Os RT-PCRs convencionais não permitem discriminação entre as sequências de sentido e anti-sentido quando usadas para detectar RNAs codificadas por genes sobrepostos. Este protocolo permite detectar especificamente RNAs anti-sentido. O uso de primers biotimilados, juntamente com altas temperaturas de desnaturação de RNA, permite a amplificação de cDNAs anti-sentido, impedindo a formação de produtos RT não específicos.
Usamos este método para demonstrar que o ASP, seja como um anti-sentido de RNA ou um precursor de proteínas, é um novo antígeno do HIV, faz potencialmente um novo alvo de HIV para a terapia. Este método pode ser aplicado a qualquer sistema, no qual rnas anti-sentido de genes sobrepostos podem ser detectados. Comece projetando primers específicos do paciente usando a sequência de DNA pró-viral interna para os primers PanASP.
Em seguida, quantifique o RNA e elimine a contaminação do DNA tratando amostras com DNase. Transfira entre 0,1 e um micrograma de RNA total para os poços apropriados em uma placa PCR de 96 poços. Em seguida, configure a transcrição reversa, ou reação RT, de acordo com as instruções do manuscrito.
Prepare os controles RT endógenos adicionando cinco microliters de água livre de nuclease em vez do primer reverso ASP. Coloque a placa no termociclador e aqueça o RNA a 94 graus Celsius por cinco minutos. Em seguida, esfrie-o imediatamente em água gelada por pelo menos um minuto.
Prepare a mistura de reação em um tubo de 1,5 mililitro, conforme descrito no manuscrito do texto, depois transfira 17,5 microliters para cada um dos poços contendo RNA. A desnaturação do RNA deve ser realizada a 94 graus centígrados. Sem a desnaturação total, podem ocorrer sínteses de produtos não específicos do RNA sentido, levando à amplificação de cDNAs não específicos.
Misture o conteúdo dos poços suavemente e incubar a placa a 55 graus Celsius por 60 minutos. Em seguida, inativar as reações aquecendo a placa a 70 graus Celsius por 15 minutos. Prepare um litro de tampão de lavagem e ligação 2X de acordo com as instruções do manuscrito e filtre a solução.
Em seguida, prepare 50 mililitros de lavagem 1X e tampão de ligação usando água de grau PCR. Transfira o número apropriado de contas magnéticas conjugadas com streptavidin para um tubo de 1,5 mililitro e depois lave-as adicionando um volume igual de lavagem 2X e tampão de ligação e vórtice do tubo por 15 segundos. Coloque o tubo em um rack de separação magnética e incuba-o por três minutos em temperatura ambiente.
Em seguida, remova cuidadosamente o supernasciente sem perturbar as contas e adicione o mesmo volume do tampão de lavagem e ligação 2X como o volume inicial das contas. Vórtice as contas por 30 segundos e transfira 10 microliters da suspensão para um número apropriado de tubos de 1,5 mililitro. Coloque os tubos no rack de separação magnética e incuba-os por três minutos em temperatura ambiente.
Em seguida, descarte o supernatante e adicione 50 microliters de lavagem 2X e tampão de ligação. Adicione 50 microlitadores de cDNA biotimilado aos tubos correspondentes com as contas e incuba-os por 30 minutos enquanto gira suavemente. Após a incubação, coloque os tubos no rack de separação magnética por três minutos e depois lave as contas com 200 microliters de 1X de lavagem e tampão de ligação, seguido de uma incubação de três minutos no rack de separação.
Descarte o supernatante e repita a lavagem duas vezes. Em seguida, resuspenja as contas em 10 microliters de água de grau PCR. Prepare um volume apropriado de PCR Master Mix de acordo com as instruções do manuscrito.
Misture bem e gire-o rapidamente para baixo, em seguida, transfira 49 microliters por poço para uma placa PCR de 96 poços. Cuidadosamente vórtice dos tubos com o cDNA purificado por 15 segundos e adicione um microliter da suspensão aos poços correspondentes. Execute o PCR e separe os produtos em um gel de 1% de agarose.
Corte as bandas do gel e clone os produtos amplificados em um plasmídeo PCR 2.1. Em seguida, sequenciar os clones e analisar cada sequência. As reações iniciais de RT foram realizadas com o primer anti-sentido não bionilatado regular e resultaram em amplificação bem sucedida do ASP.
No entanto, uma faixa do mesmo peso molecular e primer menos controles também foi amplificada. Para contornar esse problema, o primer anti-sentido específico foi rotulado com biotyn e o cDNA anti-sentido resultante foi purificado antes do PCR. Isso possibilitou amplificar a sequência ASP com contaminação muito reduzida do cDNA não específico no primer menos controles.
A otimização adicional deste método foi alcançada pela desnaturação completa do RNA a 94 graus Celsius antes da TR, seguida pelo resfriamento imediato da água gelada, o que resultou em amplificação efetiva da banda ASP e sem produtos não específicos. A cinética do ASP RNA foi medida e as células CD4 isoladas de três indivíduos hiv positivos com viremia detectável e ausência de terapia após estimulação com anti-CD3/CD28. A quantificação do RNA ASP também foi possível em pacientes submetidos à TARV, com viremia não detectável.
Em dois em cada três pacientes, o RNA ASP foi detectado em níveis baixos em três a cinco dias pós-estimulação. Dois pacientes foram analisados para ASP e env RNAs, um não tratado e um tratado. Para o paciente não tratado, ambos os RNAs poderiam ser detectados.
Para o paciente tratado, ASP e env mal foram detectáveis após vários dias de estimulação. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que a desnaturação lineariza o RNA para que estruturas secundárias capazes de primor RT sejam destruídas. Considerando que a lavagem das contas afasta os cDNAs não bionilatados.
Após a purificação dos cDNAs com a polaridade correta, o qPCR pode ser realizado para analisar a expressão genética. Além disso, cDNAs também podem ser clonados e usados para análise de sequência. Este método permite estudar genes sobrepostos em orientação oposta e pode ser útil na regulação elucidação de uma bactéria e de uma doença relacionada ao vírus, incluindo alguns tipos de câncer.
