Este protocolo explica a fabricação de microesferas, que serão usadas para ajudar a controlar a taxa de liberação e a quantidade de amiloide que é uma proteína de interesse. As microesferas imobilizarão as células em um biomamaterial adequado e as abrigarão de seu ambiente circundante, além de permitir que elas troquem subprodutos e nutrientes com seu ambiente circundante. Encapsular células usando essa técnica garante um controle rigoroso do tamanho das microesferas, bem como do número de células, e fazemos isso ajustando vários parâmetros de fabricação.
Assim, encapsular as células descritas neste protocolo nos dará mais de uma liberação crônica de amiloide para usar em sistemas in vitro e in vivo, e a ideia seria que isso nos daria uma melhor compreensão dos mecanismos da doença e também nos permitiria testar novos tratamentos. Este método pode ser usado para formular sistema controlado e estudar a liberação de quaisquer biomoléculas para muitos tipos de células, seja sozinha ou em combinação. Para começar, remova um frasco quase confluente da incubadora.
Trate as células com solução 0,25% trypsin-EDTA e incubar a 37 C por cinco a 10 minutos para desprender as células. Depois de adicionar o meio DMEM/F12, colete as células em um tubo de 50 mililitros. Centrifugar as células a 1000 RPM por cinco minutos.
Remova o supernatante e suspenda novamente a pelota no soro fisiológico tamponado hepes para dobrar a concentração celular final desejada. Em um tubo de centrífuga de 50 mililitros, misture esta suspensão celular em uma relação de um para um com solução de alginato de peso e volume de 4% para obter uma suspensão final contendo a concentração celular desejada em uma solução de alginato de peso e volume de 2%. Para definir os parâmetros de encapsulamento, defina a velocidade da máquina do encapsulador à velocidade máxima de extrusão e, em seguida, defina a tensão e a frequência.
Para fabricar as microesferas, em uma seringa de 20 mililitros, carregue cinco mililitros da suspensão de alginato celular e conecte uma seringa ao encapsulador. Para iniciar o encapsulador, ative o fluxo que empurrará a suspensão de alginato celular através do alimentador, e um fluxo de gotículas será extrudado através do bocal. Colete o primeiro mililitro no béquer de resíduos para evitar o fluxo inicial não uniforme.
Em seguida, continue a executar os quatro mililitros restantes permitindo que as gotículas caiam no banho de gelação de cloreto de cálcio. Após o contato com o banho de gelação, o alginato nas gotículas cruza instantaneamente com os íons de cálcio no banho de gelação, formando microesferas. Após um minuto, remova o béquer de gelação da plataforma magnética e deixe que as microesferas descansem por mais quatro minutos sem agitação para completar sua gelação em temperatura ambiente.
Para recuperar as microesferas, primeiro use um par de pinças estéreis para remover quaisquer detritos ou artefatos grandes alginatos. Depois de cortar a ponta de uma pipeta plástica, use-a para transferir as microesferas do banho de gelação para um filtro de malha de 74 micrômetros mantido sobre um béquer de resíduo. Para garantir o sucesso, sempre cortamos a ponta de uma pipeta de plástico para evitar danificar as microesferas e fazemos isso toda vez que transferimos contas de um vaso para outro após o encapsulamento.
Inverta o filtro de malha sobre um tubo de centrífuga. Pipeta o meio de cultura apropriado sobre ele para lavar as contas pelo tubo e permitir que elas se equilibrem nesse meio por cinco minutos. Em seguida, transfira-os para um frasco previamente preenchido com o meio apropriado para incubação e outros experimentos.
Para avaliar a viabilidade celular após o encapsulamento e cultura, adicione a mistura de dissolução para interromper suavemente as microesferas e liberar as células encapsuladas. Incubar as células em uma incubadora de cultura celular suplementada com 5% de dióxido de carbono a 37 C por 10 minutos com agitação suave. Estimar a viabilidade celular dessas células colorindo-as com azul tripano e usando uma câmara hemócica.
Para avaliar a estabilidade das microesferas, meça o diâmetro médio de uma amostra de cada população de microesferas ao longo de um curso de tempo usando um microscópio e um software de imagem. Após a preparação, microesferas uniformes e esféricas foram geradas com sucesso usando este protocolo. Após um dia em condições padrão de cultura celular, células encapsuladas 7PA2 foram distribuídas uniformemente em microesferas.
Quando a proliferação de células 7PA2 foi testada por meio de um ensaio MTS, não houve diferença significativa entre o comportamento das células 7PA2 cultivadas com ou sem alginato durante um período de sete dias. As mídias condicionadas analisadas a partir de culturas 2D e 3D de células 7PA2 revelaram um aumento constante nos níveis amilóide-beta 1-42 em ambas as culturas. A taxa de liberação de amilóide-beta 1-42 de microesferas, ou cultura 3D, é semelhante no perfil ao liberado da cultura 2D.
As células 7PA2 encapsuladas em microesferas alginatos podem ser efetivamente usadas para a liberação sustentada de amilóide-beta. Microesferas para enxerto no cérebro de rato devem ser pequenas o suficiente para serem incorporadas sem criar uma lesão grande. Implantar uma conta de escala milimétrica dentro do cérebro para fins in vivo não funcionaria, enquanto uma microesfera fabricada usando este protocolo tem um tamanho adequado para inserção dentro do hipocampo do rato.
Para ter certeza de que temos uma distribuição uniforme de células no produto final, é importante misturar completamente as células na suspensão de alginato celular, e isso garante a liberação uniforme de amiloide de cada microesfera.
