Agradecemos ao Centro de Genética de Caenorhabditis, financiado pelo Nih National Center for Research Resources (NCRR), por algumas das cepas de nematoides. Anticorpos monoclonais desenvolvidos por H.F. Epstein foram obtidos do Banco hybridoma de estudos de desenvolvimento desenvolvido sob os auspícios do NICHD e mantido pelo Departamento de Biologia da Universidade de Iowa. Esta pesquisa foi apoiada por uma bolsa da Fundação de Ciência de Israel (bolsa nº 278/18) e por uma bolsa do Ministério da Ciência & Tecnologia de Israel, e do Ministério das Relações Exteriores e Cooperação Internacional, Direção Geral de Promoção de Países, República Italiana (bolsa nº 3-14337). Agradecemos aos membros do laboratório Ben-Zvi pela ajuda na preparação deste manuscrito.

1. Preparação de placas de mídia de crescimento de nematoide para RNAi
<ol><li>A uma garrafa de 1 L, adicione 3 g de NaCl, 2,5 g de Bacto-Peptone, 17 g de ágar e água destilada até 1 L e autoclave.</li>
	<li>Frie a 55 °C.</li>
	<li>Adicione 25 mL de 1 M KH2PO4, pH 6.0, 1 mL de 1 M CaCl2, 1 mL de 1 M MgSO4e 1 mL de solução decolesterol (Tabela 1) para fazer mídia de crescimento nematode (NGM).</li>
	<li>Adicione 1 mL de ampicilina (100 mg/mL) e 0,5 mL de 1 M IPTG(Tabela 1) para fazer a solução NGM-RNAi. NOTA: As bactérias HT115(DE3) E. coli comumente utilizadas contêm uma polimerase de DNA T7 indutível pelo IPTG usada para expressar os plasmídeos codificadores de dsRNA. Estes plasmídeos também codificam para resistência à ampicilina.</li>
	<li>Misture a solução quente girando a garrafa.</li>
	<li>No capô ou usando procedimentos estéreis, despeje a solução NGM em placas ou usando uma bomba peristáltica, dispense a solução em placas. Use placas de 6 poços, 12, 40 mm ou 60 mm para esta tela. O ágar deve encher cerca de 2/3 da profundidade da placa.</li>
	<li>Deixe as placas secarem durante a noite no banco em temperatura ambiente, mantendo as placas cobertas. As placas de NGM para RNAi podem ser armazenadas a 4 °C por até um mês.</li>
</ol>2. Cultivar bactérias RNAi e semear as placas
<ol><li>No capô ou utilizando procedimentos estéreis, adicione 1 mL de ampicillina (100 mg/mL) e 2,5 mL de tetraciclina (5 mg/mL)(Tabela 1) a uma solução e mistura pré-autoclaved 1 L de LB. NOTA: As bactérias HT115(DE3) E. coli são resistentes à tetraciclina.</li>
	<li>No capô ou usando procedimentos estéreis, adicione 600 μL de solução LB a cada poço em placas estéreis de 2 mL de profundidade. É melhor usar um pipet multicanal para dispensar a mídia.</li>
	<li>Usando procedimentos estéreis, inoculam poços com bactérias HT115(DE3) E. coli transformadas com um plasmídeo codificador de dsRNA visando um gene de interesse ou um plasmídeo vazio, como controle. Cubra as placas e incubar a 37 °C durante a noite. Bibliotecas que consistem em clones bacterianos expressando dsRNA, correspondendo a ~94% dos genes C. elegans previstos foram previamente construídos22,23 e estão comercialmente disponíveis. A biblioteca de acompanhantes utilizada aqui foi construída pelo Laboratório Dr. Richard Morimoto26.</li>
	<li>Utilizando procedimentos estéreis, sementes 75, 150 ou 250 μL de bactérias nas placas de 12 poços, 40 mm e 6-well ou 60 mm NGM RNAi, respectivamente. Marque claramente o nome do gene alvo na placa. As bactérias devem cobrir 30-50% da superfície do ágar e não devem tocar nas bordas da placa.</li>
	<li>Deixe as placas secarem por pelo menos 2 dias no banco à temperatura ambiente, mantendo as placas cobertas. NOTA: As placas podem ser incubadas a 37 °C durante a noite. Certifique-se de que os poços internos estão secos antes de usar ou armazenar as placas. Para todos os fins de longo prazo (ou seja, secagem ou armazenamento) mantenha as placas no escuro. As placas secas e semeadas podem ser armazenadas a 4 °C por até um mês.</li>
</ol>3. Sincronização não estressante de embriões
<ol><li>Use uma picareta de vermes para mover cerca de 100 ovos de uma placa de vermes não sincronizada para uma placa de NGM recém-semeada.</li>
	<li>Cultivar animais por 5 dias a 15 °C, 3,5 dias a 20 °C ou 2,5 dias a 25 °C. Os animais devem chegar ao primeiro dia de colocação de ovos. NOTA: Os vermes são comumente cultivados a 20 °C. No entanto, diferentes cepas mutantes de acompanhantes podem exigir temperaturas específicas de cultivo. Por exemplo, muitas cepas sensíveis à temperatura são cultivadas a 15 °C, mas deslocadas para 25 °C para expor seu fenótipo.</li>
	<li>Adicione 1 mL de tampão M9(Tabela 1)lentamente e longe do gramado bacteriano. Gire a placa para que o tampão cubra completamente a placa. Em seguida, incline-o para um lado e remova o líquido da placa e lave os animais da placa. NOTA: Ao usar animais sensíveis à temperatura ou a acompanhante de mutantes, é melhor manter os tampões usados no protocolo na temperatura de cultivo dos animais.</li>
	<li>Repita o passo 3.3 três vezes ou até que todos os animais sejam lavados fora da placa.</li>
	<li>Usando uma ponta de plástico padrão, corte um quadrado de ágar da placa lavada onde os ovos estão concentrados e coloque o pedaço de ágar em uma placa de NGM recém-semeada. NOTA: ~200 ovos são necessários para produzir animais suficientes que pomentem ovos; muitos animais consomem as bactérias muito rapidamente. Baixos níveis de alimentos podem impactar a proteostase27.</li>
	<li>Cultive os animais por 5 dias a 15 °C, 3,5 dias a 20 °C ou 2,5 dias a 25 °C. Neste ponto, as placas devem ser cobertas com ovos sincronizados. NOTA: Os animais podem ser deslocados para uma nova placa por uma curta duração para uma sincronização mais rigorosa. No entanto, é importante usar apenas adultos nos estágios iniciais da colocação de ovos, pois os animais podem reter ovos em seu útero impactando a sincronização.</li>
	<li>Adicione 1 mL de tampão M9 lentamente e longe do gramado bacteriano.</li>
	<li>Gire a placa para que o tampão cubra completamente a placa. Em seguida, incline-o para um lado e remova o líquido da placa e lave os animais da placa.</li>
	<li>Repita o passo 3,7 três vezes ou até que todos os animais sejam lavados fora da placa.</li>
	<li>Adicione 1 mL de tampão M9 e use um raspador de células para liberar os ovos da placa.</li>
	<li>Colete o tampão M9 contendo os ovos das placas.</li>
	<li>Centrifugar o tampão M9 contendo os ovos a 3.000 x g por 2 min.</li>
	<li>Remova o supernatante e adicione o tampão M9 para atingir um volume de 1 mL.</li>
	<li>Resuspenda os ovos para interromper quaisquer pedaços de ovos e bactérias.</li>
	<li>Repita o procedimento de lavagem descrito nas etapas 3.11-3.13 cinco vezes. A pelota de ovo deve parecer branca. Se ainda estiver amarelo/marrom, repita a lavagem até que uma pelota branca seja atingida. NOTA: Bactérias que permanecem nos ovos podem contaminar as bactérias que expressam dsRNA.</li>
	<li>Remova a maior parte do supernatante, deixando cerca de 200 μL. Ovos sincronizados podem ser usados para telas RNAi.</li>
</ol>4. Ensaios fenotípicos comuns
<ol><li>Cultivo de animais durante experimentos<ol>
<li>Coloque uma gota de ~30 ovos perto do gramado bacteriano em cada prato semeado rnai. Para referência, coloque também ~30 ovos em placas semeadas com bactérias contendo vetores vazios (L4440).</li>
		<li>Cultivar animais sincronizados com a idade em placas semeadas por NGM RNAi. A duração do experimento dependerá do estágio em que os animais devem ser monitorados e da temperatura do cultivo. Ajuste a temperatura do cultivo ao usar animais mutantes sensíveis à temperatura. Ajuste a duração do cultivo ao usar animais mutantes atrasados em desenvolvimento. NOTA: Embora o tempo possa variar, uma vez que os animais atingem a idade adulta, a colocação de ovos (e o consequente consumo rápido de alimentos), bem como o colapso da proteose dependente da idade28,podem impactar os resultados. Recomenda-se, portanto, pontuar animais antes do início da colocação de ovos (dia 1 da idade adulta). Animais do tipo selvagem chegam a esta fase após 4,5 dias a 15 °C, 3 dias a 20 °C ou 2 dias a 25 °C.</li>
