Este trabalho foi financiado por um subsídio SBIR (1R44EY027654-01A1).

Todos os procedimentos com ratos foram realizados em conformidade com os protocolos aprovados pela Hospital Oakland Research Institute animal cuidados e uso Comitê das crianças e aderiu à associação para pesquisa em visão e oftalmologia (ARVO) instrução para o uso de animais em oftalmologia e visão de pesquisa.
1. tecido preparação para imunocoloração
<ol><li>Eutanásia em camundongos C57 BL/6J em dia embrionário (E) 16, dia pós-natal (P) 0, P15 e P90 por dióxido de carbono (CO2) seguido por decapitação (ratos E16 e P0).</li>
	<li>Olhos de rato imediatamente enucleate perfurado com agulha de 29 1/2 no lado dorsal do olho. Incube durante 5 minutos (min) em 1 mL de paraformaldeído 4% (PFA) em pH tampão fosfato salino (1X PBS) 8.0 à temperatura ambiente.</li>
	<li>Para fazer olho copos de P0, P15 e P90, dissecar para fora da córnea e da lente com uma tesoura de Oftalmologia bem enquanto estão de olhos nos 4% PFA. Nota: Ignorar este passo para E16 olhos como os olhos são muito pequenos.</li>
	<li>Corrigir os copos de olho (P0, P15 e P90) e os olhos todo (E16) em 4% PFA por 20 min em temperatura ambiente. Então lave os copos de olho e olhos todo duas vezes em 1 mL de 1X PBS durante 10 minutos à temperatura ambiente.</li>
	<li>Crioproteção o olho xícaras e todo os olhos no 1xPBS, pH 8.0 contendo 10% de sacarose por 1 hora. Manter-se em 20% de sacarose em 1X PBS durante 1 hora e então saturar em 30% de sacarose em 1X PBS durante a noite a 4 ° C.</li>
	<li>No dia seguinte, incorporar os copos de olho e os olhos todo corte ideal temperatura composto (OCT), (500 µ l) em cryomolds, snap-congelamento em banho de gelo seco/etanol e armazenar a-80 ° C.</li>
	<li>Remover os moldes com copos de olho incorporado e olhos todo de-80 ° C e permitem equilibrar a-20 ° C durante 1 hora antes de cryosectioning.</li>
	<li>Cortar as seções transversais da retina (12 µm de espessura) paralelo ao eixo temporonasal na cabeça do nervo óptico usando um criostato a-20 ° C.</li>
	<li>Monte seções da retina em lâminas de microscópio53 e loja a-80 ° C.</li>
</ol>2. imunocoloração com anticorpos 5-mC e 5-hmC
<ol><li>Cercam as seções da retina montadas em slides com uma caneta de barreira hidrofóbica. A caneta de barreira hidrofóbica reduz o volume de anticorpo necessário para manchar o tecido.</li>
	<li>Lave as seções da retina uma vez com 200 µ l de PBS 1x por 10 min.</li>
	<li>Permeabilize as seções da retina com 200 µ l de 0,1% Triton X-100 em 1X PBS (PBS-T) por 10 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>Desnature seções da retina por 30 min com 200 µ l de acabadas 2 N de ácido clorídrico (HCl) em PBS 1x numa incubadora 37 ° C. Nota: Cuidadosa titulação do HCl tratamento é necessário para otimizar o sinal de 5mC.</li>
	<li>Sempre inclua biológicas repetições (3-4), otimizando a 5mC sinal54. Nota: Nós fizemos a recuperação do antígeno em 4 pontos de tempo (15 min, 30 min, 1 h e 2 h) e incubação encontrado 30 min é o ideal para sinal de 5mC. Mais incubação com HCl degrada a estrutura dos núcleos, levando a incapacidade de localizar 5mC sinal para o núcleo.</li>
	<li>Após desnaturação, neutralizar seções da retina, adicionando-se 100 µ l de 0.1 M Tris-HCl (pH 8,3) em seções da retina por 10 min.</li>
	<li>Incubar as seções em 500 µ l de solução de bloqueio (5% de soro de cabra normal preimmune em 0,1% Triton X-100 em 1X PBS) por 1h à temperatura ambiente em uma câmara de umidade.</li>
	<li>Após o bloqueio, adicionar anti-5mC; anticorpos anti-5hmC diluem a 1: 500 no bloqueio de solução para as seções da retina.</li>
	<li>Incube retinal seções durante a noite a 4 ° C, em câmara de umidade.</li>
	<li>A próxima lavagem de dia, seções da retina 3 vezes (10-15 min cada tempo) com 0,1% PBS-T e então incubar em solução com os correspondentes anticorpos secundários de bloqueio (cabra anticoelho e cabra anti-Mouse IgG, diluído; 1: 1000), contendo DAPI (4', 6 - solução de diamidino-2-phenylindole) (1 µ g/mL) à temperatura ambiente durante 1 h em solução de bloqueio. Nota: Evite a secagem das seções durante todas as fases de immunodetection.</li>
	<li>Lavar as lâminas três vezes com 1 mL de 0.1% PBS-T.</li>
	<li>Após a última lavagem, montar as seções com meio de montagem aquoso sob uma lamela e selar com esmalte incolor.</li>
</ol>3. confocal imuno-histoquímica
<ol><li>Oriente as seções para que o lado de epitélio retinal do pigmento da Taça óptica sempre enfrentando uma maneira (por exemplo, acima), para a consistência.</li>
	<li>Realizar captura de imagem de immunostained da retina seções em 63 X (ampliação de uma lente objetiva) com 2 X ou 3x zoom.</li>
	<li>Gerar várias seções óticas de cada imagem selecionada (z-pilhas) em todos os 3 canais (vermelho, verde e azul, RGB) usando 0,35 µm de passo. Nota: A ampliação final de um espécime visualizado no X de 10-20 (ampliação de uma lente objetiva) serão 63 X, respectivamente, quando combinado com um 10 (geralmente usado) X lente ocular. Visualizar a pilha compactada de óptica para localizar o sinal de 5mC e 5hmC</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Hydroxymethylation e metilação de DNA são modificações de DNA dinâmicas e reversíveis, que modulatethe a variada gama de mecanismos biológicos no desenvolvimento, bem como em células postmitotic. Aqui, descrevemos uma técnica reprodutível para detectar 5mC e 5hmC DNA modificações em situ técnica de imuno-histoquímica (utilizando anticorpos anti-5mC e anti-5hmC) nas seções congeladas paraformaldeído-fixo da retina do rato e fornecer Diretrizes para melhorar e padronizar os resultados, especialmente ao comparar vários espécimes diferentes. Nós anteriormente usou este método para delinear 5mC alterações na retina do rato com retina específicos como alvo de Dnmt1, Dnmt3a e Dnmt3b genes de metiltransferase de DNA e relatou o esgotamento (esperado) de 5mC marcas em suas retinas7 .
O passo crítico na deteção de immunohistochemical 5mC é a otimização do tratamento de cortes histológicos com HCl: menos do que 15 min pré-tratamento não é esperado para produzir resultados reprodutíveis, Considerando que o tratamento excessivo com HCl destrói o nuclear arquitetura. Achamos melhor resultado após incubação 30 min com HCl. Recomendamos sempre usar HCl fresco diluído e solução PFA 4% feita recentemente para fixação de tecido de desnaturação e da retina de DNA.
Para solucionar os resultados, recomendamos incluir três ou quatro repetições biológicas, otimizando o sinal 5mC. Enquanto cada indivíduo definido de coloração imuno-histoquímica pode gerar resultados ligeiramente diferentes (mais ou menos brilhantes heterocromático regiões), que é esperado em imuno-histoquímica método, o 5mC e 5hmC distribuição nuclear dentro do conjunto de individual das secções são esperadas para ser muito reprodutíveis, para contanto que o protocolo é seguido.
Esta técnica também tem limitação como consistentemente observamos variabilidade na distribuição de 5mC nos núcleos de células fotorreceptoras dentro da mesma seção. Encontramos alguns núcleos mostrou sinal de 5mC forte enquanto núcleo de células adjacentes não mostrou nenhum sinal de 5mC. Isto é devido a limitação em desmascarar 5mC antígeno por tratamento de HCl nas seções congeladas.
A importância desta técnica permite 5mC localização sem tratamento de DNase e proteinase K, levando a melhor preservação do chromocenters. Esta técnica é esperada para trabalhar robustamente em todas as seções de todos os tecidos de animais vertebrados, 5mC escriturada, marcas de 5hmC e processada com uma abordagem semelhante, não só o retina do rato, por enquanto o protocolo é seguido.

