Este protocolo mostra que é possível gerar novos neurônios diretamente no cérebro a partir de glia residente e que essas células reprogramadas amadurecem em neurônios específicos do subtipo. A principal vantagem é o vírus AAV dependente de cre que permite o direcionamento específico do NG2-glia e do repórter GFP que rotula os neurônios reprogramados para análise. Gerar novos neurônios no cérebro pode levar ao desenvolvimento futuro de terapias de substituição celular no cérebro.
Em nosso protocolo, geramos os interneurônios parvalbumin-positivos que têm implicações para transtornos psiquiátricos. A reprogramação in vivo pode ser aplicada a outras áreas cerebrais e circuitos, dependendo do fenótipo neuronal e da condição neurológica que você deseja atingir. O procedimento será Jenny Johansson:a técnica, Maria Pereira: ex-doutoranda, e Marcella Birtele: doutoranda em nosso laboratório.
Para produzir vetor viral AAV5, as células hek293T com meio de cultura padrão em cinco frascos T175. Quando as células atingirem 50 a 70% de confluência, prepare a seguinte mistura para transvecção. Em um tubo de centrífuga de 50 mililitros, adicione quantidades molares iguais de plasmídeo vetor e plasmídeo de ajudante da série pDG.
Adicione o buffer Tris-EDTA a um volume final de 144 microliters e adicione água ultrauso para resultar em um volume total de 1296 microliters e misturar. Em seguida, adicione 144 microliters de 2,5 cloreto de cálcio molar e misture. Depois disso, adicione 1,92 mililitros de HBS à solução de DNA e vórtice imediatamente.
Incubar em temperatura ambiente por exatamente 60 segundos. Posteriormente, transfira a solução para 28 mililitros de cultura celular fresca e misture. Substitua o meio nos frascos pelo mix de transvecção médio contendo.
Espere três dias, e transfira a mídia para o lixo. Adicione cinco mililitros de tampão de colheita a cada frasco, em seguida, adicione outros quatro mililitros de DPBS a cada frasco para enxaguar as células restantes e pool com a solução celular. Centrifugar as células colhidas a 1.000 x g por cinco minutos a quatro graus Celsius.
Após a centrifugação, remova o supernasce e dissolva a pelota em 15 mililitros de tampão de lise. Congele o tubo de centrífuga de 50 mililitros em gelo seco por 15 minutos e armazene em um congelador de menos 20 graus Celsius. Antes do uso, descongele a célula colhida em um banho de água a 37 graus Celsius.
Neste procedimento, realize a purificação de AAV por ultracentrifugação de gradiente iodixanol e use tubos de teto ultracentrifuuge com centrifugação a 350,000 x g durante uma hora e 45 minutos à temperatura ambiente. Para extrair a fase contendo AAV, insira uma seringa de 10 mililitros com uma agulha de calibre 18 a cerca de dois milímetros abaixo da borda da fase de 40 a 60% com o bisel voltado para cima e retire. Certifique-se de parar antes de chegar à faixa proteica depois que cinco a seis mililitros do vetor viral foram extraídos.
Em seguida, purfique e concentre o gradiente iodixanol diluído através de um filtro de troca de ânion, empurrando-o através de uma taxa não mais rápida do que uma gota por segundo. Posteriormente, empurre três mililitros de tampão IE lentamente através do filtro para lavá-lo. Em seguida, elute a mistura em uma unidade de filtro centrífuga com um a dois mililitros de tampão de eluição.
Adicione DPBS ao dispositivo a um volume final de quatro mililitros. Centrifugar a 2.000 x g em temperatura ambiente até que menos de 0,5 mililitros de DPBS seja deixado no filtro. Depois, remova o líquido da parte inferior do tubo, rechee com quatro mililitros de DPBS e centrífuga novamente.
Repita esta etapa mais duas vezes, certifique-se de que o volume de vetor concentrado no filtro seja de cerca de 200 microliters após a última centrifugação. Remova o vetor concentrado de 200 microliter usando uma pipeta e empurre-o através de um filtro de 0,22 micrômetro para esterilizar. Em seguida, alíquota de 200 microliters em um frasco de vidro com inserção intertravada.
Para injetar fatores de reprogramação, coloque um mouse anestesiado no quadro estereotaxista. Administre analgesia apropriada no início da cirurgia, em seguida, traga a ponta do capilar de vidro da agulha de injeção logo acima de bregma. Certifique-se de que a ponta capilar está perfeitamente reta em ambos os planos A-P e M-L.
