Este novo método para analisar a transcrição reversa pode nos dizer coisas novas sobre o campo da virologia retrô. Por exemplo, podemos aprender sobre os detalhes de como os fatores de restrição celular funcionam ou como drogas antirretrovirais inibem a síntese de DNA do HIV1. A principal vantagem desta técnica é que não só fornece informações sobre a sequência de escrips de Tran Reversa Nascente, mas permite o mapeamento de seu preciso termini de DNA 3-prime em resolução nuclear única.
O enriquecimento de DNAs complementares do HIV1 a partir do DNA por atacado de células infectadas pelo HIV1, é feito por captura híbrida e deve ser realizado em uma estação de trabalho pcr. Prepare uma mistura mestre de contas magnéticas streptavidin por tubo, liderando cem microliters de contas por amostra em um único tubo de micro centrífuga colocar o tubo em um ímã adequado para tubos de micro centrífugas. Depois que as contas se estabelecerem em direção ao lado do ímã do tubo, remova o tampão de armazenamento, remova o tubo do ímã e suspenda as contas em quinhentos microliters de lavagem bindent ou tampão BW.
Coloque o tubo de volta no ímã, espere que as contas migrem para o ímã e remova o supernatante. Remova o tubo do ímã, adicione quinhentos microliters de solução de caseína, suspenda as contas e incubar à temperatura ambiente por dez minutos. Depois de dez minutos, lave as contas com tampão BW.
Coloque o tubo de volta no ímã, remova o sobrenante e suspenda as contas em quinhentos microliters de tampão BW. Adicione cinquenta picomoles de cada oligonucleotídeo biotinilado capturado por amostra. Incubar à temperatura ambiente enquanto balança em uma mistura final por trinta minutos.
Em seguida, devolva o tubo ao ímã, remova o supernascer, remova o tubo do ímã, adicione quinhentos microliters de 1x 10 buffer e suspenda as contas. Após a segunda lavagem, suspenda as contas com os oligonucleotídeos imobilizados em dez microliters de 1x dez tampão por amostra. Para cada amostra, rotule um tubo de microcetrofúgio e adicione dez microliters de suspensão de contas, cento e setenta microliters de DNA, e noventa microliters de tampão 3x ten.
Incubar em um bloco de calor seco a noventa e dois graus celsius por dois minutos para desmuar o DNA. Mova os tubos para um bloco de calor seco diferente, que está definido para 52 graus Celsius, e incubar por uma hora. A cada dez minutos durante esta incubação, inverta os tubos para misturar.
Quando a incubação de uma hora for feita, lave as contas uma vez com quinhentos microlitadores de 1x 10 buffer, e suspenda novamente em trinta e cinco microliters de água livre de nuclease. Certifique-se de que as contas se acomodam bem deixando os tubos no ímã por cerca de três minutos antes de remover qualquer líquido. Para eluto, incubar os tubos a noventa e dois graus Celsius em um bloco de calor seco por dois minutos.
Em seguida, mova rapidamente os tubos para o ímã, um tubo de cada vez. Uma vez que as contas estejam ligadas ao lado do tubo, transfira o supernante contendo o DNA HIV1 para um tubo fresco. Para iniciar este procedimento, suspenda o adaptador liofilizado em cem micromolares em água livre de nuclease e vórtice do tubo.
Por amostra, mais uma amostra de controle, combinam zero ponto quatro cinco microliters de 10x T4 DNA ligase buffer, quatro microliters de adaptador, e ponto zero cinco microliters de água livre nuclease. Aqueça até 92 graus Celsius por dois minutos, e depois deixe esfriar lentamente até dezesseis graus Celsius em uma máquina PCR. Isso permitirá que o adaptador forme uma estrutura de pinos de cabelo.
O passo chave neste procedimento é a ligadura eficiente e imparcial de moléculas adaptadas para abrir termini de DNA 3-prime. Moléculas de CDNA nascentes purificadas de comprimento variado são ligadas a um adaptador de DNA encalhado único usando ligadura de DNA T4. O adaptador carrega uma sequência aleatória de código de barras de seis nucleotídeos, que permite a parização para facilitar a ligadura, e simultaneamente serve como um identificador para leituras exclusivas.
O adaptador termini 3-prime carrega um espaçador para evitar a autoligação. Para configurar sessenta reações de ligadura final de volume microliter, adicione o seguinte a cada tubo PCR: seis microliters de 10x T4 DNA ligase buffer, vinte quatro microliters de quarenta por cento PEG, seis microliters de cinco molar Betaine, quatro ponto cinco microliters de adaptador, um ponto dois microliters de ligase de DNA T4, e dezoito pontos os microliters de DNA. Depois de misturar bem as reações, incubar em uma máquina PCR a dezesseis graus Celsius durante a noite.
No dia seguinte à ligadura do adaptador, em trinta microlitrais de formamida contendo tampão de carregamento de gel de DNA a cada reação de ligadura e misture bem por direção de tubo. Aqueça em uma máquina PCR a 94 graus Celsius por dois minutos e depois coloque imediatamente no gelo. O próximo passo é preparar-se para a eletroforese gel desnaturada.
Coloque um gel de poliacrilamida de ureia de 6% TBE pré-lançado em um tanque de gel apropriado e adicione 1x tampão de corrida TBE. Pré executar o gel por vinte minutos. Em seguida, use uma seringa e uma agulha de calibre 21 para lavar os bolsos de gel com tampão de corrida.