Regulação epigenética do desenvolvimento e homeostase postmitotic da retina do rato são uma excitante área de pesquisa, que promete trazer uma novela compreensão dos mecanismos biológicos, controlando a determinação de retinogenesis e a célula de destino, tipo específico de célula função metabólica, bem como patologias celular, morte celular e regeneração1,2,3,4,5,6,7,8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. cromatina sofre alterações dinâmicas no desenvolvimento, bem como em resposta a sinais externos variáveis seja estresse, metabólica ou célula morte estímulos6,14,15, 16 , 17 , 18. em núcleos de rato, a cromatina é dividida em ativa eucromatina e heterocromatina inativo6,19,20. No núcleo interfásico, eucromatina reside na região interna do núcleo enquanto heterocromatina linhas a periferia nuclear e o nucléolo. Este padrão é chamado convencional e é altamente conservado em eucariontes. Em contraste, núcleos de haste em animais noturnos como rato e rato tem invertido o padrão onde o núcleo é ocupado pela heterocromatina no centro rodeado por eucromatina, formando a casca mais externa6,18, 20. No nascimento, haste núcleos têm arquitetura nuclear convencional. Inversão de núcleos de haste ocorre durante o desenvolvimento, pela remodelação da arquitetura nuclear convencional. Durante esse processo, heterocromatina periférica separa a periferia nuclear e chromocenters se fundem para formar um único chromocenter no centro do núcleo6,18.
Metilação de DNA genômica participa no controlo de conformação de cromatina local21. Metilação do DNA ocorre na 5' posição de resíduos de citosina de dinucleotídeos CpG que são enriquecidos na região promotora de muitos genes no rato genomas22,23,24,25,26 bem como em intergênicas e regiões intrão, que carregam elementos reguladores27. Metilação das Ilhas CpG em promotores proximal21,24 e sequências CpG no gene potenciadores27,28 é importante na regulação do estado dinâmico da cromatina bivalente, que contém muitos fatores de genes/transcrição do desenvolvimento desempenha um papel importante no desenvolvimento, câncer e envelhecimento29,30,31,32,33,34 . Três DNA metiltransferases (DNMTs) participarem de metilação de DNA durante rato desenvolvimento35. Todos os três DNMTs são expressos durante o desenvolvimento da retina de rato36 e alterações específicas do retina em Dnmt genes impacto desenvolvimento retinal2,7. Hidroximetilcitosina (5hmC) é o produto oxidativo de desmetilação (5mC) 5-metilcitosina. As três enzimas de translocação (TET) dez-onze participarem 5mC desmetilação37,38,39. Hidroximetil-C modificação é enriquecida em promotores, corpos de gene e sequências genomic intergênicas dentro gene rico e regiões activamente transcrito27,40.
Há uma variedade de abordagens descritas para a determinação de mudança dos padrões de metilação do DNA em células41,42,,43,44,45,46, permitindo que alguns deles mudanças globais de metilação do DNA, enquanto outros focando precisas mudanças nas regiões de CpG-ricos dentro de promotores e potenciadores de quantificar. Métodos para a detecção e quantificação de 5hmC também foram relatados47, incluindo por imuno-histoquímica13. Técnicas de imuno-histoquímica, que permitem monitoramento robusto de 5mC e 5hmC alterações nos núcleos de desenvolvimento e células postmitotic, são muito informativo para delinear cromatina dinâmica em situ em resposta às mudanças externas ou internas impactando as células4,13,,48,49. No entanto, esta abordagem é propensa a subestimar a metilação do DNA e alterações hydroxymethylation devido a problemas técnicos, associados com a detecção de modificações de citosina em preparações histológicas. Isso ocorre porque o DNA apolar bases, incluindo 5mC e citosina 5hmC modificados, estão escondidos dentro do centro da hélice DNA dupla-hélice50e exigem o desmascaramento. Isto é especialmente desafiador em preparações histológicas congeladas, que podem rapidamente perdem a organização informativa do tecido original, quando é aplicado o tratamento áspero.
A retina do rato é um excelente modelo para dissecar a contribuição de metilação do DNA para o desenvolvimento neural e homeostase postmitotic. Só existem 6 tipos de neurônios (haste e cone fotorreceptores, amacrine, bipolares, células horizontais e gânglio), tipo uma célula glial (glia Muller) e uma neuroepithelial célula tipo (epithelium retinal do pigment)51. Tipos de células da retina foram relatados para ter padrões distintos de DNA metilação18,,19, que recentemente tem sido estudada em base única resolução1,5,9,12. Nós recentemente relatou aplicação imuno-histoquímica para delinear 5mC padrão de distribuição dentro de núcleos de células da retina e alterações nos núcleos da retina do rato adulto, onde todos os três DNA metiltransferases foram removidos pelo direcionamento condicional 7. em comparação com uma série de relatórios, onde a presença de metilação de DNA nas células da retina pode ser vista apenas como um positivo ou negativo sinal em hypermethylated submetidos à apoptose de células, nossa abordagem permitiu detecção específica cromatina arranjo dentro os núcleos de células da retina, que nós e vários grupos relataram e discutiram anteriormente5,6,7,18,19,36 , 52. aqui, descrevemos a técnica de imuno-histoquímica (IHC) de detecção de 5mC e 5hmC em congelados paraformaldeído-corrigido cortes histológicos em detalhes assim como demonstram os dados, que fomos capazes de se reproduzir do nosso relatório original7 .

