Este método é útil para detectar e co-localizar vários biomarcadores em uma única criosecção, incluindo marcadores que normalmente não são detectáveis em seções de parafina. Usando este método experimental de coloração, o tempo de coloração é significativamente reduzido e o método pode ser realizado em qualquer laboratório. Demonstrando este método será Dinesh Jaishankar.
Ele é um pós-doutor qualificado do laboratório, e também o Núcleo de Avaliação de Imunoterapia, Gerente de Instalações. Ao selecionar anticorpos para a análise, considere os conjuntos de filtros de excitação e emissão disponíveis no sistema de imagem semi-automatizado. E depois de testar várias combinações de anticorpos primários conjugados fluoróforos, prepare fluoroforos para serem usados para que você tenha uma sobreposição espectral mínima como sugerido na tabela.
Para coloração multiplex, prepare um coquetel de anticorpos com fluoroforos compatíveis em delírios ótimos predeterminados e adicione o coquetel às seções de tecido de interesse. Para coloração de marcador único, adicione o anticorpo conjugado primário apenas ao slide. Para todas as manchas, inclua um controle de lâmina não manchada que passa pelo mesmo procedimento de coloração sem a adição de um anticorpo conjugado primário.
Depois de uma incubação de uma hora à temperatura ambiente protegida da luz, lave os slides duas vezes com PBS por cinco minutos por lavagem. Após a segunda lavagem, manche os slides manchados de multiplex com DAPI por sete minutos à temperatura ambiente protegidos da luz, seguido por duas lavagens de cinco minutos em PBS. Para criar uma biblioteca espectral, defina o poder da lâmpada do sistema de imagem multiespectral para 100% e abra o software operacional do microscópio.
Selecione Editar protocolo e novo protocolo. Digite um nome de protocolo e selecione Fluorescência no modo de imagem. Em seguida, forneça um nome de estudo e carregue os slides manchados no palco.
Clique em Editar exposição e use as opções de foco automático e exposição automática para ajustar os tempos de exposição e adquirir instantâneos para os slides manchados únicos. Depois de fotografar os slides manchados, salve o protocolo. E no software de aprendizado de máquina sob a guia da Biblioteca Build, carregue cada imagem manchada.
Selecione o piso apropriado e clique em Extrair. O software extrairá automaticamente o sinal fluorescente selecionado no piso. Para salvar a cor extraída, clique em Salvar para armazenar.
Um novo grupo pode ser criado ou a cor extraída pode ser armazenada em um grupo existente. Para imagens multiespectrais, uma vez que a biblioteca espectral tenha sido criada e verificada, ajuste o foco e os tempos de exposição no slide manchado multiplex como demonstrado e abra slides digitalizados para criar uma nova tarefa. Forneça um ID de slides e selecione um protocolo.
Em tarefa, selecione a varredura completa de slides para realizar uma varredura de slides inteira no slide manchado multiplex. Em toda a imagem de varredura de slides, selecione regiões de interesse através da imagem. Essas regiões serão digitalizadas usando os tempos de exposição previamente definidos no slide multiplex a ser usado para descompração e análise espectral.
No software operacional do microscópio, selecione adquirir campos MSI sob tarefa e, em seguida, clique em Process Slide para adquirir regiões de interesse em uma ampliação de 20x. Uma vez adquiridas as regiões de interesse, no software de aprendizado de máquina, clique em Arquivo e Abra sob a guia de análise manual para carregar as imagens manchadas de multiplex. Selecione a fonte da biblioteca espectral e clique em Selecionar andares para escolher a biblioteca espectral previamente salva.
Clique em Arquivo e Abra para carregar a imagem não manchada. Em seguida, clique no ícone do marcador de tinta de autofluorescência e desenhe uma linha ou região no slide não manchado para identificar a autofluorescência dentro do tecido. Em seguida, na guia Editar marcadores e cores, atribua nomes para cada marcador e clique em Preparar tudo.
Depois de verificar a imagem espectralmente não misturada, no software de aprendizado de máquina, selecione as opções de membrana de citoplasma e marcador do painel. E usando o botão elipsia, selecione usar este sinal para encontrar, para configurar o marcador para detectar os núcleos, citoplasma ou membrana. quando um marcador citoplasmado ou membrana for escolhido, selecione Usar o sinal para auxiliar na opção de divisão nuclear.
O software detectará e criará automaticamente máscaras individuais para o núcleo, citoplasma e membrana. Use a visualização de patologia para um marcador específico e as opções de configuração no software para ajustar as máscaras e clique em Segment All para criar um mapa de segmentação celular. Após a segmentação celular, selecione os marcadores para fenótipo das células positivas.
Além disso, selecione pelo menos cinco células que não estão manchadas com o marcador escolhido para fenótipo das células negativas. Em seguida, clique em Treinar Classificador para treinar o software para detectar automaticamente todas as células manchadas com os marcadores selecionados dentro da imagem. Um mapa de fenótipo será criado.
Como essas imagens demonstram, anticorpos validados para citometria de fluxo poderiam ser usados para visualizar a coloração tecidual usando o filtro de cristal líquido no sistema de imagem semi-automatizado. Aqui pode-se observar uma imagem espectralmente demilada humana congelada que inclui rotulagem de células B e células proliferantes dentro do centro germinais folicular, e a região inter folicular de células T. A opção de visualização patológica permite a visualização do padrão de coloração individual para cada marcador dentro do tecido de interesse, sugerindo que o método de coloração multiplex e a imagem espectral funcionam em tecido congelado.
Como demonstrado em uma seção de tumor de camundongos congelados, imagens multiespectrais também podem ser usadas para visualizar tumores infiltrando células T, e outras linhagens de células mieloides, incluindo macrófagos associados ao tumor. Podem ser gerados mapas de segmentação celular e fenótipo, e o número de células manchadas para cada marcador analisado pelo software, demonstrando que o software pode ser usado para quantificação da coloração multiespectral em tecidos congelados. Para alguém novo 6para a técnica, é importante conhecer as características específicas de seus fluorochromes, e preparar slides de biblioteca de qualidade para descomprturar espectral com sobreposição espectral mínima.
Também é importante realizar titulação de anticorpos. Em nossa opinião, este método pode fornecer informações sobre a eficácia da imunoterapia para câncer e outras aplicações terapêuticas, especialmente quando o tempo é essencial.
