Este protocolo é significativo, pois descreve um método que pode ser usado para separar vários sinais fluorescentes em uma única amostra. Em comparação com os métodos tradicionais, a excitação-digitalização pode aumentar a velocidade do experimento e melhorar a sensibilidade dos dados. Usando diferentes fontes de iluminação, como um laser de supercontinuum, este método pode ser aplicável a sistemas de microscópio confocal de varredura de disco giratório ou laser.
Ao realizar varreduras de excitação, microscopia de imagem espectral, é importante verificar se o pico de excitação de cada rótulo fluorescente ocorre em um comprimento de onda diferente. Para começar, configure um microscópio e câmera de fluorescência invertidas, conforme descrito no protocolo de texto. Em seguida, carregue a amostra no palco.
No menu suspenso da janela principal do microgerente, selecione 475 nanômetros para visualização inicial da amostra. Em seguida, clique duas vezes na caixa ao lado da exposição e digite 100 para definir o tempo de exposição em 100 milissegundos. Por fim, clique ao vivo para ver a amostra.
Agora clique em Auto. O botão de faixa de visualização de intensidade automática para trazer os valores mínimos e máximos para faixas visuais significativas. Em seguida, use os botões de foco do microscópio para concentrar a amostra.
Uma vez em foco, ajuste a posição da amostra para que sua borda esteja no centro do campo de visão. Então ajuste o foco. A amostra está em foco quando as características de borda na imagem parecem nítidas.
Agora, abra a ferramenta de aquisição multidimensional. No menu, clique no botão de carga e escolha uma configuração predefinida contendo uma faixa de comprimento de onda apropriada para aquisição espectral. Uma vez confirmadas as configurações de aquisição, mova-se para uma região em branco da amostra e clique em adquirir para coletar uma pilha de imagens espectrais contendo fundo e ruído para usar para subtração posteriormente.
Em seguida, mova-se sobre a amostra para encontrar as regiões mais brilhantes. É provável que as amostras tenham fluorescência mais intensa longe da borda da amostra. Uma vez localizada a região mais brilhante, pegue uma única pilha de imagens.
Carregue a imagem adquirida na Imagem J e use a função de medida da Imagem J para confirmar que nenhum comprimento de onda contém pixels superexpostos. Se for necessário um tempo de exposição reduzido devido à superexposição, a imagem de fundo deve ser retomada com um novo tempo de exposição também. Se alguma das imagens estiver contendo o limite de detecção ascendente da câmera, ajuste o tempo de exposição da varredura espectral para garantir que o sinal máximo em toda a faixa espectral não exceda o alcance dinâmico da câmera.
Com um tempo de exposição apropriado agora determinado, coloque uma amostra sem rótulo no palco. Adquira dados de imagem espectral da amostra não rotulada para determinar se há alguma autofluoresência subjacente. Em seguida, coloque uma amostra de um único rótulo no palco.
Adquira dados de imagem espectral de cada uma das amostras de rótulo único para usar como controles espectrais para construir uma biblioteca espectral. Execute a varredura para cada amostra de controle usando um tempo de exposição de comprimento de onda idêntico e configurações da câmera. Em seguida, coloque um slide contendo a amostra experimental no microscópio.
Selecione um campo de visão que tenha rotulado adequadamente as células e adquira os dados de imagem espectral da amostra usando as configurações de aquisição determinadas. Corrigir imagens para uma resposta espectral plana subtraindo o espectro de fundo da imagem da amostra e multiplicando a imagem pelo coeficiente de correção. Aqui, um script MATLAB é usado para processar rapidamente as imagens.
Em seguida, gere a biblioteca espectral. Para obter melhores resultados, normalize cada membro final para a faixa de comprimento de onda de maior intensidade, determinando qual faixa de comprimento de onda tem o valor mais intenso e dividindo a medição em cada faixa de comprimento de onda por esse valor máximo. Em seguida, salve os dados espectrais como um arquivo dat.
Quando concluído, desmixe os dados de imagem espectral. A etapa desmixagem gerará uma imagem de abundância para cada rótulo fluorescente, onde a abundância é a quantidade de sinal fluorescente relativo na imagem do rótulo prospectivo. Em seguida, abra cada imagem não misturada para inspecionar visualmente a distribuição de componentes puros.
Compare a magnitude da imagem de erro com a das imagens não misturadas. Se a magnitude da imagem de erro for semelhante às imagens de abundância não misturadas, os sinais nos dados de imagem espectral podem não ser contabilizados com precisão. Finalmente, verifique se não há estruturas residuais não identificadas comparando a imagem de erro com as imagens não misturadas.
Quando realizado corretamente, o processo de desmcompra espectral permite a separação de uma pilha de imagem espectral em suas respectivas contribuições de cada rótulo de fluorescência. Aqui, um conjunto de imagens espectrais não misturadas com imagens individuais destacando a autofluorescência de células musculares lisas das vias aéreas, uma sonda GCaMP e um rótulo mitocondrial. Há um alto erro associado às regiões nucleares e perinucleares das células indicando que os espectros medidos dessas regiões não são bem contabilizados pelo espectro na biblioteca espectral.
Espectros puros coletados de células rotuladas que também são autofluorescentes provavelmente contaminarão o perfil espectral para o componente puro. Aqui, pode-se ver a diferença de descomprturação com espectro puro contaminado com autofluorescência, versus o espectro puro corrigido após subtração dimensionada. A aquisição adequada de dados é essencial quando amostras sensíveis à imagem só podem sobreviver a uma única sessão de imagem, ao contrário do fundo e controles que podem ser reimaged.
Certifique-se de que as configurações adequadas de hardware e aquisição sejam predeterminadas o máximo possível. Como próximo passo, vídeos criados a partir de dados de lapso de tempo adquiridos usando este sistema podem ser usados para rastrear fontes fluorescentes em locais discretos ao longo do tempo, como a localização do sinal de segundo mensageiro. Tome cuidado ao usar fontes de luz poderosas para evitar a exposição ocular.
Além disso, certifique-se de usar luvas adequadas ao manusear rótulos biológicos.