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Supplies&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>29G1/2 ULTRA-FINE</td><td>BD Biosciences</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>Ophthalmic scissor</td><td>Fine Science tools, Inc.&amp;nbsp;</td><td>15000-03</td><td></td></tr><tr><td>PAP pen</td><td>RPICORP.com</td><td>195505</td><td></td></tr><tr><td>Microslide Superfrost plus</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Reagent&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Electron Microscope Science</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek Optical cutting compound (OCT)</td><td>VWR</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Triton X 100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>6 N HCl</td><td>VWR analytical&amp;nbsp;</td><td>BDH7204-1</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl pH 8.3</td><td>Teknova</td><td>T1083</td><td></td></tr><tr><td>Goat serum</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>005-000-121</td><td></td></tr><tr><td>5mC</td><td>Genway Biotech&amp;nbsp;</td><td>GWB-BD5190</td><td></td></tr><tr><td>5hmC</td><td>Active Motif</td><td>39791</td><td></td></tr><tr><td>LaminB1</td><td>Abcam</td><td>Ab16048</td><td></td></tr><tr><td>Cy2 AffiniPure Goat Ant-Rabbit IgG</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>111-225-1444</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 AffiniPure Goat Ant-Mouse IgG</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>115-585-166</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Prolong Gold Antifade medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MICRM HM 550</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>388114</td><td></td></tr><tr><td>Confocal microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

immunohistochemical detection of 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine in developing and postmitotic mouse retina

A epigenética do desenvolvimento da retina é um campo de pesquisa bem estudado, que promete trazer um novo nível de compreensão sobre os mecanismos de uma variedade de doenças degenerativas da retina humanas e identificar novas abordagens de tratamento. A arquitetura nuclear da retina do rato está organizada em dois padrões diferentes: convencional e invertido. Convencional padrão é universal onde heterocromatina é localizada para a periferia do núcleo, enquanto ativa eucromatina reside no interior nuclear. Em contraste, padrão nuclear invertido é exclusivo para o núcleo de células de fotorreceptoras haste adulto onde heterocromatina localiza-se ao centro nuclear, e eucromatina reside na periferia nuclear. Metilação do DNA é predominantemente observada em chromocenters. Metilação do DNA é uma modificação covalente dinâmica sobre os resíduos de citosina (5-metilcitosina, 5mC) de dinucleotídeos CpG que são enriquecidos nas regiões promotor de muitos genes. Três DNA metiltransferases (DNMT1, DNMT3A e DNMT3B) participarem de metilação de DNA durante o desenvolvimento. Detecção 5mC com técnicas de imuno-histoquímica é muito desafiador, contribuindo para a variabilidade nos resultados, como todas as bases do DNA, incluindo bases 5mC modificado estão escondidas dentro da hélice de DNA dupla-hélice. No entanto, a delimitação detalhada da distribuição de 5mC durante o desenvolvimento é muito informativa. Aqui, descrevemos uma técnica reprodutível para detecção de imuno-histoquímica robusto de 5mC e outro epigenéticas DNA marcador 5-Hidroximetilcitosina (5hmC), que colocalizes com a cromatina "aberta", transcricionalmente ativa no desenvolvimento e retina do rato postmitotic.

