Este protocolo fornece uma nova abordagem para quantificar a dinâmica do ramo da árvore dendrítica e desenvolver neurônios usando imagens de lapso de tempo ao vivo e um software de anotação de imagem 3D. Esta técnica imagens e rastreia os terminais do ramo fornecendo um método rápido e eficiente para medir os comportamentos dinâmicos da filopodia dendrítica. A pesquisa usando este método fornece uma visão sobre como o desenvolvimento e a atividade regulam a morfogênese dendrite.
Nossos métodos são aplicáveis a neurônios pouco rotulados em configurações in vitro e in vivo. Ao realizar este procedimento, lembre-se que os parâmetros de imagem devem ser cuidadosamente ajustados para alcançar uma resolução temporal e espacial suficiente. Para colher cérebros de drosophila larval, sob um microscópio dissecando use um par de fórceps de dissecção de ponta padrão número cinco para manter um espécime larval no lugar enquanto usa o outro para dissecar cuidadosamente o cérebro, preservando os discos oculares, lóbulos cerebrais e cordão nervoso ventral.
Em seguida, remova os músculos ligados para minimizar qualquer movimento da amostra durante a imagem. Quando todos os cérebros forem colhidos, use graxa de vácuo para desenhar uma câmara quadrada em um escorregador de vidro e adicionar 20 microliters de solução salina externa à câmara. Use os fórceps para transferir os cérebros para a câmara e ajustar as posições do cérebro sob o microscópio com os lados dorsais voltados para cima.
Cubra a câmara com um deslizamento de tampa de vidro e pressione suavemente no deslizamento da tampa para reduzir a deriva da amostra durante o procedimento de imagem. Para identificar explanações cerebrais contendo neurônios rotulados individualmente, dentro de 30 minutos da dissecção selecione um objetivo de imersão de água de 40X e uma fonte de luz de epifluorescência. Selecione um laser de dois fótons sintonizado em 920 nanômetros e um detector não Dscan e defina os parâmetros de imagem para coletar as imagens em 512 por 512 pixels por quadro e um minuto por pilha Z por 10 minutos.
Em seguida, ajuste o zoom óptico e digital para obter uma resolução X, Y, Z suficiente, garantindo a cobertura de todo o arbor erótico em um minuto. As configurações gerarão imagens com uma resolução típica X, Y, Z de 0,11 por 0,11 por 0,25 micrômetros. Para correção de deriva, abra o arquivo de interesse em um programa de software de correção de deriva adequado e clique em Editar e Editar parâmetros microscópicos.
Defina o tipo de microscópio para Wide Field para as duas imagens de fótons se houver uma opção de dois fótons e siga o fluxo de trabalho definido pelo software. Para a desconvolução, abra a imagem corrigida à deriva no software de desconvolução e siga o fluxo de trabalho. Em seguida, salve a imagem desconvolved em um tipo de arquivo que é suportado pelo software de anotação de imagem subsequente capaz de analisar dados 4D e relatar as coordenadas espaciais de pontos definidos dentro da imagem.
Para anotação de imagem, abra a imagem desconvolved no software de anotação de imagem e examine e marque as pontas do ramo em pontos de sempre em 3D. O software de anotação de imagem informará e armazenará as coordenadas espaciais e temporais das pontas marcadas do ramo. Exporte as informações de coordenadas como um arquivo CSV para cálculos subsequentes.
No módulo Pontos, clique em Pular criação automática, editar manualmente e verificar a caixa de seleção de ponto selecionado. Revise os quadros na série temporal e selecione um ramo para anotação. Segurando a tecla Shift, clique na ponta do terminal do ramal para adicionar um ponto.
Em seguida, clique na guia Estatísticas, selecione Valores Detalhados, Específicos e Posição. As informações de coordenadas espaciais e temporais gravadas serão exibidas. Clique em Salvar para exportar os dados como um arquivo CSV.
Para calcular a colocação da ponta da filial em 3D, abra o arquivo CSV como uma planilha e selecione a coluna Track ID. Clique em Classificar de menor para maior e aceitar Expandir a Seleção. Após a classificação, o Track ID identificará cada ramo dendrático único e os pontos da mesma filial compartilham o mesmo Track ID.A coluna Time armazenará as informações de diferentes períodos de tempo.
Na planilha, adicione uma coluna Distância e use as coordenadas para calcular a distância de cada dois pontos temporalmente adjacentes. Para medir pequenos movimentos no nível único de voxel, reinicie todos os valores de distância menores que 0,3 micrômetros para filtrar qualquer anotação de imagem não corrigida ou imperfeita. Em seguida, crie uma coluna Deslocamento e copie os valores da coluna Distância para a coluna Deslocamento.
Atribua manualmente os eventos de extensão e retração para cada ponta de ramo. Se for uma extensão, deixe o valor de deslocamento positivo inalterado. Se for uma retração, altere o valor de deslocamento correspondente para um valor negativo.
Em seguida, em uma nova coluna Evento, somam os valores de deslocamento para eventos individuais de extensão e retração. Neste vídeo, pode-se observar uma série de imagens projetadas de intensidade máxima coletadas de um neurônio lateral ventral rotulado individualmente. Imagens de quadro único permitem avaliação dos eventos de retração e extensão.
O rastreamento 4D semiautomado dos terminais de filial permite a anotação dos terminais dinâmicos de ramificação de neurônios laterais ventral rotulados individualmente, conforme demonstrado. O cálculo da direção e distância dos movimentos do ramo em cada ponto de tempo permite uma comparação da dinâmica do ramo dendrático para neurônios laterais ventrais rotulados individualmente em diferentes estágios de desenvolvimento. O passo mais importante é preservar a integridade do tecido cerebral e da morfologia de dendrite durante a dissecção e montagem.
A qualidade da série de imagens brutas também é fundamental para o rastreamento e quantificação bem-sucedidos. Utilizando esta técnica, ganhamos a capacidade de realizar análise quantitativa de dendrite filopodia no desenvolvimento de neurônios centrais de drosophila e explorar as máquinas moleculares relacionadas à maturação dendrite e à sináforogógena.
