Você já pensou em aproveitar o poder da microdisseção de captura a laser para análise da expressão genética em células ósseas específicas dentro de seu ambiente natural? Aqui, descrevemos um protocolo que lhe permitirá obter quantidades suficientes de RNA de alta qualidade a partir de criosections de ossos de rato. Esta tecnologia é uma ótima ferramenta para examinar mudanças na expressão genética em células ósseas específicas em modelos de camundongos geneticamente modificados ou em modelos de doenças.
O protocolo descrito aqui é focado em ossos de camundongos, mas pode ser usado para estudar in situ uma expressão genética em células de qualquer tecido duro em qualquer espécie. Ajudando a demonstrar este procedimento, será Christiane Schueler, uma técnica do meu laboratório. Depois de eutanásia camundongos por exsanguinação sob anestesia geral, remova os fêmures inteiros rapidamente.
Use um bisturi e toalhas de papel para limpar os fêmures dos tecidos moles circundantes. Em seguida, despeje o composto de temperatura de corte ideal no molde de incorporação e coloque os fêmures na parte inferior dos moldes de incorporação. Es clique para congelar as amostras em nitrogênio líquido.
Uma vez que as amostras estejam totalmente congeladas, enrole-as em papel alumínio e transfira-as em gelo seco para um congelador. Armazená-los a menos 80 graus Celsius até que estejam prontos para mais processamento. Primeiro, coloque a temperatura no criostat para menos 19 graus Celsius e a temperatura do suporte do bloco para menos 17 graus Celsius.
Em seguida, limpe o interior do criostat com 70% de etanol. Coloque a lâmina descartável para tecidos duros, as lâminas de vidro e uma ferramenta de encaixe no criostat para esfriar, e mantenha-as dentro do criostat durante a secção. Transfira o bloco de tecido congelado no gelo seco para o criostat e deixe equilibrar por pelo menos 10 minutos.
Em seguida, pressione a parte inferior do molde de incorporação para empurrar o bloco OCT para fora do molde. Aplique o meio OCT suficiente ao titular do bloco para aderir ao bloco e esperar até que o meio OCT congele completamente. Depois disso, coloque o suporte do bloco no suporte do objeto e aperte-o no lugar.
Ajuste a posição da lâmina e corte o bloco em incrementos de corte de 15 micrômetros para remover o OCT que cobre a amostra. Ajuste o criostat para gerar seções de oito micrômetros e corte de duas a três crioseções que serão descartadas. Coloque a filme adesivo no bloco e use a ferramenta de montagem para aderir o filme ao bloco.
Agora, faça um corte devagar e em constante velocidade, enquanto segura a seção pelo filme. Coloque o filme com a amostra virada para cima em um deslizamento de vidro pré-resfriado na criobar dentro do criostat para evitar o descongelamento da amostra. Use fita para fixar o filme no slide de vidro para facilitar a coloração.
Em um capô de fumaça, prepare as soluções necessárias de etanol, água sem RNase e xileno no gelo, conforme descrito no protocolo de texto. Incubar as seções em 95% de etanol por 30 segundos. Em seguida, mergulhe cuidadosamente as seções em água sem RNase por 30 segundos para remover completamente o OCT.
Em seguida, dispense 50 microliters de mancha de seção congelada LCM comercial na seção e incubar à temperatura ambiente por 10 segundos. Escorra a seção colocando a borda do slide em papel de tecido absorvente. Enxágüe a seção em 100% etanol por 30 segundos para remover qualquer excesso de mancha.
Mergulhe as seções ósseas em um segundo tubo contendo 100% de etanol por 30 segundos e, em seguida, transfira-as para 100% xileno por 30 segundos. Coloque a película adesiva em uma lâmina de vidro seca como suporte, tomando o cuidado de colocar o filme o mais plano possível. Depois disso, coloque uma lâmina de membrana PET na película e pressione brevemente um dedo enluvado na membrana para anexá-lo ao filme.