Para determinar a distribuição da 5-metilcitosina (5mC) e 5-Hidroximetilcitosina (5hmC) durante o desenvolvimento da retina e na retina postmitotic, nós immunostained C57BL/6J rato da retina seção de E16, P0, P15 e P90 com anticorpos específicos para 5mC e 5hmC.
No E16 manchando o 5mC era forte em chromocenters dos núcleos celulares enquanto fraca coloração observou-se no núcleo celular (Figura 1a). A coloração de 5hmC limitou-se a núcleos de célula e estava ausente da chromocenters (Figura 1b).
Na retina de P0, o sinal de 5mC era localizado, o chromocenters do núcleo de células e periferia nuclear (Figura 2a, seta e seta). Também observamos fraca coloração de 5mC entre os chromocenters dos núcleos celulares. O sinal de 5hmC foi fortemente presente no núcleo celular exceto para o chromocenters (Figura 2b). Encontramos que mais núcleos estão manchados com 5mC e 5hmC na camada interna neuroblasto (INBL) (Figura 2C, linha pontilhada)
Na retina P15, encontramos forte coloração de 5mC e 5hmC na camada nuclear externa (ONL), a camada nuclear interna (INL) e a camada de células ganglionares (GCL) (Figura 3). Em ONL (fotorreceptores de haste), o sinal de 5mC estava presente na chromocenters do núcleo de células e periferia nuclear (figuras 3a-3C, 3G). O sinal de 5hmC foi encontrado no núcleo celular exceto para o chromocenters (figuras 3d-3f). A microscopia eletrônica de transmissão feita na retina P15 mostra a distribuição de domínios heterocromático em núcleos de células de haste semelhante ao encontrado com sinal de anticorpo 5mC (figuras 3 h e 3i).
A coloração de 5mC no INL e GCL era forte na chromocenters dos núcleos celulares e coloração fraca foi também observada em núcleos de células inteiras (figuras 3j-3L e 3r-3t). Em contraste com o 5mC, o sinal de 5hmC era localizado para os núcleos de célula inteira, exceto para o chromocenters no INL e GCL (figuras 3M-3o e 3u-3w). Observamos um fortes sinal de 5hmC, na periferia do núcleo de células GCL.
Em fotorreceptores de haste adultas, o sinal de 5mC era restrito à periferia nuclear dos núcleos celulares (figuras 4a-4C) e chromocenter, enquanto 5hmc sinal foi confinado à periferia nuclear (figuras 4 d-4f).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58274/58274fig1.jpg"> Figura 1. Localização da 5-metilcitosina e 5-Hidroximetilcitosina na retina do rato em embrionária dia 16. Immunostaining de retina C57BL/6J com anticorpos para 5mC (vermelho, um) e 5hmC (verde, b). No E16, 5mC sinal é muito forte no chromocenters dos núcleos celulares e também presente no núcleo celular em nível muito inferior. 5hmC coloração foi confinado exclusivamente para o núcleo de células. C painel representa 5mC mesclado e 5hmC imagem. Núcleos são counterstained com DAPI (azul, c). As inserções representam a ampliação da área mostrada com asterisco nas imagens. Barra de escala: 5 µm. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/58274/58274fig1large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58274/58274fig2.jpg"> Figura 2. Coloração imuno-histoquímica da 5-metilcitosina e 5-Hidroximetilcitosina na retina do rato no pós-Natal dia 0. Immunolabeling de retina C57BL/6J com anticorpos para 5mC (vermelho, um) e 5hmC (verde, b). Na retina de P0, 5mC e 5hmC estão presentes na camada exterior neuroblasto (ONBL) e camada interna neuroblasto (INBL). ) um 5mC sinal está fortemente presente na periferia nuclear dos núcleos celulares (seta) e chromocenters (seta). Coloração fraca de 5mC também é observada entre o chromocenters do núcleo de células. b) 5hmC coloração está confinado ao núcleo da célula e sinal forte é observada em INBL (linha pontilhada no painel c). C painel representa 5mC mesclado e 5hmC imagem. Núcleos são counterstained com DAPI (azul, c). As inserções representam a ampliação da área mostrada com asterisco nas imagens. Barra de escala: 5 µm. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/58274/58274fig2large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58274/58274fig3.jpg"> Figura 3. 5-metilcitosina e 5-Hidroximetilcitosina distribuição na retina do rato, no 15º dia pós-parto. Immunostaining de retina C57BL/6J com anticorpos anti-5mC e 5hmC (g, j-y). Na camada nuclear externa (ONL) (fotorreceptores haste), sinal de 5mC (vermelho, um) geralmente coincide com a chromocenters dos núcleos celulares (ponta de seta, b) e também se localiza à periferia nuclear (seta, b). Painel b (vermelho) e c (cinza) representam a ampliação da área mostrada com asterisco na imagem de um. O sinal de 5hmC (verde, d) limita-se aos núcleos do celular, exceto para o chromocenters. Painel e (verde) e f (cinza) representam a ampliação da área mostrada com asterisco na imagem d. painel g representa 5mC mesclado e 5hmC imagem. Núcleos são counterstained com DAPI. Painel h e eu somos imagem de microscópio eletrônico de transmissão de núcleos fotorreceptoras em distribuição de apresentando pós-Natal dia 15 de domínios heterocromático. Seta preta no painel h aponta para haste único fotoreceptor núcleo ampliado no painel i. setas vermelhas no painel que para domínios heterocromático dentro núcleo de fotorreceptoras haste ponto enquanto setas vermelhas apontam a heterocromatina na periferia nuclear. No INL (j-q) e núcleo de células GCL (r-y), o sinal de 5mC (vermelho) está localizado o chromocenters presente na periferia e coloração fraca também é detectado no resto dos núcleos celulares. Painel k (vermelho) e eu (cinza) representam a ampliação da área mostrada com asterisco em j a imagem. O 5hmC de coloração (verde) no núcleo de células INL e GCL está confinado ao núcleo da célula inteira. Note 5hmC forte coloração na periferia nuclear das células GCL. X e p painel representam 5mC mesclado e 5hmC imagem enquanto y e painel q representam a ampliação da área mostrada com asterisco na imagem p e x, respectivamente. Núcleos são counterstained com DAPI. Barra de escala: 5 µm. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/58274/58274fig3large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58274/58274fig4.jpg"> Figura 4. 5-metilcitosina 5-Hidroximetilcitosina distribuição e em núcleos de haste fotorreceptoras da retina do rato C57BL/6J em dia pós-natal 90. A coloração de 5mC (vermelho, um) está fortemente presente no chromocenter do núcleo de células e também fracamente presente na periferia nuclear. Painel b (vermelho) e c (cinza) representam a ampliação da área mostrada com asterisco na imagem de um. A coloração de 5hmC (verde, d) é exclusivamente confinada para o painel de periferia nuclear e (verde) e ampliação de representar f (cinza) da área mostrada com asterisco na imagem d. painel g representa 5mC mesclado e 5hmC imagem ao painel h é a ampliação da área mostrada com asterisco na imagem que g. núcleos são counterstained com DAPI (azul). Barra de escala: 5 µm. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/58274/58274fig4large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Immunohistochemical Detection of 5-Methylcytosine and 5-Hydroxymethylcytosine in Developing and Postmitotic Mouse Retina