		<li>O número de repetições utilizadas dependerá do tamanho do conjunto genético examinado. Para a biblioteca de acompanhantes (97 genes), repita experimentos pelo menos quatro vezes. O tamanho da população depende do ensaio utilizado. Nos ensaios comportamentais aqui discutidos, escore >15 animais por condição experimental em cada repetição. Os dados e análises estatísticas também dependem fortemente do tipo de ensaio utilizado. Os dados nos ensaios aqui discutidos podem ser apresentados como meios ± SEM.</li>
		<li>Compare os animais tratados com controle de vetores RNAi e vazios como populações independentes. Os valores P podem ser calculados utilizando-se ANOVA unidirecional ou bidirecional, dependendo das alterações examinadas, ou seja, agravando ou aliviando sozinho ou ambos. Ao examinar um único tratamento RNAi versus controle, os valores P podem ser calculados usando um teste de soma de classificação mann-whitney de uma forma ou de duas vias. Além da significância estatística, considere um limiar para acertos com base no grau de impacto no fenótipo.</li>
	</ol></li>
	<li>Prisão/atraso do desenvolvimento<ol>
<li>Cultivar animais sincronizados pela idade como na etapa 4.1 até que os animais cultivados em bactérias de controle contendo vetores vazios cheguem à idade adulta, mas antes do início da colocação dos ovos.</li>
		<li>Monitore animais usando um estereótipo e conte o número de larvas e adultos para pontuar a porcentagem de animais atrasados no desenvolvimento. Para referência, compare-se aos animais mutantes cultivados em bactérias de controle contendo vetores vazios. hsp-1 ou hsp-90 RNAi tratamento resulta em detenção de desenvolvimento de animais do tipo selvagem e pode ser usado como um controle positivo.</li>
		<li>Para pontuar o percentual de animais atrasados ao longo do tempo, repita a etapa 4.2.2. NOTA: Se houver adultos que poem ovos na placa, transfira os animais atrasados em desenvolvimento para uma nova placa NGM-RNAi rotulada para o mesmo gene alvo para evitar confusão com prole.</li>
	</ol></li>
	<li>Defeitos de esterilidade ou de colocação de ovos<ol>
<li>Cultivar animais sincronizados com a idade como na etapa 4.1 até que animais cultivados em bactérias vazias de controle de vetores comecem a colocar ovos.</li>
		<li>Monitore os animais usando um estereómico e marque a porcentagem de animais sem ovos visíveis em seu útero. Para referência, compare-se aos animais mutantes cultivados em bactérias vazias de controle de vetores.</li>
		<li>Alternativamente, monitore os animais usando um estereómico e marque a porcentagem de animais com útero cheio de ovos, definido como fenótipo defeituoso de EGg (Egl-d)29.</li>
	</ol></li>
	<li>Letalidade embrionária<ol>
<li>Cultivar animais sincronizados com a idade como na etapa 4.1 até que os animais comecem a colocar ovos.</li>
		<li>Transfira ~100 ovos para um prato vazio. Espalhe os ovos em fileiras para simplificar a contagem.</li>
		<li>Marque a porcentagem de ovos não esquecidos na placa após 24-48 horas. Para referência, compare-se aos ovos de animais tratados com bactérias vazias de controle de vetores.</li>
	</ol></li>
	<li>Ensaio de paralisia<ol>
<li>Para adultos do primeiro dia, cultivar animais sincronizados com a idade como na etapa 4.1 até que os animais cultivados em bactérias vazias de controle de vetores cheguem à idade adulta, mas antes do início da colocação dos ovos.</li>
		<li>Desenhe uma linha na parte de trás de uma placa de ágar NGM regular usando um marcador fino.</li>
		<li>Coloque 5-10 animais na linha marcada.</li>
		<li>Estabeleça um temporizador e espere por 10 minutos.</li>
		<li>Marque a porcentagem de animais que permanecem na linha como vermes paralisados. Para referência, compare-se aos animais mutantes cultivados em bactérias vazias de controle de vetores. Animais do tipo selvagem tratados com unc-45 RNAi apresentam fenótipo de paralisia grave e podem ser usados como controle positivo. NOTA: Este ensaio destaca animais com paralisia média a grave. Esses animais geralmente ficam retos na placa, em vez de apresentar a forma curva comum. Além disso, um remendo limpo de bactérias é visível ao redor das cabeças de vermes paralisados.</li>
	</ol></li>
	<li>Ensaio de espancamento<ol>
<li>Cultivar animais sincronizados pela idade como na etapa 4.1 até que os animais cultivados em bactérias vazias de controle de vetores cheguem à idade adulta, mas antes do início da colocação de ovos.</li>
		<li>Pipet 100 μL de tampão M9 na temperatura de cultivo dos animais em uma placa de 96 poços.</li>
		<li>Coloque ~15 worms, um por poço, nos poços contendo tampão M9.</li>
		<li>Deixe os animais se ajustarem por 5 minutos.</li>
		<li>Examine cada animal sob o estereótipo, inicie um temporizador contando 15 s, e conte o número de curvas corporais que cada animal realiza nesse período de tempo. Os valores contados podem ser normalizados para dobras corporais por minuto. Para referência, compare-se aos animais mutantes cultivados em bactérias vazias de controle de vetores. NOTA: Este ensaio de motilidade é muito sensível e pode detectar diferenças muito leves entre os tratamentos. No entanto, a motilidade em líquido e motilidade no ágar pode diferir.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Validação do knockdown de proteínas
<ol><li>Coloque 250-300 ovos sincronizados em uma placa NGM-RNAi de 60 mm semeada com as bactérias relevantes que expressam dsRNA ou esvaziam as bactérias contendo vetores (L4440). NOTA: O knockdown rnai pode resultar em acúmulo aberrante de embriões, na falta de embriões ou em prisão de desenvolvimento que poderia impactar a expressão genética. Isso deve ser considerado ao determinar a idade dos animais a serem examinados.</li>
	<li>Para o dia 1 adultos, cultivar animais por 4,5 dias a 15 °C, 3 dias a 20 °C ou 2 dias a 25 °C.</li>
	<li>Escolha e transfira um total de 200 animais adultos jovens para a tampa de um tubo de 1,5 mL com 200 μL de PBS-T. NOTA: Ao usar animais sensíveis à temperatura ou a acompanhante de mutantes, é melhor manter os tampões usados no protocolo na temperatura de cultivo dos animais.</li>
	<li>Feche a tampa cuidadosamente e centrífuga a 1.000 x g por 1 min.</li>
	<li>Adicione 800 μL de PBS-T (Tabela 1) e centrífuga a 1.000 x g por 1 min.</li>
	<li>Remova cuidadosamente a parte superior de 900 μL.</li>
	<li>Repita as etapas 5.4-5.6 três vezes.</li>
	<li>Remova 900 μL, deixando 100 μL de solução contendo os 200 worms.</li>
	<li>Adicione 25 μL de tampão de amostra de 5x(Tabela 1).</li>
	<li>Aqueça as amostras por 10 min a 92°C enquanto treme a 1000 rpm. As amostras podem então ser congeladas e mantidas a -20 °C.</li>
	<li>Carregue 20 μL de cada amostra e execute em um gel SDS-PAGE.</li>
	<li>Realize a análise de manchas ocidentais usando anticorpos apropriados para determinar a estabilidade relativa da proteína.</li>
	<li>Determine a intensidade das bandas usando software densitométrico, como o módulo de gel ImageJ livremente disponível. Normalize todos os valores para aqueles medidos na amostra de controle(s). NOTA: O objetivo do knockdown RNAi em nossas telas é diminuir os níveis proteicos de um acompanhante/co-acompanhante específico. Assim, a melhor maneira de avaliar a eficiência do knockdown rnai é pela análise de manchas ocidentais. Isso requer anticorpos específicos. Alternativamente, o qPCR pode ser usado para quantificar os níveis de mRNA.</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Uma imagem integrada da rede de proteostase refletindo como ela é organizada e funciona em diferentes células metazoanas e tecidos permanece em falta. Para supridamente essa deficiência, são necessárias informações específicas sobre as interações de diversos componentes dessa rede, como acompanhantes moleculares, em tecidos específicos durante o desenvolvimento e envelhecimento. Aqui, mostramos como o uso de perturbações específicas do tecido nos permitiu examinar a rede de acompanhantes em um determinado t...

