O objetivo deste simples sistema biomimético baseado em células 3D é facilitar a análise da capacidade de invasão em grande população de esferoide tumoral para rastreamento de drogas anti-metastáticas. A principal vantagem do nosso conjunto de micro-câmaras de hidrogel é que permite a produção de um grande número de esferoides uniformes que povoam o mesmo plano focal por poço. A posição esferoide é mantida devido à estrutura da matriz de microcervejas de hidrogel mesmo após a adição da matriz extracelular, facilitando o monitoramento contínuo preciso dos esferoides e o processo de invasão.
Além disso, a caracterização morfológica e a coloração fluorescente de numerosos esferoides e células invasoras podem ser realizadas in situ e analisadas em uma resolução de elemento único de forma eficiente. Demonstrando o procedimento de produção de placas de seis poços de microarmes de hidrogel será Maria Sobolev do nosso laboratório. Para preparar as placas de matriz de microcrédola de hidrogel, primeiro pré-aqueça seis polidimimetilsiloxano, ou PDMS, carimba até 70 graus Celsius, e coloque uma placa de seis poços, de fundo de vidro em um banho seco pré-aquecido a 75 graus Celsius por vários minutos.
Quando a placa estiver quente, despeje uma gota de 400 microliter de agarose pré-aquecido de baixo derretimento no fundo de cada poço da placa de seis poços, e coloque suavemente um carimbo sobre cada gota. Deixe a configuração esfriar por cinco a 10 minutos em temperatura ambiente, seguido de 20 minutos a quatro graus Celsius para gelação de agarose completa. Quando a agarose se solidificar, retire suavemente o PDMS de cada poço, deixando os géis de agarose padronizados com micro-câmaras.
Depois de permitir que a lâmpada UV atinja sua maior intensidade, coloque a placa em relevo no sistema de cura de luz por três minutos e encha os macro-poços esterilizados por UV com PBS estéril. Em seguida, cubra a placa e enrole-a com Parafilm para armazenamento Celsius de quatro graus até usar. Para carregar as células, remova o PBS de cada poço e carregue suavemente 50 microliters das células de interesse em cima de cada matriz de hidrogel.
Depois de permitir que as células se instalem por gravidade por 15 minutos, adicione cuidadosamente seis a oito alíquotas de 500 microlitros de meio fresco à borda do fundo plástico macro-bem fora do anel e da matriz de hidrogel. Incubar as células para o período de tempo adequado a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono com umidade para a formação de esferoides. Então, transfira os esferoides para um capuz de biossegurança no gelo por 10 minutos.
Quando a placa tiver esfriado, incline uma ponta de pipeta na borda do fundo plástico macro-bem ao lado da matriz de hidrogel, e remova todo o meio ao redor da matriz. Em seguida, remova o meio do tanque de matriz, incline uma ponta de pipeta de carregamento de gel na borda do tanque de matriz com muito cuidado, tomando cuidado para não perturbar as micro-câmaras e esferoides. Em seguida, use uma ponta de pipeta pré-congelada e fina para adicionar duas alíquotas de 150 microliters da mistura de colágeno de interesse na borda da matriz uma de cada vez, liberando a mistura lentamente para evitar a luxação esferoide.
Após a segunda rodada de colágeno ter sido adicionada a cada poço, devolva os esferoides à incubadora por uma hora para a gelação completa da matriz extracelular. Quando a matriz se solidificar, adicione 400 microliters de agarose pré-aquecida de 1%de derretimento baixo em cima do gel, e incubar a placa, coberta à temperatura ambiente, por cinco a sete minutos, antes de esfriar por dois minutos a quatro graus Celsius para gelação agarose. Em seguida, inclinando a pipeta na borda do fundo plástico macro-bem, adicione suavemente dois mililitros de meio completo para cada poço.
Para realizar um ensaio de invasão, carregue a placa de matriz de microdúla de hidrogel em um estágio de microscópio invertido motorizado equipado com uma incubadora de dióxido de carbono de 37 graus Celsius e 5% com uma atmosfera umidificada, e use um objetivo de quatro ou 10x para pré-determinar as posições para a aquisição de imagem em cada poço para que toda a área do array seja avaliada. Em seguida, adquira imagens de campo brilhante a cada duas ou quatro horas por um total de 24 a 72 horas para rastrear a invasão celular do corpo esferoide até a matriz extracelular circundante. No final da aquisição da imagem, exporte as imagens de lapso de tempo do software de aquisição de imagens para economizar em um formato de arquivo de imagem marcado para uma pasta dedicada.
Em seguida, abra a interface do usuário gráfico e clique em Load Bright Field. Ajuste os parâmetros de segmentação da imagem para obter uma segmentação precisa dos esferoides e suas áreas de invasão, e clique na Segmentação região de interesse para criar uma borda em torno de cada esferoide. Se a segmentação automática estiver incorreta, pressione Excluir ou Adicionar e faça as correções apropriadas manualmente.
Clique em Rastrear para numerar os esferoides em cada uma das imagens de lapso de tempo. Em seguida, clique em Medição para gerar uma planilha com todos os parâmetros e salvar a planilha em um formato apropriado para processamento de dados e análise estatística. Para examinar a influência do ácido hialurônico no processo de invasão espontâneo hela spheroid, neste experimento, os esferoides de dois dias foram cobertos com solução de mistura de colágeno e ácido hialurônico e comparados com esferoides de dois dias cobertos apenas com solução de colágeno.
Após 50 horas de incubação, os esferoides embutidos no colágeno e ácido hialurônico demonstraram uma dispersão celular inferior na matriz extracelular circundante em comparação com os esferoides embutidos apenas no colágeno. De fato, a análise da cinética da área de invasão ao longo do tempo para 99 esferoides em resolução de esferoides únicos indica claramente que a adição de ácido hialurônico ao colágeno inibe a dispersão celular fora do esferoide, resultando em áreas de invasão menores. O tratamento da cultura esferoide HeLa com um flavonoide bioativo com propriedades cito-e migratórias por 24 horas resulta em uma dispersão celular inibida em torno dos esferoides em comparação com spheróides hela não tratados.
De fato, a análise das áreas de invasão de 488 esferoides no final do experimento revelou uma inibição significativa após o tratamento com apenas 10 micromolar da droga. Devido à baixa característica de apego do hidrogel, essa tecnologia baseada em microcrédito facilita a formação de esferoides mesmo em casos de pouquíssimas células. Isso é especialmente vantagem em valiosas amostras de células primárias limitadas do câncer ou derivadas do paciente.
A placa de imagem de microcrédito de hidrogel permite a análise da localização espacial exata dos esferoides durante experimentos de longo prazo para a avaliação do processo de invasão no nível de elemento único e fornece um alto grau de robustez estatística e precisão. As aplicações futuras desta metodologia incluem a cultura multicelular lateral de tumores e células estromicanas em diferentes regiões dentro do macro-poço e a recuperação de esferoides individuais para análise molecular a jusante.