Deteção de immunohistochemical da 5-metilcitosina e 5-Hidroximetilcitosina no desenvolvimento e Mouse Postmitotic Retina

O objetivo deste relato é descrever o protocolo para a deteção de imuno-histoquímica robusto de marcadores epigenéticas, 5-metilcitosina (5mC) e 5-Hidroximetilcitosina (5hmC) no desenvolvimento e postmitotic mouse retina.

The epigenetics of retinal development is a well-studied research field, which promises to bring a new level of understanding about the mechanisms of a ...

immunohistochemical-detection-5-methylcytosine-5

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

8.9K visualizações.  BioTime, Inc. O objetivo deste relato é descrever o protocolo para a deteção de imuno-histoquímica robusto de marcadores epigenéticas, 5-metilcitosina (5mC) e 5-Hidroximetilcitosina (5hmC) no desenvolvimento e postmitotic mouse retina.

Vídeo: Immunohistochemical Detection of 5-Methylcytosine and 5-Hydroxymethylcytosine in Developing and Postmitotic Mouse Retina

Immunostaining for DNA Modifications: Computational Analysis of Confocal Images

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of enzymatic oxidation of 5mC to 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) and 5-carboxylcytosine (5caC) as well as detection of N6-methyladenine (6mA) in the DNA of multicellular organisms provided additional degrees of complexity to the epigenetic research. According to a growing body of experimental evidence, these novel DNA modifications may play specific roles in different cellular and developmental processes. Importantly, as some of these marks (e. g. 5hmC, 5fC and 5caC) exhibit tissue- and developmental stage-specific occurrence in vertebrates, immunochemistry represents an important tool allowing assessment of spatial distribution of DNA modifications in different biological contexts. Here the methods for computational analysis of DNA modifications visualized by immunostaining followed by confocal microscopy are described. Specifically, the generation of 2.5 dimension (2.5D) signal intensity plots, signal intensity profiles, quantification of staining intensity in multiple cells and determination of signal colocalization coefficients are shown. Collectively, these techniques may be operational in evaluating the levels and localization of these DNA modifications in the nucleus, contributing to elucidating their biological roles in metazoans.

Newly discovered oxidized forms of 5-methylcytosine (oxi-mCs), 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) and 5-carboxylcytosine (5caC) may represent distinct DNA modifications with unique functional roles. Here a semi-quantitative workflow for visualization of oxi-mCs' spatial distribution, signal intensity profiling and colocalization is described.

Immunostaining para modificações do DNA: análise computacional de imagens Confocal

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of ...

