O objetivo geral dessa metodologia é expandir-se além do limite óptico da maioria dos citómetros de fluxo, permitindo que um pesquisador grave cinco marcadores adicionais para interrogar populações celulares complexas. Usando essa técnica, é possível alcançar um imunofenofoteping profundo ao trabalhar com instrumento com um baixo número de detectores ou amostra com número limitado de células. Inicie este procedimento transferindo cuidadosamente o sangue extraído para um tubo cônico de 50 mililitros.
Diluir o sangue com uma quantidade igual de PBS sem cálcio e magnésio. Adicione 15 mililitros de gradiente de densidade ao fundo de um novo tubo cônico de 50 mililitros. Sobreponha cuidadosamente o sangue diluído em cima do meio gradiente de densidade, evitando qualquer mistura entre o gradiente de densidade médio e sangue diluído.
Centrifugar a 400 vezes g por 30 minutos em temperatura ambiente sem freio para evitar a interrupção da interface. Após a centrifugação, use uma pipeta para aspirar cuidadosamente e descartar a camada superior, prestando atenção para não remover células na interface entre o meio de plasma e gradiente de densidade. Colete o maior número de células mononucleares de sangue periféricos, ou PBMCs, o mais possível da interface sem tocar na pelota de célula vermelha na parte inferior do tubo cônico de 50 mililitros, e transfira para um novo tubo.
Adicione PBS para trazer o volume final para 25 mililitros, e inverta várias vezes para misturar. Em seguida, lave os PBMCs duas vezes como indicado no texto. Depois de remover as plaquetas e contar os PBMCs como descrito no texto, resuspensar as células em PBS, 0,1% de azida de sódio a uma concentração de uma vez 10 a 7 células por mililitro.
Para preparar os PBMCs para coloração, transfira 100 microliters de cada amostra para uma placa de fundo V de 96 poços. Centrifugar a placa a 350 vezes g por três minutos em temperatura ambiente. Aspire cuidadosamente o supernaente sem perturbar a pelota celular.
Para cada poço, adicione 100 microliters de PBS contendo um corante vivo/morto fixável que reage com amina livre em proteínas, e resuspense a mistura PBMC cuidadosamente. Posteriormente, deixe a placa descansar por 10 minutos à temperatura ambiente para rotular células mortas. Para cada amostra, prepare 30 microliters de uma mistura contendo todos os sete anticorpos.
Nesta fase, anticorpos titulados contra diferentes moléculas-alvo e em diferentes fluorocromões também podem ser adicionados. Centrifugar a placa de 96 poços a 350 vezes g por três minutos à temperatura ambiente, e aspirar cuidadosamente o supernaente sem perturbar a pelota celular. Adicione o coquetel de anticorpos a cada poço, e resuspense cuidadosamente sem gerar bolhas.
Incubar por 30 minutos à temperatura ambiente no escuro. Após 30 minutos, adicione 150 microliters de tampão de coloração a cada poço, e centrifufique a placa a 350 vezes g por três minutos em temperatura ambiente. Aspire cuidadosamente o supernaente sem perturbar a pelota celular, e resuspenja as células em 200 microliters de PBS.
As células estão prontas para análise de citometria de fluxo. Anticorpos delta gama de CD3, CD8, CD14, CD19 e TCR são titulados com uma curva máxima de índice de coloração. A titulação de anticorpos é o passo mais crítico neste protocolo para identificar adequadamente sete subconjuntos de células imunes usando dois fluorochromes.
Para preparar uma diluição de anticorpos duas vezes, encha 10 poços de uma placa de 96 poços com 40 microliters de tampão de coloração por poço. Para os propósitos deste vídeo, apenas a titulação de anti-CD8 será mostrada. No primeiro poço, aumente o volume final para 80 microliters de tampão de coloração, e adicione anti-CD8 em uma concentração quatro vezes maior do que a concentração sugerida pelo fabricante.
Misture bem e transfira 40 microliters para o segundo poço. Misture bem e repita este passo para todos os outros poços. Colora 10 amostras de PBMCs ou sangue inteiro com 30 microlitres das 10 diluições duplas diferentes de anti-CD8 seguindo o protocolo demonstrado anteriormente.
