Estamos apresentando patologia de expansão, ou ExPath, para abreviar, uma medida de baixo custo para biomolécula de imagem de interesse nas seções de tecido clínico padrão, com precisão nanoescala. O ExPath contorna o limite de difração da microscopia de luz convencional infundindo quimicamente a seção de tecido clínico com um hidrogel inchar água e, em seguida, expandindo fisicamente e uniformemente as amostras tratadas em cerca de cem vezes, permitindo que biomoléculas rotuladas fluorescentes anteriormente fossem separadas e observadas com um microscópio óptico convencional. O ExPath permite que os usuários estudem configurações nano escala de biomoléculas relacionadas a doenças em amostras de tecido, sem precisar investir em novos hardwares de imagem.
Assim, possibilitando novos insights sobre a doença e promovendo novos diagnósticos. Este método pode ser aplicado a uma ampla gama de tipos de tecidos e ser usado para fornecer uma nova visão sobre a patogênese de várias doenças complexas, como câncer, doença cerebral, doenças autoimunes, entre outras. A demonstração visual é importante para ilustrar como fazer as etapas críticas corretamente, como a construção da câmara de gelagem e o manuseio da amostra em gelada antes e depois da digestão Proteinase K.
Comece convertendo o tecido de interesse em um formato compatível com ExPath. Se trabalhar com amostras clínicas FFPE, coloque o slide com a amostra em um tubo cônico de 50ml e adicione 15ml de Zylene. Tampe o tubo e coloque-o horizontalmente em um agitador orbital a aproximadamente 60rpm por três minutos.
Repita a lavagem com mais 15 ml de Zylene. Em seguida, lave o slide em uma série de diluições de etanol, de acordo com as instruções do manuscrito. Se trabalhar com lâminas permanentes manchadas e montadas, coloque cada slide em um tubo cônico de 50ml e cubra-o com Zylene.
Remova cuidadosamente o deslizamento da tampa com uma lâmina de barbear. Em seguida, processe o slide da mesma forma que as amostras clínicas ffpe. Se trabalhar com lâminas de tecido congelado não fixadas na solução OCT, fixe o tecido em acetona a 20 graus Celsius por dez minutos e, em seguida, lave as amostras com solução 1X PBS três vezes por dez minutos por lavagem.
Se processar amostras clínicas previamente fixas e congeladas, deixe os slides por dois minutos à temperatura ambiente para derreter a solução OTC e, em seguida, lave a amostra com 1X PBS três vezes, por cinco minutos por lavagem. Após a conversão do formato, realize a recuperação de antígenos em todas as amostras. Aqueça a solução de citrato de 20 milimolas a 100 graus Celsius em um micro-ondas e coloque o slide na solução.
Transfira imediatamente o recipiente para uma câmara de incubação e incuba-o a 60 graus Celsius por trinta minutos. Para colorir a amostra, use uma caneta hidrofóbica para desenhar um limite ao redor da seção tecidual na lâmina. Coloque o slide em uma placa de petri e, em seguida, incubar o tecido com tampão de bloqueio por uma hora a 30 graus Celsius.
Em seguida, incubar os tecidos com a solução de anticorpos primários por pelo menos três horas em temperatura ambiente ou 37 graus Celsius. Após a incubação, lave o tecido três vezes com tampão de bloqueio e incuba-o em solução secundária de anticorpos por pelo menos uma hora em temperatura ambiente, ou 37 graus Celsius. Repita as lavagens com o buffer de bloqueio e realize imagens fluorescentes, usando um microscópio convencional de campo largo ou outro sistema de imagem de escolha.
Prepare a solução de ancoragem de acordo com as instruções do manuscrito. Coloque os slides em uma placa de petri de 100 ml, encoste a solução de ancoragem sobre o tecido e incuba-os por pelo menos três horas em temperatura ambiente. Em seguida, prepare a solução de gelagem de acordo com as instruções do manuscrito.
Remova a solução de ancoragem em excesso da seção tecidual e coloque o slide de volta na placa de petri. Adicione a solução de gelagem fria fresca à amostra e incubar a mistura por trinta minutos, a quatro graus Celsius. Para construir uma câmara no slide ao redor da amostra, crie espaçadores cortando finamente pedaços de vidro de cobertura com uma faca de diamante.
Fixar os espaçadores em ambos os lados do tecido com água e coloque cuidadosamente uma tampa de vidro sobre a lâmina, certificando-se de evitar prender bolhas de ar sobre o tecido. Em seguida, incubar a amostra a 37 graus Celsius em um ambiente umidificado por duas horas. Remova a tampa da câmara de gelagem deslizando suavemente uma lâmina de barbear sob a mancha e levantando-a lentamente da superfície do gel.
Corte o gel em branco ao redor do tecido para minimizar o volume, certificando-se de cortar o gel assimétricamente para acompanhar a orientação. Diluir Proteinase K um a duzentos em tampão de digestão, certificando-se de preparar solução suficiente para submergir completamente o gel. Em seguida, incubar a amostra com a solução em um recipiente fechado por três horas a 60 graus Celsius.
Se a amostra não se soltar durante a digestão, use uma lâmina de barbear para removê-la suavemente. Use uma escova de tinta macia para transferir a amostra para 1X PBS em um recipiente compatível com o sistema de imagem desejado e grande o suficiente para acomodar o gel totalmente expandido. Lave a amostra em PBS por dez minutos e, se desejar, restainá-la com DAPI de 300 milimôlares.
Expanda as amostras lavando a amostra com um volume excessivo de água dupla destilada três a cinco vezes por dez minutos por lavagem. Então, realize imagens de fluorescência. Se este protocolo for realizado com sucesso, as amostras aparecem como um gel plano e transparente após a homogeneização mecânica e podem se expandir por um fator de 3 a 4,5 na água.
Uma amostra de rim FFPE de cinco micrômetros de espessura foi expandida 4,5 vezes, o que resultou em uma resolução de 63 nanômetros utilizando um objetivo de NA 0,95. O tecido foi então convertido em um formato compatível com patologia de expansão e manchado com anticorpos para Alpha Actinin 4 e Vimentin, DAPI para visualizar DNA nuclear, e Wheat Germa Glutenin para rotular carboidratos. A microscopia confocal do disco giratório foi então usada para a imagem do espécime.
O tecido renal foi então totalmente expandido em água e imagem novamente. Rachaduras, distorções e perda de alvos rotulados podem ser resultado de ancoragem ou homogeneização inadequadas. Hematoxylin e eosina manchadas de tecido mamário normal foram tratados como uma amostra ffpe, expandida, rotulada com DAPI, e imageda em um microscópio confocal de disco giratório.
Fatias de rim não fixadas e congeladas também foram processadas usando este protocolo. O tecido foi fixado em acetona fria e manchado com Alpha Actinin 4, Vimentin, DAPI e Wheat Germa Glutenin. Ao executar essa técnica, é importante lembrar que o tempo da etapa de gelação é fundamental.
A gelação prematura pode causar distorções, limitar a expansão e resultar na perda de moléculas-alvo. Após este procedimento, a imagem fluorescente pode ser realizada em um microscópio após a digestão e expansão da amostra. O ExPath pode ser aplicado amplamente em patologias e além.
Como permite aos pesquisadores visualizar detalhes sutis nas amostras de tecido de interesse. Portanto, pode ajudar os pesquisadores a obter novas percepções sobre a patogênese de doenças ou mecanismos de processos biológicos.