Genética

High Sensitivity 5-hydroxymethylcytosine Detection in Balb/C Brain Tissue

DNA hydroxymethylation is a long known modification of DNA, but has recently become a focus in epigenetic research. Mammalian DNA is enzymatically modified at the 5th carbon position of cytosine (C) residues to 5-mC, predominately in the context of CpG dinucleotides. 5-mC is amenable to enzymatic oxidation to 5-hmC by the Tet family of enzymes, which are believed to be involved in development and disease. Currently, the biological role of 5-hmC is not fully understood, but is generating a lot of interest due to its potential as a biomarker. This is due to several groundbreaking studies identifying 5-hydroxymethylcytosine in mouse embryonic stem (ES) and neuronal cells. Research techniques, including bisulfite sequencing methods, are unable to easily distinguish between 5-mC and 5-hmC . A few protocols exist that can measure global amounts of 5-hydroxymethylcytosine in the genome, including liquid chromatography coupled with mass spectrometry analysis or thin layer chromatography of single nucleosides digested from genomic DNA. Antibodies that target 5-hydroxymethylcytosine also exist, which can be used for dot blot analysis, immunofluorescence, or precipitation of hydroxymethylated DNA, but these antibodies do not have single base resolution.In addition, resolution depends on the size of the immunoprecipitated DNA and for microarray experiments, depends on probe design. Since it is unknown exactly where 5-hydroxymethylcytosine exists in the genome or its role in epigenetic regulation, new techniques are required that can identify locus specific hydroxymethylation. The EpiMark 5-hmC and 5-mC Analysis Kit provides a solution for distinguishing between these two modifications at specific loci. The EpiMark 5-hmC and 5-mC Analysis Kit is a simple and robust method for the identification and quantitation of 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine within a specific DNA locus. This enzymatic approach utilizes the differential methylation sensitivity of the isoschizomers MspI and HpaII in a simple 3-step protocol. Genomic DNA of interest is treated with T4-BGT, adding a glucose moeity to 5-hydroxymethylcytosine. This reaction is sequence-independent, therefore all 5-hmC will be glucosylated; unmodified or 5-mC containing DNA will not be affected. This glucosylation is then followed by restriction endonuclease digestion. MspI and HpaII recognize the same sequence (CCGG) but are sensitive to different methylation states. HpaII cleaves only a completely unmodified site: any modification (5-mC, 5-hmC or 5-ghmC) at either cytosine blocks cleavage. MspI recognizes and cleaves 5-mC and 5-hmC, but not 5-ghmC. The third part of the protocol is interrogation of the locus by PCR. As little as 20 ng of input DNA can be used. Amplification of the experimental (glucosylated and digested) and control (mock glucosylated and digested) target DNA with primers flanking a CCGG site of interest (100-200 bp) is performed. If the CpG site contains 5-hydroxymethylcytosine, a band is detected after glucosylation and digestion, but not in the non-glucosylated control reaction. Real time PCR will give an approximation of how much hydroxymethylcytosine is in this particular site. In this experiment, we will analyze the 5-hydroxymethylcytosine amount in a mouse Babl/C brain sample by end point PCR.

The EpiMark 5-hmC and 5-mC Analysis Kit can be used to analyze and quantitate 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine within a spe cific locus. The kit distinguishes 5-mC from 5-hmC by the addition of glucose to the hydroxyl group of 5-hmC via an enzymatic reaction utilizing &beta;-glucosyltransferase (T4-BGT). When 5-hmC occurs In the context of CCGG, this modification converts a cleavable MspI site to a non-cleavable site.

Alta Sensibilidade de Detecção de 5 hydroxymethylcytosine-in Balb / C Tecido Cerebral

DNA hydroxymethylation is a long known modification of DNA, but has recently become a focus in epigenetic research.   Mammalian DNA is enzymatically ...

Neurociência

Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

Angiogenesis is the complex process of new blood vessel formation defined by the sprouting of new blood vessels from a pre-existing vessel network. Angiogenesis plays a key role not only in normal development of organs and tissues, but also in many diseases in which blood vessel formation is dysregulated, such as cancer, blindness and ischemic diseases. In adult life, blood vessels are generally quiescent so angiogenesis is an important target for novel drug development to try and regulate new vessel formation specifically in disease. In order to better understand angiogenesis and to develop appropriate strategies to regulate it, models are required that accurately reflect the different biological steps that are involved. The mouse neonatal retina provides an excellent model of angiogenesis because arteries, veins and capillaries develop to form a vascular plexus during the first week after birth. This model also has the advantage of having a two-dimensional (2D) structure making analysis straightforward compared with the complex 3D anatomy of other vascular networks. By analyzing the retinal vascular plexus at different times after birth, it is possible to observe the various stages of angiogenesis under the microscope. This article demonstrates a straightforward procedure for analyzing the vasculature of a mouse retina using fluorescent staining with isolectin and vascular specific antibodies.

Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

The neonatal murine retina provides a well characterized physiological model of angiogenesis, which permits investigations of the roles of different genes or drugs that modulate angiogenesis in an in vivo context. Immunofluorescent staining to accurately visualize the vascular plexus is pivotal to the success of these types of studies.

Whole Mount coloração de imunofluorescência do Rato Retina Neonatal para investigar angiogênese<em&gt; In vivo</em

Angiogenesis  is the complex process of new blood vessel formation defined by the sprouting  of new blood vessels from a pre-existing vessel network. ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the developing cerebral cortex, abnormal mitosis of neural progenitors can cause defects in brain size and function. Hence, there is a critical need for tools to understand the mechanisms of neural progenitor mitosis. Cortical development in rodents is an outstanding model for studying this process. Neural progenitor mitosis is commonly examined in fixed brain sections. This protocol will describe in detail an approach for live imaging of mitosis in ex vivo embryonic brain slices. We will describe the critical steps for this procedure, which include: brain extraction, brain embedding, vibratome sectioning of brain slices, staining and culturing of slices, and time-lapse imaging. We will then demonstrate and describe in detail how to perform post-acquisition analysis of mitosis. We include representative results from this assay using the vital dye Syto11, transgenic mice (histone H2B-EGFP and centrin-EGFP), and in utero electroporation (mCherry-&#945;-tubulin). We will discuss how this procedure can be best optimized and how it can be modified for study of genetic regulation of mitosis. Live imaging of mitosis in brain slices is a flexible approach to assess the impact of age, anatomy, and genetic perturbation in a controlled environment, and to generate a large amount of data with high temporal and spatial resolution. Hence this protocol will complement existing tools for analysis of neural progenitor mitosis.

