이 간단한 재현 가능한 생체 모방 3D 세포 기반 시스템의 목표는 항 전이성 약물 스크리닝을 위한 종양 스페로이드의 큰 집단에서 침입 용량 분석을 용이하게 하는 것이다. 하이드로겔 마이크로 챔버 어레이의 주요 장점은 웰당 동일한 초점 평면을 채우는 많은 수의 균일한 스페로이드를 생산할 수 있다는 것입니다. 상기 스페로이드 위치는 세포외 매트릭스 첨가 후에도 하이드로겔 마이크로 챔버 어레이 구조로 인해 유지되며, 스페로이드 및 침입 공정의 정확한 연속 모니터링을 용이하게 한다.
또한, 수많은 스페로이드 및 침입 세포의 형태학적 특성화 및 형광 염색은 현장에서 수행되고 시간 효율적인 방식으로 단일 요소 해상도로 분석될 수 있다. 하이드로겔 마이크로 챔버 어레이 6웰 이미징 플레이트 생산 시술을 시연하는 것은 실험실에서 마리아 소볼레프입니다. 하이드로겔 마이크로 챔버 어레이 플레이트를 준비하기 위해 먼저 6개의 폴리디메틸실록산 또는 PDMS를 예열하여 70°C까지 우표를 찍고, 몇 분 동안 섭씨 75도까지 예열된 드라이 목욕에 6웰의 유리 바닥 플레이트를 놓습니다.
접시가 따뜻할 때, 6웰 플레이트의 각 웰의 바닥에 예열된 저용 아가로즈 400 마이크로리터 드롭을 붓고, 각 방울에 스탬프 1개를 부드럽게 놓습니다. 실온에서 5~10분 동안 설정을 식히고, 섭씨 4도에서 20분 간 식혀 완전한 아가로즈 젤레이션을 준비합니다. 아가로즈가 고화되면 각 우물에서 PDMS를 부드럽게 벗겨 내고, 아가로즈 젤을 마이크로 챔버로 패턴화합니다.
UV 램프가 최고 강도에 도달한 후 엠보싱 플레이트를 라이트 경화 시스템에 3분 동안 배치하고 UV 멸균 된 매크로 웰을 멸균 PBS로 채웁니다. 그런 다음 접시를 덮고 파라필름으로 포장하여 사용전까지 섭씨 4도 보관합니다. 세포를 로드하려면 각 우물에서 PBS를 제거하고 각 하이드로겔 어레이 위에 관심 있는 셀의 50 마이크로리터를 부드럽게 로드합니다.
세포가 중력에 의해 15 분 동안 정착 할 수 있도록 한 후, 조심스럽게 링과 하이드로 겔 어레이 외부 매크로 잘 플라스틱 바닥의 가장자리에 신선한 매체의 500 마이크로 리터의 6 ~ 8 알리쿼트에 추가합니다. 스페로이드 형성을 위해 습도가 있는 섭씨 37도 및 이산화탄소 5%에서 적절한 기간 동안 세포를 배양합니다. 그런 다음 스페로이드를 얼음에 있는 생물 안전 후드로 10분 간 옮킨다.
플레이트가 냉각되면 하이드로겔 어레이 옆에 있는 매크로 웰 플라스틱 바닥 의 가장자리에 파이펫 팁을 기대어 배열 주위에서 모든 매체를 제거합니다. 이어서, 어레이 탱크에서 배지를 제거하고, 어레이 탱크의 가장자리에 겔 로딩 파이펫 팁을 매우 신중하게 기울여 마이크로 챔버와 스페로이드를 방해하지 않도록 주의하십시오. 다음으로, 미리 얼어붙은 미세파이펫 팁을 사용하여 콜라겐 혼합물 150마이크로리터의 2개의 알리쿼트를 한 번에 하나씩 어레이의 가장자리에 추가하여, 스페로이드 탈구를 피하기 위해 천천히 혼합물을 방출한다.
