Questo protocollo mostra che è possibile generare nuovi neuroni direttamente nel cervello dai glia residenti e che queste cellule riprogrammate maturano in neuroni specifici del sottotipo. Il vantaggio principale è il virus AAV cre-dipendente che consente il targeting specifico del NG2-glia e del reporter GFP che etichetta i neuroni riprogrammati per l'analisi. Generare nuovi neuroni nel cervello può portare allo sviluppo futuro per terapie di sostituzione cellulare nel cervello.
Nel nostro protocollo generiamo gli internauri parvalbumina-positivi che hanno implicazioni per i disturbi psichiatrici. La riprogrammazione in vivo può essere applicata ad altre aree cerebrali e circuiti a seconda del fenotipo neuronale e delle condizioni neurologiche che si desidera indirizzare. A dimostrare la procedura saranno Jenny Johansson: una tecnico, Maria Pereira: un'ex dottoranda, e Marcella Birtele: una dottoranda nel nostro laboratorio.
Per produrre vettore virale AAV5, seminare cellule HEK293T con mezzo di coltura standard in cinque mastri T175. Quando le celle raggiungono il 50-70% di confluenza, preparare il seguente mix per la trasvezione. In un tubo di centrifuga da 50 millilitri, aggiungere quantità molare uguali di plasmide vettoriale e plasmide aiutante della serie pDG.
Aggiungere il buffer Tris-EDTA a un volume finale di 144 microlitri, quindi aggiungere acqua ultrapura per ottenere un volume totale di 1296 microlitri e mescolare. Quindi, aggiungere 144 microlitri di cloruro di calcio molare 2.5 e mescolare. Successivamente, aggiungere immediatamente 1,92 millilitri di HBS alla soluzione di DNA e al vortice.
Incubare a temperatura ambiente per esattamente 60 secondi. Successivamente, trasferire la soluzione a 28 millilitri di mezzo di coltura cellulare fresco e mescolare. Sostituire il mezzo nei contenitori con il mezzo contenente miscela di trasvezione.
Aspetta tre giorni e trasferisci i media in spreco. Aggiungere cinque millilitri di tampone di raccolta a ciascun pallone, quindi aggiungere altri quattro millilitri di DPBS a ciascun pallone per risciacquare le celle rimanenti e mettere in comune con la soluzione cellulare. Centrifugare le cellule raccolte a 1.000 x g per cinque minuti a quattro gradi Celsius.
Dopo la centrifugazione, rimuovere il supernatante e sciogliere il pellet in 15 millilitri di tampone di lisi. Congelare il tubo di centrifuga da 50 millilitri sul ghiaccio secco per 15 minuti e conservare in un congelatore meno 20 gradi Celsius. Prima dell'uso, scongelare il lisato cellulare raccolto in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius.
In questa procedura, eseguire la purificazione AAV mediante ultracentrifugazione del gradiente iodixanolo e utilizzare tubi del soffitto ultracentrifugo con centrifugazione a 350,000 x g per un'ora e 45 minuti a temperatura ambiente. Per estrarre la fase contenente AAV, inserire una siringa da 10 millilitri con un ago calibro 18 a circa due millimetri sotto il bordo di fase dal 40 al 60% con la smussatura rivolta verso l'alto e ritirarsi. Assicurarsi di fermarsi prima di raggiungere la banda proteica dopo che sono stati estratti da cinque a sei millilitri del vettore virale.
Quindi, purificare e concentrare il gradiente di iodixanolo diluito attraverso un filtro di scambio di anione, spingendolo attraverso ad una velocità non più veloce di una goccia al secondo. Successivamente, spingere lentamente tre millilitri di buffer IE attraverso il filtro per lavarlo. Quindi, eludere la miscela in un'unità filtrante centrifuga con uno o due millilitri di tampone di eluizione.
Aggiungere DPBS al dispositivo a un volume finale di quattro millilitri. Centrifuga a 2.000 x g a temperatura ambiente fino a quando non vengono lasciati meno di 0,5 millilitri di DPBS nel filtro. Successivamente, rimuovere il liquido dal fondo del tubo, ricaricare con quattro millilitri di DPBS e centrifugare di nuovo.
Ripetere questo passaggio altre due volte, assicurarsi che il volume del vettore concentrato sul filtro sia di circa 200 microlitri dopo l'ultima centrifugazione. Rimuovere il vettore concentrato da 200 microliter utilizzando una pipetta e spingerlo attraverso un filtro da 0,22 micrometri per sterilizzarlo. Successivamente, aliquota 200 microlitri in una fiala di vetro con inserto interblocco.
Per iniettare fattori di riprogrammazione, posizionare un mouse anestetizzato nel fotogramma stereotassico. Somministrare un'analgesia appropriata all'inizio dell'intervento chirurgico, quindi portare la punta del capillare di vetro dell'ago di iniezione appena sopra il bregma. Assicurarsi che la punta capillare sia perfettamente dritta sia nei piani A-P che M-L.
