Este método permite a geração de um grande número de progenitores de brotos de fígado humanos e células semelhantes a hepatócitos com alta pureza. A capacidade de gerar essas células hepáticas pode ser importante para a medicina regenerativa e outros campos. Ao controlar as vias de sinalização do desenvolvimento para promover a diferenciação hepática e suprimir a formação de tipos de células indesejadas, este método permite uma geração eficiente de progenitores de brotos hepáticos humanos e células semelhantes a hepatócitos por seis e 18 dias de diferenciação, respectivamente.
A principal vantagem dessa técnica é a alta pureza das células hepáticas humanas geradas. Para este procedimento, adicione 50 mililitros de IMDM a um frasco cônico contendo uma barra de agitação. Aqueça o médio a 50 graus Celsius e adicione 0,5 gramas de PVA enquanto mexe continuamente para preparar um estoque de PVA a uma concentração de 10 miligramas por mililitro.
Depois disso, remova a solução PVA da almofada de aquecimento e deixe esfriar até a temperatura ambiente. Uma vez que a solução seja resfriada, filtre-a através de um filtro estéril de 0,2 micrômetros. Prepare o CDM2 e o CDM3 combinando o PVA filtrado com outros reagentes conforme descrito na tabela um do protocolo de texto.
Use um filtro estéril de 0,2 micrômetros para filtrar todas as mídias. Em seguida, prepare as mídias de base restantes, CDM4 e CDM5, conforme descrito na tabela um do protocolo de texto. Para preparar o meio de diferenciação, primeiro descongele as pequenas moléculas congeladas e/ou fatores de crescimento à temperatura ambiente.
Aliquotar a quantidade necessária de meio base e adicionar as pequenas moléculas especificadas e fatores de crescimento ao meio base nas concentrações apropriadas. Um dia antes do uso, descongele a matriz a quatro graus Celsius. No dia seguinte, diluir a matriz em uma proporção de 1 a 100 adicionando 500 microliters de matriz em 50 mililitros de DMEM frio.
Pipeta a matriz diluída no número necessário de poços usando apenas volume suficiente de solução para cobrir a superfície do poço. Transfira a placa revestida de matriz para uma incubadora a 37 graus Celsius por pelo menos 60 minutos. Imediatamente antes da semeadura, aspire a solução matricial restante dos poços revestidos.
Em seguida, aspire o meio a partir de uma placa de cultura hPSC em grande parte confluente e adicione agente de dissociação comprado comercialmente, certificando-se de usar apenas o suficiente para cobrir a superfície em que as células estão crescendo. Incubar os hPSCs no agente de dissociação a 37 graus Celsius por cinco minutos ou até que algumas colônias comecem a se desprender. Em seguida, adicione DMEM e F-12 para diluir o agente de dissociação.
Use uma pipeta sorológica de cinco mililitros para in pipeta suavemente para cima e para baixo várias vezes para lavar todas as células da superfície do poço. Colete as células únicas resuspended em um tubo cônico de 50 mililitros e diluir com DMEM e F-12 conforme necessário. Centrifugar este tubo de hPSCs coletados a 350 vezes g e a quatro graus Celsius por três minutos para pelotar as células.
Enquanto espera pela centrifugação, aspire a matriz da placa em que os hPSCs serão semeados. Adicione uma quantidade suficiente de mídia mTeSR para receber poços para cobri-los. Quando a centrifugação estiver completa, aspire cuidadosamente o supernasce, deixando os hPSCs pelleted na parte inferior do tubo cônico.
Resuspend a pelota celular em mTeSR complementada com um micromolar de Thiazovivin obtido comercialmente. Usando uma pipeta P1000, triturar suavemente duas a três vezes para resuspensar uniformemente a pelota da célula em uma única suspensão celular. Imediatamente pipeta 10 microliters da suspensão celular em um hemócito e contar o número de células.
Ajuste o volume dos hPSCs resuspendados com mTeSR suplementado por Thiazovivin para alcançar a concentração celular desejada para chapeamento. Em seguida, agite a placa em um padrão cruzado várias vezes para ter certeza de que as células estão distribuídas uniformemente. Após os hPSCs terem sido banhados por pelo menos 24 horas, use um microscópio de contraste de fase para verificar a morfologia das células com ênfase específica no diâmetro das colônias de hPSC banhadas.
Em seguida, prepare o meio de diferenciação APS do primeiro dia, conforme descrito na tabela dois do protocolo de texto. Um dia após a semeadura, aspire o mTeSR suplementado por Thiazovivin a partir dos hPSCs banhados e lave-os brevemente com mídia IMDM. Depois disso, adicione o meio do primeiro dia aos hPSCs.
Regissuas horas e coloque as células de volta na incubadora a 37 graus Celsius. Continue com as etapas de diferenciação subsequentes, preparando o meio de diferenciação necessário e adicionando-o às células nos respectivos dias de diferenciação na mesma hora do dia. Neste estudo, populações enriquecidas de progenitores de brotos hepáticos e, posteriormente, células semelhantes a hepatocititas são geradas a partir de hPSCs.
No segundo dia de diferenciação, as células primitivas se diferenciaram no segundo dia de células de endoderme definitivas. A grande maioria dessas células expressa SOX17 e FOXA2. No terceiro dia de diferenciação, as células de endoderme se diferenciaram em progenitores foregut que parecem poligonais em forma.
Mais tarde, no sexto dia, os progenitores foregut se diferenciaram em progenitores de brotos de fígado. Estes progenitores de brotos de fígado expressam AFP, TPX3 e HNF4alpha. Em três linhas hPSC, este método gera o sexto dia de progenitores hepáticos afp positivos a uma eficiência de aproximadamente 89%Finalmente, após 18 dias de diferenciação hepática dos hPSCs, aparecem células hepatócitas positivas em albumina.
Morfologicamente, essas células parecem epiteliais, formando bordas brilhantes que lembram o canaliculi bile. Nesta fase, o citoplasma do dia 18 hPSC-derivado hepatócitos parece mais escuro do que o núcleo. Ao semear células-tronco pluripotentes humanas para diferenciação, é imperativo semeá-las na densidade certa e também distribuí-las através do poço, sacudindo a placa.
A capacidade de produzir hepatócitos humanos in vitro é uma tecnologia que permite aos cientistas investigar mecanismos subjacentes ao desenvolvimento do fígado. Este método produz um grande número de hepatócitos humanos in vitro que poderiam ser usados para investigar a função hepática e a doença e eventualmente permitir novas terapias para insuficiência hepática.