Adquira dados com um citômetro de fluxo e plote o sinal de cada diluição. Após calcular o índice de manchas para cada concentração de anticorpos conforme detalhado no texto, plote o índice de manchas versus a concentração de anticorpos expresso como uma fração da diluição do anticorpo e identifique a concentração de anticorpos com o valor máximo do índice de mancha. Para titular os anticorpos anti-CD4 e anti-CD56, comece com a estratégia de diluição duas vezes demonstrada anteriormente, adicionando concentrações adicionais entre para identificar finamente a faixa de concentração que permitirá a separação de células T CD4 positivas e células NK das outras populações celulares.
Titule o anticorpo anti-CD4 colocando o sinal anti-CD4 entre o sinal cd8 positivo duplo, CD3 positivo e a população single positive CD3. Titule o anticorpo anti-CD56 seguindo uma estratégia semelhante à titulação de anticorpos anti-CD4, colocando células NK entre as populações CD3-negativas e as CD3-positivas. Para iniciar esta estratégia de gliça de dois fluorocromáticos, de sete marcadores, selecione o portão de linfócitos e crie um gráfico de pontos com um dos dois fluorocromes usados neste protocolo em cada eixo.
Portão em células T CD8 positivos identificados como células CD3 e CD8 dupla positiva no canto superior direito do gráfico de pontos. Exclua a população dim CD8 que pode conter células NKT. Portão em células T CD4 positivos identificados como a população entre células T CD8 positivos e as populações single positivas CD3.
Portão em células Gamma delta T identificados como células CD3 altas. Subdividir células Gamma delta T para CD8 positivo e CD8 negativo. Portão em células NK identificadas como a população entre células CD3 positivo e CD3-negativo.
Subdividir as células NK para CD8 positivo e CD8 negativo. Portão em células B identificado como a população CD3-negativo, CD19-positivo no canto inferior direito do gráfico de pontos. Selecione o portão de monócito e crie um gráfico de pontos com um dos dois fluorochromes usados neste protocolo em cada eixo.
Portão na população CD3-negativa, CD14-positivo. Utilizando essa estratégia, linfócitos de um paciente com mieloma múltiplo foram fechados com base em sua dispersão dianteira e dispersão lateral e seu perfil citométrico de fluxo. Subpopulações de memória CD8 positivas e células T ingênuas foram identificadas pela expressão de CD45RA e CCR7.
A expressão de HLA-DR e CD57 foi usada para estudar a ativação de células T em células ingênuas cd8-positivas, memória, memória central, memória effectora e células CD45RA-positive. Da mesma forma, foram identificadas células T ingênuas e de memória nD4 positivas. Dentro da população de memória, CCR4 e CCR6 foram utilizados para identificar subpopulações de auxiliares T em células T CD4 positivas.
As subpopulações das células NK foram caracterizadas pela expressão CD16 e CD57. Essa estratégia foi utilizada para investigar a dinâmica em populações imunes de amostras longitudinais de um doador com mieloma múltiplo recebendo um transplante de células-tronco. A caracterização das subpopulações CD8 e CD4 ao longo do tempo mostrou uma ativação sustentada de células T CD4-positivas e CD8 e uma distorção do auxiliar T para um fenótipo T-helper-one.
Mas no dia 60, a porcentagem de células B aumentou drasticamente, prevendo a recaída do paciente. A preparação adequada das células e a titulação de anticorpos são passos críticos para alcançar resultados confiáveis usando essa técnica. O anticorpo direcionado a outros marcadores pode ser adicionado para realizar uma análise mais profunda da citometria de fluxo e criar painéis citométricos de fluxo modular visando várias linhagens ao mesmo tempo.
Abordagens semelhantes destinadas a expandir o número de marcadores graváveis também poderiam ser desenvolvidas usando diferentes conjuntos de marcadores ou para uso em diferentes modelos animais. Não se esqueça que a azida de sódio pode causar queimaduras na pele e nos olhos. Portanto, um jaleco, óculos de proteção e luvas devem ser sempre usados ao manusear este reagente.
