Name: toluidine blue staining of resin-embedded sections for evaluation of peripheral nerve morphology
Uploaded: 2018-07-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
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Os autores gostaria fizeram instalações de microscopia Jenkins na Universidade de Wyoming para a ajuda deles e os membros do laboratório Bushman, Kelly Roballo, Hayden True, Wupu Osimanjiang e Dhunghana eleomar, para assistência em cuidados com animais. Esta publicação foi tornada possível através de um prêmio de desenvolvimento institucional (ideia) do Instituto Nacional de General Medical Ciências, do institutos nacionais da saúde sob Grant # 2P20GM103432.

Utilizaram-se ratos Sprague Dawley adulto neste projeto e todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de uso e cuidados com animais institucional Universidade de Wyoming.
1. cirurgia e na fixação de nervo Vivo
Nota: Informações do fornecedor para todos os materiais e equipamentos utilizados no presente protocolo são listados na Tabela de materiais.
Nota: Fixação do nervo na vivo é usada para preservar o tecido e reduzir a degradação estrutural que pode ocorrer entre o momento da morte e a coleção dos nervos. Fixação de tecidos in vivo é uma prática padrão para a preparação do tecido do sistema nervoso para histologia, onde a perfusão geralmente é um precursor para isto. A colocação e o tamanho dos nervos periféricos permitido para fixação in situ. Não recomendamos coleção e fixação do tecido após a eutanásia devido à possibilidade de degradação de tecidos.
<ol><li>Preparar o rato para anestesia geral, colocando-o em uma câmara de indução com 2-3% de isoflurano, em seguida, coloque o rato anestesiado de bruços em cima de uma esteira de dissecação e mantenha 1-2% de isoflurano através do cone de nariz anestésica. Para garantir a adequada profundidade da anestesia, teste de animais para a retirada de pedal para as patas e verificar a ausência de reflexos palpebrais os olhos tocando o canto medial do olho. Nota: Injeção Intraperitoneal de cetamina é uma alternativa comumente usada para isoflurano inalado.</li>
	<li>Para expor o nervo ciático, raspar o cabelo da hind limb(s) e limpar as áreas depiladas com etanol a 70%. Com um bisturi ou tesoura, faça uma incisão de 2-3 cm na pele ao longo do membro posterior do joelho até o trocanter maior, onde a palpação do fêmur com o bisturi estéril para assegurar a localização adequada da incisão. O fêmur situa-se imediatamente proximal ao segmento mais acessível do nervo ciático. Mesmo que esta é uma cirurgia não-sobrevivência, manter técnicas estéreis.</li>
	<li>Depois de fazer a incisão da pele, localizar o avião entre os músculos bíceps femoral e o músculo glúteo máximo e usando uma tesoura microdissection separados da fáscia subjacente e expor 2-3cm do nervo ciático de sublinhado. Para expor uma clara secção do nervo ciático, use um afastador para alargar o fosso entre os dois músculos (figura 1A). Com pinça fina e tesoura de íris, separe com cuidado o nervo do tecido conjuntivo, tomando muito cuidado para não comprimir ou cortado o nervo circundante.</li>
	<li>Adicione o fixador do Trump suficientes (formol 4%, 1% de glutaraldeído em 1X PBS (solução salina tamponada fosfato) com 1,16 g de NaH2PO4· H2O, por 100 mL) na cavidade que contém o nervo exposto, para cobrir a lata e deixe descansar por 10 min. Se necessário, lugar de gaze sob o hind perna melhorar o ângulo para que mais fixador pode ser adicionado na cavidade. Retire o fixador após 10 min e repita mais duas vezes.</li>
	<li>Usando um microscópio de dissecação, cortou o nervo de ambos os lados com uma tesoura bem dissecação, certificando-se não esticar ou beliscar o nervo ciático e imediatamente colocar as seções de nervo em tubos de 15 mL contendo fixador do Trump a 4 ° C, durante uma semana, alterando o fixador a cada 48 h.</li>
	<li>Não abandone animais durante qualquer parte do procedimento cirúrgico. Após a remoção do nervo, eutanásia em animais por deslocamento cervical sob anestesia.</li>
</ol>2. tratamento tetróxido de ósmio e a incorporação de resina