Esta amostra será sanduíche entre a membrana e o filme adesivo. O filme adesivo não deve ser dobrado ou enrugado e não deve haver bolhas de ar entre o filme e a membrana. Comece usando descontaminante de superfície para limpar o suporte da tampa final do estágio.
Carregue o slide no suporte de slides e nas tampas no suporte da tampa. Em seguida, ajuste o foco e adquira uma visão geral de slides com o objetivo de 1,25x. Mude para o objetivo de 40x e ajuste o foco.
Usando a visão geral do slide, escolha a área de interesse. Em seguida, ajuste os parâmetros de laser como mostrado aqui, certificando-se de otimizar esses parâmetros para cada objetivo. Se o laser não cortar a amostra, aumente a potência do laser.
Selecione osteoblasto, osteocites e células de revestimento ósseo em osso têmicos e cortical com base em critérios morfológicos. Desenhe uma linha para o caminho laser mais longe das células alvo para minimizar os danos causados pelo laser UV. Se o laser não cortar a amostra, aplique o laser mais de uma vez ou inspecione o alvo em busca de pontos de cortes incompletos e use a opção de movimento e corte para cortar o tecido nessas manchas.
Colete cada tipo de célula em uma tampa de tubo separada de 0,5 mililitro. Primeiro, dispense 50 microliters do tampão de lise contendo mercaptoetanol beta na tampa do tubo de coleta. Lyse a amostra, pippetando-a para cima e para baixo na tampa por um minuto.
Em seguida, gire o lise e adicione 00 microliters do tampão de lise contendo beta-mercaptoetanol ao tubo. Para cada slide, prepare um tubo de microcentrifuuge rotulado com 350 microliters do tampão de lise contendo mercaptoetanol beta. Use as seções restantes após o LCM para extrair RNA.
Separe cuidadosamente o filme da membrana elise a amostra, deslizando lentamente o tampão de lise para a seção várias vezes. Em seguida, coloque as amostras de lise em gelo seco e armazene-as a menos 80 graus Celsius. Quando estiver pronto para continuar, descongele os lises à temperatura ambiente.
Depois disso, transfira os lises das células colhidas por LCM nos tubos de coleta para novos tubos de microcentrífugo de 1,5 mililitro e extraia RNA de acordo com as instruções do fabricante. Neste estudo, um protocolo LCM é desenvolvido para obter quantidade suficiente de RNA de alta qualidade para análise de expressão genética em células ósseas de fêmures de camundongos. O LCM é realizado utilizando um sistema LCM que utiliza gravidade para coleta de amostras.
O rendimento e integridade do RNA isolado foi medido por meio da eletroforese microcapilaria. A diferença na qualidade e quantidade de RNA obtidas utilizando diferentes protocolos de lise pode ser vista aqui no gel representativo e eletroferógramas. Quando a amostra é lívoluica por pippetting para cima e para baixo na tampa por um minuto, é possível isolar aproximadamente 8,5 nanogramas de RNA de um milímetro quadrado de tecido ósseo microdissectado.
O valor rin é 8,60. Alternativamente, o LCM é realizado usando um sistema LCM que usa um pulso laser desfocado, que catapulta o material para a tampa adesiva pendente. Para ossos congelados frescos, é possível isolar aproximadamente 1,6 nanogramas de RNA de um milímetro quadrado de tecido ósseo microdisstado.
O valor rin é um. Em conclusão, as coisas mais importantes a serem lembradas neste procedimento são aplicar o protocolo permanente da maneira correta, evitar o a seco completo das seções no complexo do sanduíche, usar um sistema LCM adequado e não exceder os prazos para a colheita das células. Uma vez que você tenha isolado o RNA das células capturadas, você pode usar o RNA para perfil de expressão, por exemplo, por RNA seek.
Finalmente, gostaríamos de lembrá-lo que xileno e beta-mercaptoetanol são substâncias perigosas que precisam ser manuseadas sob um capô. Além disso, tome as precauções apropriadas ao manusear nitrogênio líquido e também as lâminas criotome.
