A radioterapia é mais frequentemente entregue usando aceleradores lineares. Este protocolo permite que os pesquisadores avaliem os efeitos biológicos da radiação nas células usando um acelerador linear. A vantagem dessa técnica é que, usando um acelerador linear, os pesquisadores podem estudar uma ampla gama de doses e taxas de dose clinicamente relevantes.
Além disso, este protocolo pode ser usado para todos os tipos de células cancerosas. Este método pode ser realizado usando equipamentos semelhantes aos mostrados aqui. Por exemplo, aceleradores lineares fabricados por outros fornecedores.
Indivíduos não experientes na realização de cálculos dosimétricos usando um acelerador linear podem ter dificuldade em calcular o número correto de unidades monitoras necessárias para entregar a dose desejada à amostra. Eles se beneficiariam buscando conselhos de um físico médico de experiência ou dosimetrista. Entregar a dose à amostra com precisão usando um acelerador linear requer uma colocação cuidadosa.
Dois dias antes da irradiação programada, trabalhando em uma capa de cultura, use uma pipeta de cinco mililitros estéreis para coletar células de glioma semelhantes a troncos de uma placa de cultura em um tubo de centrífuga de 15 mililitros. Centrifugar as células a 200 vezes g por três minutos em uma centrífuga de bancada. Descarte o supernasce e resuspenque a pelota celular com um mililitro de trippsin-EDTA.
Incubar à temperatura ambiente por cinco minutos para digerir a pelota e fazer uma única suspensão celular em trypsin-EDTA. A cada dois minutos durante a digestão, agite suavemente o fundo do tubo de centrífuga para certificar-se de que as células estão completamente digeridas. Em seguida, adicione três mililitros de mídia de cultura de células-tronco para saciar trippsina, misturar suavemente e centrífuga a 200 vezes g por três minutos em uma centrífuga de bancada.
Depois de descartar o supernascimento, resuspenque a pelota celular com cinco mililitros de mídia de cultura celular e conte as células com um hemótmetro. Placa de cinco milhões de células divididas em duas placas de 10 centímetros contendo 10 mililitros de mídia de cultura celular e incubar 48 horas a 37 graus Celsius. Logo antes da irradiação programada, recolham as células e a centrífuga como feito antes.
Descarte o supernatante e resuspenque a pelota celular com cinco mililitros de mídia de cultura celular. Transfira um mililitro de suspensão celular para uma placa de 35 milímetros contendo dois mililitros de cultura celular, certificando-se de que o meio atinja uma altura de um centímetro. Transfira as células banhadas para um recipiente secundário para reduzir o risco de contaminação e leve as células do recipiente em um carrinho de utilidade para a instalação de irradiação para irradiar as células.
Um dia antes da irradiação, trabalhando na capa de cultura celular, use uma pipeta Pasteur conectada a um vácuo para remover o meio DMEM da placa de cultura celular para a linha celular anexada. Em seguida, lave as células com cinco mililitros de PBS estéreis para enxaguar o meio residual. Adicione um mililitro de trypsin-EDTA no prato de cultura e incline suavemente a placa de cultura para ter certeza de que todo o prato está coberto.
Depois de incubar à temperatura ambiente por cinco minutos, sacie a reação trypsin-EDTA com três mililitros de mídia DMEM. Use uma pipeta de cinco mililitros para coletar as células em tubo de centrífuga de 15 mililitros, centrífuga e, em seguida, cultivar as células como descrito no manuscrito. Para irradiar essas células previamente preparadas usando o software de console do LINAC, defina o pórtico e o colisador do acelerador em zero graus, abra as mandíbulas x e y para um tamanho de campo simétrico de cinco por cinco centímetros quadrados, e retraia os collimadores multileaf.
Adicione pelo menos cinco centímetros de material equivalente à água no sofá do tratamento e coloque o prato celular para ser irradiado sobre ele no centro da mira do LINAC. Coloque as células em uma profundidade de dose máxima em um raio-X de seis megavolt em torno de 1,5 centímetros e adicione um centímetro adicional de material equivalente à água em cima do prato. Afixe o ponteiro dianteiro na cabeça do LINAC e estenda-o até que toque a superfície do material de acúmulo.
Ajuste a altura da mesa até que a distância da fonte até a superfície de acúmulo seja de 100 centímetros. Deixe o cofre de tratamento, certificando-se de que todos os outros indivíduos tenham partido. Verifique se não há outras células na sala e feche a porta do cofre.
Confirme o tamanho do campo, monitore as unidades e monitore unidades por minuto no console e, em seguida, habilite o feixe para uma célula de radiação. Três amostras de células-tronco glioma foram preparadas usando este protocolo e coletadas 24 horas após a irradiação. Lá, os perfis de ciclo celular foram calculados e mostrados com os percentuais de células em diferentes fases do ciclo celular.
A detenção do ciclo celular G2 foi observada após a irradiação de células-tronco glioma com uma taxa de dose padrão ou uma taxa de dose extra alta, em comparação com células de controle não irradiadas. Para ter a dose certa entregue, é mais importante medir a altura da mídia no prato de cultura para garantir que ela atinja um centímetro. Após esse procedimento, outros ensaios biológicos podem ser realizados, como imunostaining, mancha ocidental e análise do ciclo celular.
Uma vez que este procedimento fornece aos pesquisadores configurações clinicamente relevantes de dose e taxa de dose, ele pode ser usado para avaliar o efeito de radiação em muitos modelos baseados na cultura celular.