Redefinir os valores M-L e A-P para 0,0 no contador de coordenadas digitais. Para ter certeza de que a cabeça do animal está em uma posição perfeitamente plana, use o contador de coordenadas digital para medir o valor da coordenada D-V quando o braço A-P estiver em mais 2.0 e menos 2.0, bem como quando o braço M-L estiver em mais 2,0 e menos 2.0. Ajuste a altura da barra de dente e as barras de ouvido em conformidade.
Depois, levante ligeiramente a seringa e faça um furo usando uma broca dentária nas coordenadas de injeção. Comece a perfurar no local, trabalhando de forma circular e suave. Em seguida, coloque um pedaço de gaze de algodão sobre a incisão aberta e lave a seringa com solução salina.
Após a descarga, elave uma bolha de ar e, em seguida, um microliter de solução contendo o vetor viral. Certifique-se de que a solução viral pode ser facilmente visualizada abaixo da bolha de ar. Em seguida, abaixe a seringa, progredindo lentamente até a profundidade desejada, e certifique-se de que a trajetória está livre de fragmentos ósseos.
Posteriormente, injete um microliter da solução viral a uma taxa de 0,4 microliters por minuto. Quando a injeção estiver pronta, deixe dois minutos para difusão antes da retirada da seringa. Após a difusão, retraia lentamente a seringa até que a ponta do capilar seja completamente retirada do cérebro, em seguida, sutura cuidadosamente a incisão e remova o animal do quadro estereotaxic.
Monitore o animal em uma estação pós-operatória até que a consciência seja recuperada. Os animais são mantidos por até 12 semanas após a injeção do vírus para permitir que a glia residente se reprograme em neurônios maduros. Para preparar fatias cerebrais para eletrofisiologia usando um vibratome, se sectionie o cérebro da parte mais rostral até o nível estriatal em alta velocidade.
Em seguida, se sectionia o estriato coronally a 275 micrômetros a 0,1 milímetros por segundo. Após cada seção, remova cuidadosamente o lado striatal não injetado e transfira o lado injetado em um frasco com uma rede inferior e tobosse de sentido CREB oxigenado no banho de água à temperatura ambiente. Mantenha o frasco em temperatura ambiente até que todas as seções sejam cortadas.
Depois, aumente lentamente a temperatura do banho de água para 37 graus Celsius e deixe-o por 30 minutos, depois desligue o aquecedor e deixe esfriar até a temperatura ambiente. Depois de transferir uma seção de tecido para uma câmara de gravação para eletrofisiologia, monte a pipeta de vidro no eletrodo de gravação e abaixe-a para a solução. Verifique duas vezes a resistência do eletrodo.
Em seguida, aproxime-se lentamente da célula reprogramada com a pipeta, mantendo uma leve pressão positiva no eletrodo para evitar ligar a ponta, e verifique se a célula é GFP positiva antes de corrigir. Quando a célula estiver remendada, mantenha a célula no grampo de corrente de menos 60 a menos 70 milivolts, e injete correntes de 500 milissegundos de menos 20 a mais 90 picoamperes com incrementos de 10 picoampere para induzir potenciais de ação. Isso indica uma maturação neuronal e reprogramação bem sucedida.
Posteriormente, mude para o grampo de tensão e meça o sódio interior e as correntes de potássio retificadoras atrasadas em etapas despolarizantes de 10 milivolts. Aqui está um neurônio reprogramado cheio de biocitada que mostra morfologia neuronal madura e as espinhas dendríticas registradas. Aqui, gravações eletrofisiológicas dos neurônios reprogramados mostram a presença de conexões funcionais postináspticas com medidas de atividade espontânea.
Traços mostram a atividade inibitória que está bloqueada com picrotoxina, um antagonista do receptor GABAA e a atividade excitatória que é bloqueada com CNQX, um antagonista do receptor AMPA. Os neurônios corrigidos já mostram atividade pós-sináptica em cinco semanas após a injeção, e continuam com oito e 12 semanas após a injeção. O número de neurônios com potenciais de ação induzidos atuais também aumenta com o tempo.
Uma análise mais detalhada revelou vários padrões distintos de disparo onde a maioria das células mostram atividade de espetamento rápido semelhante aos interneurônios parvalbumin. A análise imunohistoquímica em 12 semanas mostrou ainda a co-expressão do repórter GFP e do parvalbumin. Após este procedimento, você pode examinar a expressão genética com a técnica de busca de patches ou avaliar a conectividade sináptica tridimensional com rastreamento monossináptico e iDISCO.
Agora que é possível reprogramar a glia residente em interneurons expressos de parvalbumin, começamos a investigar se estes são autênticos e podem ser usados como uma ferramenta terapêutica. Lembre-se de seguir os protocolos e diretrizes estabelecidos ao manusear animais e usar o vírus AAV.
