges commonly associated with swarm assay preparation and data collection. A macroscopic imaging technique is employed to obtain detailed information on swarm behavior that is not provided by current analysis techniques.

세균 표면 운동성 분석의 준비, 이미징 및 정량화

Bacterial surface motility, such as swarming, is commonly examined in the laboratory using plate assays that necessitate specific concentrations of agar ...

Biophysical Characterization of Flagellar Motor Functions

The role of flagellar motors in bacterial motility and chemotaxis is well-understood. Recent discoveries suggest that flagellar motors are able to remodel in response to a variety of environmental stimuli and are among the triggers for surface colonization and infections. The precise mechanisms by which motors remodel and promote cellular adaptation likely depend on key motor attributes. The photomultiplier-based bead-tracking technique presented here enables accurate biophysical characterization of motor functions, including adaptations in motor speeds and switch-dynamics. This approach offers the advantage of real-time tracking and the ability to probe motor behavior over extended durations. The protocols discussed can be readily extended to study flagellar motors in a variety of bacterial species.

Recent findings suggest that bacterial flagellar motors sense a variety of environmental signals and remodel in response. The bead-assays discussed here are expected to help explain the role of remodeling in cellular adaptation to environmental stressors.

편모 모터 기능의 생물 물리학 적 특성

The role of flagellar motors in bacterial motility and chemotaxis is well-understood. Recent discoveries suggest that flagellar motors are able to remodel ...

Visualizing Bacterial Motility Based on a Color Reaction

Bacterial motility is crucial for bacterial pathogenicity, biofilm formation, and drug resistance. Bacterial motility is crucial for the invasion and/or dissemination of many pathogenic species. Therefore, it is important to detect bacterial motility. Bacterial growth conditions, such as oxygen, pH, and temperature, can affect bacterial growth and the expression of bacterial flagella. This can lead to reduced motility or even loss of motility, resulting in the inaccurate evaluation of bacterial motility. Based on the color reaction of 2,3,5-triphenyl tetrazolium chloride (TTC) by intracellular dehydrogenases of living bacteria, TTC was added to traditional semisolid agar for bacterial motility detection. The results showed that this TTC semisolid agar method for the detection of bacterial motility is simple, easy to operate, and does not involve large and expensive instruments. The results also showed that the highest motility was observed in semisolid medium prepared with 0.3% agar. Compared with the traditional semisolid medium, the results are easier to evaluate and more accurate.

Here, we present a protocol to detect bacterial motility based on a color reaction. Key advantages of this method are that it is easy to evaluate and more accurate, and does not require specialized equipment.

색상 반응을 기반으로 한 박테리아 운동성 시각화

Bacterial motility is crucial for bacterial pathogenicity, biofilm formation, and drug resistance. Bacterial motility is crucial for the invasion and/or ...