As células lidam com danos proteicos empregando máquinas de controle de qualidade que reparam, sequeram ou removem quaisquer proteínas danificadas1,2. O dobrável e a montagem de complexos proteicos são suportados por acompanhantes moleculares, um grupo diversificado de proteínas altamente conservadas que podem reparar ou sequestrar proteínas danificadas3,4,5,6,7. A remoção de proteínas danificadas é mediada pelo sistema ubiquitina-proteasome (UPS)8 ou pelo maquinário de autofagia9 em colaboração com acompanhantes10,11,12. A homeostase proteica (proteostase) é, portanto, mantida por redes de controle de qualidade compostas por máquinas dobráveis e degradantes3,13. No entanto, entender as interações entre os diversos componentes da rede de proteostasis in vivo é um grande desafio. Enquanto as telas de interação proteína-proteína contribuem com informações importantes sobre interações físicas e complexos de acompanhantes14,15, falta compreender a organização e mecanismos compensatórios dentro de redes de acompanhantes específicas do tecido in vivo.
As interações genéticas são frequentemente usadas como uma ferramenta poderosa para examinar a relação entre pares de genes que estão envolvidos em vias biológicas comuns ou compensatórias16,17,18. Tais relações podem ser medidas combinando pares de mutações e quantificando o impacto de uma mutação em um gene sobre a gravidade fenotípica causada por uma mutação no segundo gene16. Embora a maioria dessas combinações não demonstre efeito em termos de fenótipo, algumas interações genéticas podem agravar ou aliviar a gravidade do fenótipo medido. Mutações agravantes são observadas quando o fenótipo do mutante de dupla exclusão é mais grave do que o fenótipo esperado visto ao combinar os mutantes de exclusão única, implicando que os dois genes funcionam em caminhos paralelos, afetando juntos uma determinada função. Em contraste, mutações aliviadas são observadas quando o fenótipo do mutante de dupla exclusão é menos grave do que o fenótipo visto com os mutantes de exclusão única, implicando que os dois genes agem juntos como um complexo ou participam da mesma via16,18. Assim, diversos fenótipos que podem ser quantificados, incluindo fenótipos amplos, como letalidade, taxas de crescimento e tamanho de ninhadas, bem como fenótipos específicos, como repórteres transcricionais, têm sido usados para identificar interações genéticas. Por exemplo, Jonikas et al. contaram com um repórter de estresse do PS para examinar as interações do Saccharomyces cerevisiae ER desdobrado rede de proteostase de resposta à proteína usando análises de exclusão genética de pairwise19.
As telas de interação genética envolvem cruzar sistematicamente mutações de exclusão pares para gerar um conjunto abrangente de mutantes duplos20. No entanto, em modelos animais, e especificamente em C. elegans,essa abordagem em larga escala não é viável. Em vez disso, cepas mutantes podem ser testadas para seus padrões de interação genética através da expressão genética de baixa regulação usando a interferência de RNA (RNAi)21. C. elegans é um poderoso sistema para telas baseados em RNAi22,23. Em C. elegans,a entrega de RNA (dsRNA) de duplar encalha é alcançada pela alimentação bacteriana, levando à disseminação de moléculas de dsRNA para numerosos tecidos. Dessa forma, as moléculas de dsRNA introduzidas impactam o animal através de um procedimento rápido e simples21. Uma tela de interação genética usando RNAi pode, portanto, revelar o impacto da regulação de um conjunto de genes ou da maioria dos genes codificadores C. elegans usando bibliotecas RNAi24. Em tal tela, hits que impactam o comportamento do mutante de interesse, mas não a cepa do tipo selvagem são modificadores potenciais do fenótipo sendomonitorados 25. Aqui, aplicamos uma combinação de mutações e triagem RNAi para mapear sistematicamente interações de acompanhantes específicas de tecidos em C. elegans.

