La radioterapia se administra con mayor frecuencia mediante aceleradores lineales. Este protocolo permite a los investigadores evaluar los efectos biológicos de la radiación en las células utilizando un acelerador lineal. La ventaja de esta técnica es que mediante el uso de un acelerador lineal, los investigadores pueden estudiar una amplia gama de dosis clínicamente relevantes y tasas de dosis.
Además, este protocolo se puede utilizar para todo tipo de células cancerosas. Este método se puede realizar utilizando equipos similares al que se muestra aquí. Por ejemplo, aceleradores lineales fabricados por otros proveedores.
Las personas que no tienen experiencia en la realización de cálculos dosimétricos utilizando un acelerador lineal pueden tener dificultades para calcular el número correcto de unidades de monitor necesarias para administrar la dosis deseada a la muestra. Se beneficiarían buscando consejo de una experiencia físico médico o dosimetrista. La entrega de dosis a la muestra con precisión utilizando un acelerador lineal requiere una colocación cuidadosa.
Dos días antes de la irradiación programada, trabajando en una campana de cultivo, utilice una pipeta estéril de cinco mililitros para recoger células similares al tallo del glioma de una placa de cultivo en un tubo centrífugo de 15 mililitros. Centrifugar las células a 200 veces g durante tres minutos en una centrífuga de encimera. Deseche el sobrenadante y resuspendir el pellet celular con un mililitro de trippsina-EDTA.
Incubar a temperatura ambiente durante cinco minutos para digerir el pellet y hacer una suspensión de una sola célula en trippsina-EDTA. Cada dos minutos durante la digestión, agita suavemente la parte inferior del tubo centrífugo para asegurarte de que las células se digieren a fondo. Luego agregue tres mililitros de medios de cultivo de células madre para apagar la trippsina, mezclar suavemente y centrífuir a 200 veces g durante tres minutos en una centrífuga de encimera.
Después de descartar el sobrenadante, resuspender el pellet celular con cinco mililitros de medios de cultivo celular y contar las células con un hemocitometro. Placa cinco millones de células divididas en dos placas de 10 centímetros que contienen 10 mililitros de medios de cultivo celular e incubar 48 horas a 37 grados centígrados. Justo antes de la irradiación programada, recoja las células y centrifugar como se había hecho antes.
Deseche el sobrenadante y resusppend el pellet celular con cinco mililitros de medios de cultivo celular. Transfiera un mililitro de suspensión celular a una placa de 35 milímetros que contenga dos mililitros de medio de cultivo celular, asegurándose de que el medio alcance una altura de un centímetro. Transfiera las células chapadas a un recipiente secundario para reducir el riesgo de contaminación y llevar las células en el recipiente de un carro de servicios públicos a la instalación de irradiación para irradiar las células.
Un día antes de la irradiación, trabajando en la campana de cultivo celular, utilice una pipeta Pasteur conectada a un vacío para eliminar el medio DMEM de la placa de cultivo celular a la línea celular conectada. Luego lave las células con cinco mililitros de PBS estéril para enjuagar el medio residual. Agregue un mililitro de trippsina-EDTA en el plato de cultivo e incline suavemente la placa de cultivo para asegurarse de que todo el plato esté cubierto.
Después de incubar a temperatura ambiente durante cinco minutos, apague la reacción de la trippsina-EDTA con tres mililitros de medios DMEM. Utilice una pipeta de cinco mililitros para recoger las células en un tubo de centrífuga de 15 mililitros, centrífuga y luego escalculó las células como se describe en el manuscrito. Para irradiar estas celdas previamente preparadas utilizando el software de consola de la LINAC, establezca el pórtico y el colimador del acelerador en cero grados, abra las mandíbulas x e y a un tamaño de campo simétrico de cinco por cinco centímetros cuadrados y retraiga los colimadores multileaf.
Agregue al menos cinco centímetros de material equivalente al agua en el sofá de tratamiento y coloque la placa celular que se va a irradiar en el centro del punto de mira LINAC. Coloque las células a una profundidad de dosis máxima en un haz de rayos X de seis megavoltas alrededor de 1,5 centímetros y agregue un centímetro adicional de material equivalente al agua en la parte superior del plato. Fije el puntero frontal a la cabeza del LINAC y extiéjelo hasta que toque la superficie del material de acumulación.
Ajuste la altura de la tabla hasta que la distancia desde la fuente hasta la superficie de acumulación sea de 100 centímetros. Salga de la bóveda de tratamiento, asegurándose de que todas las demás personas se hayan ido. Compruebe que no haya otras celdas en la habitación y, a continuación, cierre la puerta de la bóveda.
Confirme el tamaño del campo, las unidades de supervisión y las unidades de monitor por minuto en la consola y, a continuación, habilite el haz para una célula de radiación. Tres muestras de células similares al tallo de glioma se prepararon utilizando este protocolo y se recogieron 24 horas después de la irradiación. Allí se calcularon perfiles de ciclo celular y se mostraron con los porcentajes de células en diferentes fases del ciclo celular.
Se observó la detención del ciclo celular G2 después de la irradiación de células madre de glioma con una tasa de dosis estándar o una tasa de dosis extra alta, en comparación con las células de control no irradiadas. Con el fin de que se administra la dosis correcta, es más importante medir la altura de los medios en el plato de cultivo para asegurarse de que alcanza un centímetro. Después de este procedimiento, se pueden realizar otros ensayos biológicos, como la inmunostaining, la mancha occidental y el análisis del ciclo celular.
Dado que este procedimiento proporciona a los investigadores ajustes clínicamente relevantes de la dosis y la tasa de dosis, se puede utilizar para evaluar el efecto de radiación en muchos modelos basados en cultivos celulares.