콜라겐의 두 번째 라운드가 각 우물에 추가 된 후, 세포 외 매트릭스의 전체 겔화를 위해 1 시간 동안 인큐베이터에 스페로이드를 반환합니다. 매트릭스가 고화되면, 젤 위에 미리 데운 1% 낮은 녹는 아가로즈 400 마이크로리터를 추가하고 실온에서 5~7분 동안 플레이트를 배양한 후 아가로즈 겔화를 위해 섭씨 4도에서 2분간 냉각합니다. 그런 다음 매크로 웰 플라스틱 바닥의 가장자리에 파이펫을 기울고 각 웰에 완전한 중간 크기의 2 밀리리터를 부드럽게 추가합니다.
침략 분석을 수행하기 위해 하이드로겔 마이크로 챔버 어레이 플레이트를 가습 된 대기가있는 37도 및 5 % 이산화탄소 인큐베이터를 갖춘 전동 된 반전 현미경 단계에 적재하고 4 또는 10 배 목표를 사용하여 각 배열 영역을 평가할 수 있도록 이미지 수집의 위치를 미리 결정합니다. 이어서, 스페로이드 체체로부터 주변 세포외 매트릭스로의 세포 침입을 추적하기 위해 총 24~72시간 동안 2~4시간마다 밝은 필드 영상을 습득한다. 이미지 수집이 끝나면 태그가 지정된 이미지 파일 형식으로 저장하기 위해 이미지 수집 소프트웨어의 시간 경과 이미지를 전용 폴더로 내보냅니다.
다음으로 그래픽 사용자 인터페이스를 열고 밝은 필드 로드를 클릭합니다. 이미지의 세분화 매개 변수를 조정하여 스페로이드 및 해당 침략 영역의 정확한 세분화를 달성하고 관심 영역 세분화 영역을 클릭하여 각 스페로이드 주위에 테두리를 만듭니다. 자동 세분화가 올바르지 않으면 삭제 또는 추가를 누르고 적절한 수정을 수동으로 수행합니다.
추적을 클릭하여 각 시간 경과 이미지의 스페로이드에 번호를 매겨보세요. 그런 다음 측정을 클릭하여 모든 매개 변수가 있는 스프레드시트를 생성하고 스프레드시트를 데이터 처리 및 통계 분석에 적합한 형식으로 저장합니다. 자발적인 HeLa spheroid 침입 과정에 히알루론산의 영향을 조사하기 위해, 이 실험에서, 2일 성숙한 스페로이드는 콜라겐과 히알루론산 혼합물 용액으로 덮여 있었고, 콜라겐 용액으로만 덮인 2일 숙성 스페로이드와 비교하였다.
50시간의 배양 후 콜라겐과 히알루론산에 내장된 스페로이드는 콜라겐에만 내장된 스페로이드에 비해 주변 세포외 매트릭스로 의 한 하부 세포 분산을 입증하였다. 실제로, 단일 스페로이드 해상도에서 99개의 스페로이드에 대한 시간이 지남에 따른 침략 영역 운동제의 분석은 콜라겐에 히알루론산을 첨가하면 스페로이드에서 세포 분산을 억제하여 더 작은 침입 부위를 초래한다는 것을 명확하게 나타낸다. 24시간 동안 사이토 및 미정 특성을 가진 생리활성 플라보노이드를 가진 HeLa 스페로이드 배양을 치료하면 비처리된 HeLa 스페로이드에 비해 스페로이드 주위의 억제된 세포 분산이 발생합니다.
실제로, 실험의 끝에 488 스페로이드의 침략 영역의 분석은 약물의 10 마이크로 몰라로 치료 후 상당한 억제를 밝혔다. 하이드로겔의 낮은 부착 특성으로 인해, 이 마이크로 챔버 기반 기술은 극소수의 세포의 경우에도 스페로이드의 형성을 용이하게합니다. 이것은 귀중한 한정암 줄기 같이 또는 환자 유래 1 차 세포 견본에 있는 특히 이점입니다.
하이드로겔 마이크로 챔버 이미징 플레이트는 단일 요소 수준에서 침입 공정의 평가를 위한 장기 실험 동안 스페로이드의 정확한 공간 위치를 분석할 수 있으며 높은 수준의 통계적 견고성과 정확도를 제공한다. 이 방법론의 미래 응용 프로그램은 매크로 웰 내의 다른 지역에서 종양 및 기질 세포의 나란히 다세포 배양 및 다운스트림 분자 분석을 위한 개별 스페로이드의 검색을 포함한다.