<table><tbody><tr><td>12-well-plates</td><td>SPL</td><td>BA3D16B</td><td></td></tr><tr><td>40 mm plates</td><td>Greiner Bio-one</td><td>627160</td><td></td></tr><tr><td>60 mm plates</td><td>Greiner Bio-one</td><td>628102</td><td></td></tr><tr><td>6-well plates</td><td>Thermo Scientific</td><td>140675</td><td></td></tr><tr><td>96 well 2 mL 128.0/85mm</td><td>Greiner Bio-one</td><td>780278</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Formedium</td><td>AGA03</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Formedium</td><td>69-52-3</td><td></td></tr><tr><td>bromophenol blue</td><td>Sigma</td><td>BO126-25G</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Merck</td><td>1.02382.0500</td><td></td></tr><tr><td>Camera</td><td>Qimaging</td><td>q30548</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Amresco</td><td>0433-250G</td><td></td></tr><tr><td>Confocal</td><td>Leica</td><td>DM5500</td><td></td></tr><tr><td>Filter (0.22 &amp;micro;m)</td><td>Sigma</td><td>SCGPUO2RE</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescent stereomicroscope</td><td>Leica</td><td>MZ165FC</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Frutarom</td><td>2355519000024</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Formedium</td><td>367-93-1</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merck</td><td>104936</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Merck</td><td>1.04873.1000</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Bio-Lab</td><td>001649029100</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher</td><td>22189-08-8</td><td>Gift from the Morimoto laboratory</td></tr><tr><td>Myosin MHC A (MYO-3) antibody</td><td>Hybridoma Bank</td><td>5-6</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;middot;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma</td><td>s-0751</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Bio-Lab</td><td>001903029100</td><td></td></tr><tr><td>Peptone</td><td>Merck</td><td>61930705001730</td><td></td></tr><tr><td>Plate pouring pump</td><td>Integra</td><td>does it p920</td><td></td></tr><tr><td>RNAi Chaperone library</td><td>NA</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>VWR Life Science</td><td>0837-500</td><td></td></tr><tr><td>&amp;szlig;-mercaptoethanol</td><td>Bio world</td><td>41300000-1</td><td></td></tr><tr><td>stereomicroscope</td><td>Leica</td><td>MZ6</td><td></td></tr><tr><td>Tetracycline</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>64-75-5</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Bio-Lab</td><td>002009239100</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Fisher</td><td>BP337-500</td><td></td></tr></tbody></table>