Neural progenitor mitosis is a critical parameter of neurogenesis. Much of our understanding of neural progenitor mitosis is based on analysis of fixed tissue. Live imaging in embryonic brain slices is a versatile technique to assess mitosis with high temporal and spatial resolution in a controlled environment.

Imagens ao vivo da mitose no desenvolvimento Cortex embrionárias de camundongos

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

Rapid and Efficient Spatiotemporal Monitoring of Normal and Aberrant Cytosine Methylation within Intact Zebrafish Embryos

Cytosine methylation is highly conserved across vertebrate species and, as a key driver of epigenetic programming and chromatin state, plays a critical role in early embryonic development. Enzymatic modifications drive active methylation and demethylation of cytosine into 5-methylcytosine (5-mC) and subsequent oxidation of 5-mC into 5-hydroxymethylcytosine, 5-formylcytosine, and 5-carboxylcytosine. Epigenetic reprogramming is a critical period during in utero development, and maternal exposure to chemicals has the potential to reprogram the epigenome within offspring. This can potentially cause adverse outcomes such as immediate phenotypic consequences, long-term effects on adult disease susceptibility, and transgenerational effects of inherited epigenetic marks. Although bisulfite-based sequencing enables investigators to interrogate cytosine methylation at base-pair resolution, sequencing-based approaches are cost-prohibitive and, as such, preclude the ability to monitor cytosine methylation across developmental stages, multiple concentrations per chemical, and replicate embryos per treatment. Due to the ease of automated in vivo imaging, genetic manipulations, rapid ex utero development time, and husbandry during embryogenesis, zebrafish embryos continue to be used as a physiologically intact model for uncovering xenobiotic-mediated pathways that contribute to adverse outcomes during early embryonic development. Therefore, using commercially available 5-mC-specific antibodies, we describe a cost-effective strategy for rapid and efficient spatiotemporal monitoring of cytosine methylation within individual, intact zebrafish embryos by leveraging whole-mount immunohistochemistry, automated high-content imaging, and efficient data processing using programming language prior to statistical analysis. To current knowledge, this method is the first to successfully detect and quantify 5-mC levels in situ within zebrafish embryos during early development. The method enables the detection of DNA methylation within the cell mass and also has the ability to detect cytosine methylation of yolk-localized maternal mRNAs during the maternal-to-zygotic transition. Overall, this method will be useful for the rapid identification of chemicals that have the potential to disrupt cytosine methylation in situ during epigenetic reprogramming.

This paper describes a protocol for the rapid and efficient spatiotemporal monitoring of normal and aberrant cytosine methylation within intact zebrafish embryos.

Monitoramento espaço-temporal rápido e eficiente da metilação normal e aberrante da citosina em embriões intactos de peixe-zebra

Cytosine methylation is highly conserved across vertebrate species and, as a key driver of epigenetic programming and chromatin state, plays a critical ...

Biologia do Desenvolvimento

Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene expression, maintenance of genome integrity, parental imprinting, X-chromosome inactivation, regulation of development, aging, and cancer1. Recently, the presence of an oxidized 5-mC, 5-hydroxymethylcytosine (5-hmC), was discovered in mammalian cells, in particular in embryonic stem (ES) cells and neuronal cells2-4. 5-hmC is generated by oxidation of 5-mC catalyzed by TET family iron (II)/&alpha;-ketoglutarate-dependent dioxygenases2, 3. 5-hmC is proposed to be involved in the maintenance of embryonic stem (mES) cell, normal hematopoiesis and malignancies, and zygote development2, 5-10. To better understand the function of 5-hmC, a reliable and straightforward sequencing system is essential. Traditional bisulfite sequencing cannot distinguish 5-hmC from 5-mC11. To unravel the biology of 5-hmC, we have developed a highly efficient and selective chemical approach to label and capture 5-hmC, taking advantage of a bacteriophage enzyme that adds a glucose moiety to 5-hmC specifically12.
Here we describe a straightforward two-step procedure for selective chemical labeling of 5-hmC. In the first labeling step, 5-hmC in genomic DNA is labeled with a 6-azide-glucose catalyzed by &beta;-GT, a glucosyltransferase from T4 bacteriophage, in a way that transfers the 6-azide-glucose to 5-hmC from the modified cofactor, UDP-6-N3-Glc (6-N3UDPG). In the second step, biotinylation, a disulfide biotin linker is attached to the azide group by click chemistry. Both steps are highly specific and efficient, leading to complete labeling regardless of the abundance of 5-hmC in genomic regions and giving extremely low background. Following biotinylation of 5-hmC, the 5-hmC-containing DNA fragments are then selectively captured using streptavidin beads in a density-independent manner. The resulting 5-hmC-enriched DNA fragments could be used for downstream analyses, including next-generation sequencing.
Our selective labeling and capture protocol confers high sensitivity, applicable to any source of genomic DNA with variable/diverse 5-hmC abundances. Although the main purpose of this protocol is its downstream application (i.e., next-generation sequencing to map out the 5-hmC distribution in genome), it is compatible with single-molecule, real-time SMRT (DNA) sequencing, which is capable of delivering single-base resolution sequencing of 5-hmC.

Described is a two-step labeling process using &beta;-glucosyltransferase (&beta;-GT) to transfer an azide-glucose to 5-hmC, followed by click chemistry to transfer a biotin linker for easy and density-independent enrichment. This efficient and specific labeling method enables enrichment of 5-hmC with extremely low background and high-throughput epigenomic mapping via next-generation sequencing.