Em seguida, carregue trinta microliters por poço da mesma amostra em três poços. É aconselhável executar apenas uma amostra por gel para evitar contaminação cruzada. Corra por 20 minutos.
Enquanto o gel estiver funcionando, prepare três tubos de microcentrifuuge de zero ponto cinco mililitros por amostra usando uma agulha de seringa de calibre 21 para furar o fundo. Insira cada um dos tubos preparados em um tubo micro centrífuga de dois mililitros e rotule-os com o nome da amostra mais baixo, médio ou alto. Quando a frente de corante azul escuro estiver a meio caminho do gel, pare a eletroforese e remova a fita de gel.
Pry abra o e corte o gel verticalmente com um razorblade. Para generosamente extirpo a tira com três poços de amostras carregadas. Adicione a tira de gel a um recipiente com 1x TBE e cinco microliters de mancha de ácido nucleico de cianinina e incubar por três a cinco minutos.
Certifique-se de que a coloração é suficiente para identificar facilmente a parte superior do adaptador livre que deve ser removida mais tarde. Em seguida, limpe a superfície de um transilluminador de luz azul completamente com água destilada de ionizada. Em seguida, tire a peça de gel do recipiente de coloração e coloque-a na caixa de luz.
Acenda a caixa de luz e inspecione os ácidos nucleicos manchados através do filtro laranja. Uma amostra de DNA ligada representativa em um gel manchado é mostrada aqui. O adaptador normalmente aparece sobrecarregado e funciona como uma grande bolha com DNA HIV1 ligado correndo acima como uma raia.
As linhas vermelhas indicam que os locais do gel devem ser cortados para remover o adaptador livre e dividir a amostra em três pedaços uniformes. Usando um novo razorblade, corte os lados do gel se houver áreas sem amostra carregada ainda presente. Em seguida, corte logo acima do adaptador para remover o adaptador e peças de gel inferiores.
Finalmente, corte o topo do gel, incluindo cerca de um milímetro dos bolsos de gel que muitas vezes têm um sinal intenso acentuado de DNA de maior peso molecular. Divida a peça de gel restante contendo a amostra horizontalmente em três pedaços uniformes. Áreas de baixo, médio e alto peso molecular.
Em seguida, corte cada um dos três fragmentos de gel em pedaços de dois por dois milímetros e transfira-os para os tubos de microcentrifuge preparados de zero ponto zero cinco mililitros. Gire em velocidade máxima com tampas abertas por um minuto. Para espremer os pedaços de gel através do orifício no tubo de dois mililitros para criar uma lama de gel.
Se alguma partícula de gel permanecer na parte inferior do tubo zero ponto cinco mililitro, transfira-as para o tubo de dois mililitros manualmente usando uma agulha. Inicie o procedimento de extração de DNA adicionando um mililitro de tampão de extração de gel de ureia à lama de gel em cada tubo de microcentrifuuge. Gire os tubos com uma batedeira final a temperatura ambiente por um mínimo de três horas.
Prepare as colunas do filtro. Use um conjunto limpo de pinças para adicionar um pequeno filtro de fibra de vidro redondo a cada coluna centrífuga com filtros de membrana de acetato de celulose, o que evita entupimento da membrana. Coloque o filtro no lugar com uma ponta invertida na cabeça do tubo.
Gire brevemente os dois tubos mililitros com lama de gel e tampão de extração em um microcentrifuuge, e transfira 700 microliters do supernatante para as colunas de filtro preparadas. Centrifugar as colunas do filtro em uma microcentrifuagem em velocidade máxima por um minuto. Em seguida, transfira o fluxo através de um novo tubo de microcentrífuga de dois mililitros.
Recarregue as colunas com o restante do supernatante. Tente obter o máximo de líquido possível da lama de extração e não se preocupe se as peças de gel estão incluídas. Gire de novo.
Combine o fluxo através das mesmas amostras de extração e prossiga conforme descrito no protocolo de texto. Este protocolo foi empregado em amostras de células CEMS-ST infectadas com VIF-deficiente HIV-1 na ausência ou presença da proteína humana antirretroviral A3G. Um gráfico do número total de leituras únicas obtidas de cada amostra indica que os níveis crescentes de A3G reduzem o número total de leitura.
Refletindo o efeito inibidor do A3G na síntese de cdna mediada por transcriptase reversa. Nestas três parcelas seguintes, a fração de moléculas em cada comprimento possível dentro dos primeiros cento e oitenta e dois nucleotídeos, é mostrada em histogramas azuis. A adição de A3G custou um aumento acentuado de moléculas de cdna truncadas mais curtas em algumas posições reprodutíveis muito específicas.
As linhas vermelhas tracejadas mostram as porcentagens de leituras carregando mutações C a T na respectiva posição. Um controle positivo pode ser produzido processando um pool de oligonucleotídeos sintéticos de sequência de conhecimento, comprimento e concentração. Todas as moléculas devem aparecer em abundância próxima à mesma com apenas pequenas variações.
Se uma corrida de biblioteca produz um viés de comprimento menor, no sequenciamento, é aconselhável aplicar um fator de normalização derivado da inclinação que representa o viés de tamanho. Este procedimento pode ser prontamente adaptado a outros sistemas onde determinar as três extremidades primos das moléculas de DNA adicionaria insights-chave sobre ares do metabolismo de ácido nucleico. Por favor, não se esqueça que trabalhar com HIV pode ser extremamente perigoso e algumas infecções só devem ser realizadas em laboratórios de segurança designados.