using caenorhabditis elegans to screen for tissue-specific chaperone interactions

A dobra correta e a montagem de proteínas e complexos proteicos são essenciais para a função celular. As células empregam vias de controle de qualidade que corrijam, sequestram ou eliminam proteínas danificadas para manter um proteome saudável, garantindo assim proteostase celular e prevenindo danos adicionais à proteína. Devido a funções redundantes dentro da rede de proteostase, a triagem de fenótipos detectáveis usando knockdown ou mutações em genes codificadores de acompanhantes no organismo multicelular Caenorhabditis elegans resulta na detecção de fenótipos menores ou não na maioria dos casos. Desenvolvemos uma estratégia de triagem direcionada para identificar acompanhantes necessários para uma função específica e, assim, preencher a lacuna entre fenótipo e função. Especificamente, monitoramos interações de acompanhantes novos usando telas de interação sintética RNAi, expressão de acompanhante, um acompanhante de cada vez, em animais carregando uma mutação em um gene codificante de acompanhantes ou expressando demais um acompanhante de interesse. Ao interromper dois acompanhantes que individualmente não apresentam fenótipo bruto, podemos identificar acompanhantes que agravam ou expõem um fenótipo específico quando ambos perturbados. Demonstramos que essa abordagem pode identificar conjuntos específicos de acompanhantes que funcionam juntos para modular a dobra de um complexo de proteínas ou proteínas associados a um determinado fenótipo.

Usando mutações sensíveis à temperatura no UNC-45 para testar para agravar ou aliviar interações em condições permissivas ou restritivas, respectivamente A montagem e manutenção muscular oferecem um sistema eficaz para estudar interações de acompanhantes específicas do tecido. A unidade funcional de músculos contratuais, o sarcomere, apresenta um arranjo cristalino de proteínas estruturais e regulatórias. A estabilidade da miose da proteína motora e sua incorporação nos filamentos e...