Captura selectivo de 5-hydroxymethylcytosine a partir de DNA genómico

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene ...

Biologia

The Detection of 5-Hydroxymethylcytosine in Neural Stem Cells and Brains of Mice

Multiple&#160;DNA modifications have been identified in the mammalian genome. Of that, 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine-mediated epigenetic mechanisms have been intensively studied. 5-hydroxymethylcytosine displays dynamic features during embryonic and postnatal development of the brain, plays a regulatory function in gene expression, and is involved in multiple neurological disorders. Here, we describe the detailed methods including immunofluorescence staining and&#160;DNA dot-blot to detect 5-hydroxymethylcytosine in cultured cells and brain tissues of mouse.

Here, we present a protocol to detect 5-hydroxymethylcytosine in cells and brain tissues, utilizing immunofluorescence staining and DNA dot-blot methods.

A detecção de 5-Hidroximetilcitosina em células-tronco neurais e cérebros de camundongos

Multiple&#160;DNA modifications have been identified in the mammalian genome. Of that, 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine-mediated epigenetic ...

Detection of Modified Forms of Cytosine Using Sensitive Immunohistochemistry

Methylation of cytosine bases (5-methylcytosine, 5mC) occurring in vertebrate genomes is usually associated with transcriptional silencing. 5-hydroxylmethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC), and 5-carboxylcytosine (5caC) are the recently discovered modified cytosine bases produced by enzymatic oxidation of 5mC, whose biological functions remain relatively obscure. A number of approaches ranging from biochemical to antibody based techniques have been employed to study the genomic distribution and global content of these modifications in various biological systems. Although some of these approaches can be useful for quantitative assessment of these modified forms of 5mC, most of these methods do not provide any spatial information regarding the distribution of these DNA modifications in different cell types, required for correct understanding of their functional roles. Here we present a highly sensitive method for immunochemical detection of the modified forms of cytosine. This method permits co-detection of these epigenetic marks with protein lineage markers and can be employed to study their nuclear localization, thus, contributing to deciphering their potential biological roles in different experimental contexts.

Herein we describe a sensitive immunochemical method for mapping the spatial distribution of 5mC oxidation derivatives based on the use of peroxidase-conjugated secondary antibodies and tyramide signal amplification.

Detecção de formas modificadas da citosina Utilizando imunohistoquímica Sensível

Methylation of cytosine bases (5-methylcytosine, 5mC) occurring in vertebrate genomes is usually associated with transcriptional silencing. ...

Cryosectioning and Immunostaining of Mouse Retina

Tissue sectioning and immunohistochemistry are essential techniques in histological and pathological studies of retinal diseases using animal models. These methods enable detailed examinations of tissue morphologies and the localization of specific proteins within the tissue, which provide valuable insights into disease processes and mechanisms. Mice are the most widely used model for this purpose. However, because mouse eyeballs are small and mouse retinas are extremely delicate tissues, obtaining high-quality retinal sections and immunostaining images from mouse eyeballs is typically challenging. This study describes an improved protocol for cryosectioning mouse retinas and performing immunohistochemistry. An essential point of this protocol involves coating the eyeball with a layer of super glue, which prevents deformation of the eyeballs during the processes of cornea removal, lens extraction, and embedding. This step ensures the integrity of retinal morphologies is well preserved. This protocol highlights critical technical considerations and optimization strategies for consistently producing high-quality retinal sections and achieving excellent immunostaining results.

A protocol for preparing mouse retinal cryosections and performing immunostaining on photoreceptors is described. This article enables researchers to consistently produce mouse retinal frozen sections with well-preserved morphology and high-quality immunostaining results.

Crioseccionamento e imunocoloração da retina de camundongos

Tissue sectioning and immunohistochemistry are essential techniques in histological and pathological studies of retinal diseases using animal models. ...

5-Methylcytosine Dot Blot to Determine the Extent of DNA Methylation

Start this procedure by denaturing the isolated DNA in 0.1 molar sodium hydroxide for 10 minutes at 95 degrees Celsius. Neutralize the DNA with 1 molar ammonium acetate on ice, and then dilute two-fold with double-distilled water.
The most critical step in the dot blot is the spotting of the samples onto the membrane, do it slowly, and carefully. Try to minimize each spotted area to 3 to 4 millimeters in diameter.
Using a narrow-mouth pipette tip, carefully spot 2 microliters of the serial diluted genomic DNA onto a positively-charged nylon membrane at the center of the grid. Blot the membrane at 80 degrees Celsius for 30 minutes. Next, block the non-specific antibody binding sites by soaking the membrane in 5% BSA in TBST in a 10-centimeter Petri dish for 1 hour at room temperature with gentle shaking.
After 1 hour, wash the membrane three times in TBST for 5 minutes each time. Incubate the membrane with a mouse anti-5-methylcytosine monoclonal antibody in TBST at 4 degrees Celsius overnight. On the following day, wash the membrane three times in TBST for 5 minutes each time.
Then, incubate with a secondary antibody &#8212; horseradish peroxidase-conjugated sheep anti-mouse immunoglobulin G in TBST for one hour at room temperature. After washing the membrane in TBST as before, add the enzyme substrate to the membrane, and incubate for 5 to 10 minutes. Finally, visualize the secondary antibody signal using a chemiluminescence kit according to the manufacturer&#39;s instructions.

Deteção de immunohistochemical da 5-metilcitosina e 5-Hidroximetilcitosina no desenvolvimento e Mouse Postmitotic Retina

Resumo

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