Reimpostate entrambi i valori M-L e A-P su 0,0 nel contatore delle coordinate digitali. Per assicurarsi che la testa dell'animale sia in una posizione perfettamente piatta, utilizzare il contatore delle coordinate digitali per misurare il valore della coordinata D-V quando il braccio A-P è a più 2,0 e meno 2,0, nonché quando il braccio M-L è a più 2,0 e meno 2,0. Regolare di conseguenza l'altezza della barra dei denti e delle barre dell'orecchio.
Successivamente, sollevare leggermente la siringa e praticare un foro utilizzando un trapano dentale alle coordinate di iniezione. Inizia a trivellare nel sito, lavorando in modo circolare e delicato. Quindi, posizionare un pezzo di garza di cotone sopra l'incisione aperta e sciacquare la siringa con soluzione salina.
Dopo lo sciacquone, redigere una bolla d'aria e quindi un microlitro di soluzione contenente il vettore virale. Assicurarsi che la soluzione virale possa essere facilmente visualizzato sotto la bolla d'aria. Quindi, abbassare la siringa, procedendo lentamente alla profondità desiderata, e assicurarsi che la traiettoria sia libera da frammenti ossei.
Successivamente, iniettare un microlitro della soluzione virale ad una velocità di 0,4 microlitri al minuto. Al termine dell'iniezione, lasciare due minuti per la diffusione prima del ritiro della siringa. Dopo la diffusione, ritrarre lentamente la siringa fino a quando la punta del capillare non viene completamente ritirata dal cervello, quindi suturare attentamente l'incisione e rimuovere l'animale dal telaio stereotassico.
Monitorare l'animale in una stazione postoperatoria fino a quando la coscienza non viene riconquistata. Gli animali vengono tenuti fino a 12 settimane dopo l'iniezione di virus per consentire alla glia residente di riprogrammarsi in neuroni maturi. Per preparare le fette cerebrali per l'elettrofisiologia usando un vibratoma, sezionare il cervello dalla parte più rostrale fino al livello striato ad alta velocità.
Quindi sessò lo striato coronally a 275 micrometri a 0,1 millimetri al secondo. Dopo ogni sezione, rimuovere con cura il lato striato non iniettato e trasferire il lato iniettato in una fiala con una rete inferiore e uno scivolo di senso CREB ossigenato nel bagno d'acqua a temperatura ambiente. Mantenere la fiala a temperatura ambiente fino a quando tutte le sezioni non vengono tagliate.
Successivamente, aumentare lentamente la temperatura del bagno d'acqua a 37 gradi Celsius e lasciarlo per 30 minuti, quindi spegnere il riscaldatore e lasciarlo raffreddare a temperatura ambiente. Dopo aver trasferito una sezione di tessuto in una camera di registrazione per elettrofisiologia, montare la pipetta di vetro sull'elettrodo di registrazione e abbassarla nella soluzione. Ricontrollare la resistenza dell'elettrodo.
Quindi, avvicinarsi lentamente alla cella riprogrammata con la pipetta, mantenendo una leggera pressione positiva nell'elettrodo per evitare di tappare la punta e verificare che la cella sia positiva alla GFP prima dell'applicazione di patch. Quando la cella viene patchata, mantenere la cella nel morsetto di corrente da meno 60 a meno 70 millivolt e iniettare correnti di 500 millisecondi da meno 20 a più 90 picoampere con incrementi di 10 picoampere per indurre potenziali d'azione. Questo è indicativo di una maturazione neuronale e di una riprogrammazione riuscita.
Successivamente, passare al morsetto di tensione e misurare il sodio verso l'interno e ritardare la rettifica delle correnti di potassio a fasi depolarizzanti di 10 millivolt. Ecco un neurone riprogrammato riempito di biocitina post registrato che mostra la morfologia neuronale matura e le spine dendritiche. Qui, le registrazioni elettrofisiopatiche dei neuroni riprogrammati mostrano la presenza di connessioni funzionali postinaptiche con misure di attività spontanea.
Le tracce mostrano l'attività inibitoria che è bloccata con picrotoxina, un antagonista del recettore GABAA e l'attività eccitatoria che è bloccata con CNQX, un antagonista del recettore AMPA. I neuroni patchati mostrano già attività postsinaptica a cinque settimane dopo l'iniezione e continuano a otto e 12 settimane dopo l'iniezione. Anche il numero di neuroni con attuali potenziali di azione indotta aumenta nel tempo.
Un'analisi più dettagliata ha rivelato diversi modelli di cottura distinti in cui la maggior parte delle cellule mostra un'attività di spiking veloce simile agli internauri parvalbumina. L'analisi immunoistochimica a 12 settimane ha ulteriormente mostrato la co-espressione del reporter GFP e della parvalbumina. Seguendo questa procedura è possibile esaminare l'espressione genica con la tecnica del ricerca di patch o valutare la connettività sinaptica tridimensionale con tracciamento monosinaptico e iDISCO.
Ora che è possibile riprogrammare glia residenti in parvalbumina esprimendo internauri, abbiamo iniziato a indagare se questi sono autentici e possono essere utilizzati come strumento terapeutico. Ricordarsi di seguire i protocolli e le linee guida stabiliti quando si maneggiano animali e si utilizza il virus AAV.