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Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions

Para estudar as interações acompanhante-acompanhante e acompanhante-substrato, realizamos telas de interação sintética em elegans caenorhabditis usando interferência de RNA em combinação com mutações leves ou sobre-expressão de acompanhantes e monitorar disfunção proteica específica do tecido no nível do organismo.

Usando elegans caenorhabditis para tela para interações de acompanhantes específicas de tecido

Correct folding and assembly of proteins and protein complexes are essential for cellular function. Cells employ quality control pathways that correct, ...

using-caenorhabditis-elegans-to-screen-for-tissue-specific-chaperone

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions

2.8K visualizações.  Ben-Gurion University of the Negev. Para estudar as interações acompanhante-acompanhante e acompanhante-substrato, realizamos telas de interação sintética em elegans caenorhabditis usando interferência de RNA em combinação com mutações leves ou sobre-expressão de acompanhantes e monitorar disfunção proteica específica do tecido no nível do organismo.

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A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages for identifying biologically active chemical structures that can modify complex phenotypes such as lifespan. Described here is a simple protocol for producing hundreds of 96-well culture plates with fairly consistent numbers of C. elegans in each well. Next, we specified how to use these cultures to screen thousands of chemicals for effects on the lifespan of the nematode C. elegans. This protocol makes use of temperature sensitive sterile strains, agar plate conditions, and simple animal handling to facilitate the rapid and high throughput production of synchronized animal cultures for screening.

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Here we describe a simple protocol for rapidly producing hundreds of nematode growth media agar, 96-well culture plates with consistent numbers of Caenorhhabditis elegans per well. These cultures are useful for the phenotypic screening of whole organisms. We focus here on using these cultures to screen chemicals for pro-longevity effects.

Um método simples para High Throughput Screening químico em Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Bioquímica

Identification of EGFR and RAS Inhibitors using Caenorhabditis elegans

The changes in the plasma membrane localization of the epidermal growth factor receptor (EGFR) and its downstream effector RAS have been implicated in several diseases including cancer. The free-living nematode C. elegans possesses an evolutionary and functionally conserved EGFR-RAS-ERK MAP signal cascade which is central for the development of the vulva. Gain of function mutations in RAS homolog LET-60 and EGFR homolog LET-23 induce the generation of visible nonfunctional ectopic pseudovulva along the ventral body wall of these worms. Previously, the multivulval (Muv) phenotype in these worms has been shown to be inhibited by small chemical molecules. Here we describe a protocol for using the worm in a liquid-based assay to identify inhibitors that abolish the activities of EGFR and RAS proteins. Using this assay, we show R-fendiline, an indirect inhibitor of K-RAS, suppresses the Muv phenotype expressed in the let-60(n1046) and let-23(sa62) mutant worms. The assay is simple, inexpensive, is not time consuming to setup, and can be used as an initial platform for the discovery of anticancer therapeutics.

Identification of EGFR and RAS Inhibitors using Caenorhabditis elegans

The genetically tractable nematode Caenorhabditis elegans can be used as a simple and inexpensive model for drug discovery. Described here is a protocol to identify anticancer therapeutics that inhibit the downstream signaling of RAS and EGFR proteins.

Identificação de Inibidores EGFR e RAS utilizando elegans caenorhabditis

The changes in the plasma membrane localization of the epidermal growth factor receptor (EGFR) and its downstream effector RAS have been implicated in ...

Pesquisa do câncer

Protein Extract Preparation and Co-immunoprecipitation from Caenorhabditis elegans

Co-immunoprecipitation methods are frequently used to study protein-protein interactions. Confirmation of hypothesized protein-protein interactions or identification of new ones can provide invaluable information about the function of a protein of interest. Some of the traditional methods for extract preparation frequently require labor-intensive and time-consuming techniques. Here, a modified extract preparation protocol using a bead mill homogenizer and metal beads is described as a rapid alternative to traditional protein preparation methods. This extract preparation method is compatible with downstream co-immunoprecipitation studies. As an example, the method was used to successfully co-immunoprecipitate&#160;C. elegans microRNA Argonaute ALG-1 and two known ALG-1 interactors: AIN-1, and HRPK-1. This protocol includes descriptions of animal sample collection, extract preparation, extract clarification, and protein immunoprecipitation. The described protocol can be adapted to test for interactions between any two or more endogenous, endogenously tagged, or overexpressed C. elegans proteins in a variety of genetic backgrounds.

Protein Extract Preparation and Co-immunoprecipitation from Caenorhabditis elegans

This method describes a protocol for high-throughput protein extract preparation from Caenorhabditis elegans samples and subsequent co-immunoprecipitation.

Preparação e Co-imunoprecipitação de Caenorhabditis elegans

Co-immunoprecipitation methods are frequently used to study protein-protein interactions. Confirmation of hypothesized protein-protein interactions or ...

