Bem-vindos a todos. Meu nome é Win Surachetpong. Sou professor assistente em Microbiologia Veterinária e Faculdade de Imunologia de Medicina Veterinária na Universidade kasetstart, Tailândia.
Eu e minha equipe estamos especializados em doenças virais emergentes na tilápia. Estamos trabalhando agora no vírus do lago da tilápia que causam alta mortalidade na tilápia. Como a tilápia é a segunda espécie de peixe mais importante que é a cultura em todo o mundo, ela fornece fonte de proteína para um milhão de pessoas e desempenha papel importante para a segurança alimentar.
Assim, o recente surto do vírus do lago de tilápia causa impacto socioeconômico que levou muitos cientistas a tentar encontrar uma solução para este problema. Até agora precisamos de um método muito sensível, rápido e preciso para detectar o vírus. Neste vídeo, mostraremos passo a passo para detectar o vírus do lago de tilápia no tecido de peixes a partir da coleta de amostras, população de amostras e análise de PCR em tempo real.
Primeiro, solubilize a overdose de óleo de pano na água para eutanásia do peixe. Coloque o peixe morto em uma bandeja, esterilize o equipamento usando 95% de etanol e depois queime com um queimador de álcool. Corte lentamente o peixe do abdômen inferior para cima, para coletar o fígado.
Colete parte do fígado em um tubo de centrífuga de 1,5 mililitro. A primeira parte da extração de RNA deve ser realizada em um Capô de Fluxo Laminar, e usar equipamento de proteção. Adicione um mililitro de reagente de extração de RNA no tubo.
Pulverize o fígado usando um pilão de tecido em homogêneo. Adicione 200 microliters de clorofórmio no tubo. Em seguida, misture suavemente invertendo o tubo várias vezes.
Reserve por três minutos em temperatura ambiente. Centrífuga a 4 graus celsius a 12.000 RCF por 15 minutos. Colecione cuidadosamente os tubos da centrífuga.
Transfira suavemente 500 microliters da fase aquosa superior incolor em um novo tubo. Adicione um volume de isopropanol no tubo. Aqueça a menos 20 graus celsius por duas horas ou até a noite para precipitar o RNA.
Após a incubação, centrifufique a solução na mesma condição de centrífuga. Recolhe os tubos da centrífuga e, em seguida, descarte o supernatante. A pelota de RNA pode ser vista como apontada pela seta.
Adicione um mililitro de 75% de etanol no tubo para lavar a pelota de RNA e inverta várias vezes. Centrífuga a 4 graus celsius, a 10.000 RCF por 15 minutos. Recolhe os tubos da centrífuga e, em seguida, descarte o supernatante.
Desenhe o etanol que sobra usando a tubulação automática e o ar seco à temperatura ambiente por cinco a 10 minutos. Adicione 30 a 60 microliters RNase água livre, pré-aquecida a 55 a 60 graus celsius para solubilizar a pelota de RNA. Use de um a dois microliters de solução RNA para medir a concentração usando um espectrômetro de micro volume.
Os resultados aparecerão na tela. Diluir a concentração para 200 nanogramas por microliter usando água livre RNase. Realize a síntese de CDNA utilizando os produtos químicos e condições listados da seguinte forma.
Use um termociclador para converter RNA em cDNA com condições sugeridas. A seguir estão os produtos químicos e condições utilizados para determinar a carga TiLV usando PCR em tempo real. Dispense seis mililitros da mistura mestre qPCR em cada frasco de tubo branco de tira qPCR.
Posteriormente, quatro mililitros de amostra de CDNA são carregados no poço. Nesta fase, uma nova ponta de tubulação deve ser trocada em cada poço, para evitar contaminação de amostra para amostra. Sele firmemente a tira qPCR com uma tampa de tira qPCR transparente.
Misture suavemente a solução apertando uma ponta da tira. Em seguida, gire para baixo usando micro centrífuga para coletar todo o líquido na parte inferior dos vasos. Use a condição de dois passos como mostrado no vídeo, selecione o poço em placa de 96 poços que você vai usar.
Selecione o verde cibernético como a flora para corante. Selecione desconhecido como o tipo de amostra e insira um nome em uma caixa de nome de amostra. Abra a tampa de uma máquina PCR em tempo real e coloque a tira qPCR no poço atribuído.
Em seguida, feche a tampa. Execute a máquina com a condição selecionada. A máquina iniciará e funcionará depois que a tampa atingir a temperatura desejada.
Após o término das condições qPCR, a curva de amplificação é mostrada. Aqui, a seta de taxa aponta onde o nível limiar corta entre a fase exponencial e a fase linear que resulta em valor de TC. O valor da TC é então extrapolado em número de cópia de registro de vírus para calcular um número de vírus permanece usando a curva padrão.
O pico de fusão também é exibido para identificar se o vírus detectado pelo qPCR é, de fato, TiLV no qual os picos de derretimento geralmente variam entre 79,5 e 80,5 graus celsius. Por isso, esperamos que este método seja uma ferramenta importante para os agricultores e a organização em todo o mundo, que podem exigir a implementação de um controle e limitar a propagação da infecção por TiLV.