Biologia do Desenvolvimento

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes. However, many compounds identified in screens using cell culture models are often found to be toxic or pharmacologically inactive in vivo1-2. Screening in whole animal models can help avoid these pitfalls and streamline the path to drug development.
C. elegans is a multicellular model organism well suited for HTS. It is small (&lt;1 mm) and can be economically cultured and dispensed in liquids. C. elegans is also one of the most experimentally tractable animal models permitting rapid and detailed identification of drug mode-of-action3.
We describe a protocol for culturing and dispensing fluorescent strains of C. elegans for high-throughput screening of chemical libraries or detection of environmental contaminants that alter the expression of a specific gene. Large numbers of developmentally synchronized worms are grown in liquid culture, harvested, washed, and suspended at a defined density. Worms are then added to black, flat-bottomed 384-well plates using a peristaltic liquid dispenser. Small molecules from a chemical library or test samples (e.g., water, food, or soil) can be added to wells with worms. In vivo, real-time fluorescence intensity is measured with a fluorescence microplate reader. This method can be adapted to any inducible gene in C. elegans for which a suitable reporter is available. Many inducible stress and developmental transcriptional pathways are well defined in C. elegans and GFP transgenic reporter strains already exist for many of them4. When combined with the appropriate transgenic reporters, our method can be used to screen for pathway modulators or to develop robust biosensor assays for environmental contaminants. 
We demonstrate our C. elegans culture and dispensing protocol with an HTS assay we developed to monitor the C. elegans cap &#x2018;n&#x2019; collar transcription factor SKN-1. SKN-1 and its mammalian homologue Nrf2 activate cytoprotective genes during oxidative and xenobiotic stress5-10. Nrf2 protects mammals from numerous age-related disorders such as cancer, neurodegeneration, and chronic inflammation and has become a major chemotherapeutic target11-13.Our assay is based on a GFP transgenic reporter for the SKN-1 target gene gst-414, which encodes a glutathione-s transferase6. The gst-4 reporter is also a biosensor for xenobiotic and oxidative chemicals that activate SKN-1 and can be used to detect low levels of contaminants such as acrylamide and methyl-mercury15-16.

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

A procedure for liquid-based culturing and dispensing of C. elegans strains expressing fluorescent reporter proteins is described that does not require expensive sorting equipment. This approach can be applied to numerous inducible C. elegans genes for drug discovery or biosensing of contaminants.

Alto rendimento Triagem e Biossensoriais com Fluorescente C. elegans Cepas

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes.  However, many compounds identified in ...

Biologia

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

Básico<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Métodos: Sincronização e observação

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Caenorhabditis elegans as a Model System for Discovering Bioactive Compounds Against Polyglutamine-Mediated Neurotoxicity

Age-related misfolding and aggregation of pathogenic proteins are responsible for several neurodegenerative diseases. For example, Huntington&#39;s disease (HD) is principally driven by a CAG nucleotide repeat that encodes an expanded glutamine tract in huntingtin protein. Thus, the inhibition of polyglutamine (polyQ) aggregation and, in particular, aggregation-associated neurotoxicity is a useful strategy for the prevention of HD and other polyQ-associated conditions. This paper introduces generalized experimental protocols to assess the neuroprotective capacity of test compounds against HD using established polyQ transgenic Caenorhabditis elegans models. The AM141 strain is chosen for the polyQ aggregation assay as an age-associated phenotype of discrete fluorescent aggregates can be easily observed in its body wall at the adult stage due to muscle-specific expression of polyQ::YFP fusion proteins. In contrast, the HA759 model with strong expression of polyQ-expanded tracts in ASH neurons is used to examine neuronal death and chemoavoidance behavior. To comprehensively evaluate the neuroprotective capacity of target compounds, the above test results are ultimately presented as a radar chart with profiling of multiple phenotypes in a manner of direct comparison and direct viewing.

Caenorhabditis elegans as a Model System for Discovering Bioactive Compounds Against Polyglutamine-Mediated Neurotoxicity

Here, we present a protocol to assess the neuroprotective activities of test compounds in Caenorhabditis elegans, including polyglutamine aggregation, neuronal death, and chemoavoidance behavior, as well as an exemplary integration of multiple phenotypes.

Caenorhabditis elegans como um sistema modelo para descobrir compostos bioativos contra neurotoxicidade mediada por poliglutamina

Age-related misfolding and aggregation of pathogenic proteins are responsible for several neurodegenerative diseases. For example, Huntington&#39;s ...

Neurociência

Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

Prions are unconventional self-propagating proteinaceous particles, devoid of any coding nucleic acid. These proteinaceous seeds serve as templates for the conversion and replication of their benign cellular isoform. Accumulating evidence suggests that many protein aggregates can act as self-propagating templates and corrupt the folding of cognate proteins. Although aggregates can be functional under certain circumstances, this process often leads to the disruption of the cellular protein homeostasis (proteostasis), eventually leading to devastating diseases such as Alzheimer&#8217;s disease (AD), Parkinson&#8217;s disease (PD), Amyotrophic lateral sclerosis (ALS), or transmissible spongiform encephalopathies (TSEs). The exact mechanisms of prion propagation and cell-to-cell spreading of protein aggregates are still subjects of intense investigation. To further this knowledge, recently a new metazoan model in Caenorhabditis elegans, for expression of the prion domain of the cytosolic yeast prion protein Sup35 has been established. This prion model offers several advantages, as it allows direct monitoring of the fluorescently tagged prion domain in living animals and ease of genetic approaches. Described here are methods to study prion-like behavior of protein aggregates and to identify modifiers of prion-induced toxicity using C. elegans.

Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

Prion-like propagation of protein aggregates has recently emerged as being implicated in many neurodegenerative diseases. The goal of this protocol is to describe, how to use the nematode C. elegans as a model system to monitor protein spreading and to investigate prion-like phenomena.

Investigando as proteínas príon-like espalhando e de toxicidade de usar o Metazoan Organismo Modelo<em&gt; C. elegans</em

Prions are unconventional self-propagating proteinaceous particles, devoid of any coding nucleic acid. These proteinaceous seeds serve as templates for ...

A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

The multicellular model organism Caenorhabditis elegans is a small nematode of approximately 1 mm in size in adulthood that is genetically and experimentally tractable. It is economical and easy to culture and dispense in liquid medium which makes it well suited for medium-throughput screening. We have previously validated the use of transgenic luciferase expressing C. elegans strains to provide rapid in vivo assessment of the nematode&#8217;s ATP levels.1-3 Here we present the required materials and procedure to carry out bioassays with the bioluminescent C. elegans strains PE254 or PE255 (or any of their derivative strains). The protocol allows for in vivo detection of sublethal effects of drugs that may identify mitochondrial toxicity, as well as for in vivo detection of potential beneficial drug effects. Representative results are provided for the chemicals paraquat, rotenone, oxaloacetate and for four firefly luciferase inhibitory compounds. The methodology can be scaled up to provide a platform for screening drug libraries for compounds capable of modulating mitochondrial function. Pre-clinical evaluation of drug toxicity is often carried out on immortalized cancerous human cell lines which derive ATP mostly from glycolysis and are often tolerant of mitochondrial toxicants.4,5 In contrast, C. elegans depends on oxidative phosphorylation to sustain development into adulthood, drawing a parallel with humans and providing a unique opportunity for compound evaluation in the physiological context of a whole live multicellular organism.

A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

A protocol is described for in vivo detection of effects of mitochondrial inhibitors in the model organism Caenorhabditis elegans and for identification of potential enhancing compounds. This protocol can be used to screen drug libraries for compounds modulating mitochondrial function.

A rastreï¿½el<em&gt; In Vivo</em&gt; Ensaio para mitocondrial Modulators Usando Transgenic Bioluminescent<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

The multicellular model organism Caenorhabditis elegans is a small nematode of approximately 1 mm in size in adulthood that is genetically and ...

Quantifying Tissue-Specific Proteostatic Decline in Caenorhabditis elegans

The ability to maintain proper function and folding of the proteome (protein homeostasis) declines during normal aging, facilitating the onset of a growing number of age-associated diseases. For instance, proteins with polyglutamine expansions are prone to aggregation, as exemplified with the huntingtin protein and concomitant onset of Huntington&#8217;s disease. The age-associated deterioration of the proteome has been widely studied through the use of transgenic Caenorhabditis elegans expressing polyQ repeats fused to a yellow fluorescent protein (YFP). This polyQ::YFP transgenic animal model facilitates the direct quantification of the age-associated decline of the proteome through imaging the progressive formation of fluorescent foci (i.e., protein aggregates) and subsequent onset of locomotion defects that develop as a result of the collapse of the proteome. Further, the expression of the polyQ::YFP transgene can be driven by tissue-specific promoters, allowing the assessment of proteostasis across tissues in the context of an intact multicellular organism. This model is highly amenable to genetic analysis, thus providing an approach to quantify aging that is complementary to lifespan assays. We describe how to accurately measure polyQ::YFP foci formation within either neurons or body wall muscle during aging, and the subsequent onset of behavioral defects. Next, we highlight how these approaches can be adapted for higher throughput, and potential future applications using other emerging strategies for C. elegans genetic analysis.

Quantifying Tissue-Specific Proteostatic Decline in Caenorhabditis elegans

Proteostatic decline is a hallmark of aging, facilitating the onset of neurodegenerative diseases. We outline a protocol to quantifiably measure proteostasis in two different Caenorhabditis elegans tissues through heterologous expression of polyglutamine repeats fused to a fluorescent reporter. This model allows rapid in vivo genetic analysis of proteostasis.

Quantificando o declínio proteostático específico do tecido em elegans caenorhabditis

The ability to maintain proper function and folding of the proteome (protein homeostasis) declines during normal aging, facilitating the onset of a ...

Usando elegans caenorhabditis para tela para interações de acompanhantes específicas de tecido

Resumo

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Um método simples para High Throughput Screening químico em Caenorhabditis Elegans

Identificação de Inibidores EGFR e RAS utilizando elegans caenorhabditis

Preparação e Co-imunoprecipitação de Caenorhabditis elegans

Alto rendimento Triagem e Biossensoriais com Fluorescente C. elegans Cepas

Básico

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Caenorhabditis elegans como um sistema modelo para descobrir compostos bioativos contra neurotoxicidade mediada por poliglutamina

Investigando as proteínas príon-like espalhando e de toxicidade de usar o Metazoan Organismo Modelo

A rastreï¿½el

Quantificando o declínio proteostático específico do tecido em elegans caenorhabditis