<ol><li>Fixação de postar, cuidadosamente remover qualquer gordura restante e tecidos conjuntivos do nervo e usar um bisturi afiado para cortar o nervo em segmentos de aproximadamente 5 mm de comprimento (nervo segmentos podem ser separados e etiquetados em tubos de diferentes). Tetróxido de ósmio fresco 2% diluído em solução fixador do Trump de preparar e manter em um tubo de vidro. Mergulhe os segmentos nervosos em tetróxido de ósmio de 2% por 2 h, que pode ser em tubos de plástico para este curto período de tempo. Nota: Alguns tubos de plástico reagem com tetróxido de ósmio, causando um escurecimento da solução, por armazenamento prolongado de tetróxido de ósmio em tubos de plástico não é recomendado.</li>
	<li>Usando um kit de médio a incorporação de epóxi, prepare a fórmula final de incorporação:<ol>
<li>Misture a cola epoxy incorporação médio com solução DDSA (anidrido dodecenylsuccinic; mistura A) e misture o epóxi incorporação médio com solução NMA (anidrido methylnadic; mistura B). Deixe ambas as misturas A e B misturam pelo menos 20 min por agitação com um agitador magnético.</li>
		<li>Imediatamente antes do uso, misture a mistura A e B e adicione o acelerador do DPM-30 (2,4,6-tris(dimethylaminomethyl)phenol) na proporção de 1,5 a 2,0% do volume total da mistura. Observe que a solução do DPM-30 deve ser medida precisamente para impedir que o bloco se tornando escuro na cor e quebradiços. Todos os produtos químicos de resina são tóxicos; Tome cuidado extra para evitar o contacto com a pele ou por inalação.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Usando tubos de 1,5 mL, lavar segmentos nervosos com PBS e iniciar o processo de desidratação, colocando os segmentos nervosos em acetona/destilada diferentes passagens de água: 30%, 60%, 90%, as concentrações de 10 min cada e, em seguida, em 100% de acetona por 10 min cada por 3 vezes.  Observe que o etanol pode ser usado no lugar da acetona.</li>
	<li>Para a infiltração de resina, coloque os segmentos nervosos em uma mistura de 1 parte de mistura de incorporação final e 1 parte 100% acetona por 30 min, em seguida, em uma mistura de 2 partes de mistura de incorporação final e 1 parte 100% acetona por 30 min , e finalmente o lugar do nervo segmentos na final incorporação mistura por 30 min.</li>
	<li>Colocar os segmentos nervosos em borracha de silicone, moldes de incorporação (tenho usado o comprimento de 106 mm x 71 mm de largura x 7 mm de profundidade; bloquear tamanho 11 mm de comprimento x 6 mm de largura x 3 mm de profundidade). Adicione delicadamente a resina em cima dos nervos, certificando-se de cobrir os segmentos todo nervo e evitar bolhas de ar. Deixe o molde contendo segmentos nervosos com a resina para polimerizar a 60 ° C durante a noite.</li>
</ol>3. corte por Ultramicrotome
<ol><li>Facas de vidro usando uma máquina de faca de vidro (figura 1B) de preparar e fazer facas de vidro com barcos (Figura 1), que são usados para recolher seções de nervo que flutua na água destilada.</li>
	<li>Resina de lugar incorporado bloqueios no porta-ultramicrotome com a trapezoidal virados para cima. Usando o escopo de ultramicrotome, apare qualquer excesso de resina ao redor do tecido nervoso e fazer com que o bloco de enfrentar uma forma trapezoidal e quanto perto da superfície longitudinal do nervo possível usando uma único-lamina, como uma lâmina de barbear. Não penetram a superfície longitudinal do segmento do nervo, que é reconhecido por sua coloração escura por tetróxido de ósmio. Nota: Remoção de excesso de resina irá reduzir a área de resina para ser seccionado e melhorar o desempenho da lâmina e corte em etapas subsequentes.</li>
	<li>Usando o ultramicrotome, fazer várias seções de cruz suficientes para expor uma superfície uniforme de seção transversal do tecido nervoso usando uma faca de vidro liso. Depois disso, alterne para uma faca de vidro cujo barco é preenchido com água destilada à temperatura ambiente e ajustar o ultramicrotome para 1-2 μm para cortar seções finas.</li>
	<li>Transferi flutuantes seções finas do barco de faca de vidro para uma gota de água deionizada na lâmina de vidro usando metal loop (Figura 1). Secar slides contendo seções passando várias vezes sobre uma chama por alguns segundos, certificando-se de não superaquecer as seções. Mancha secadas seções imediatamente com toluidina azul ou armazenar à temperatura ambiente durante vários dias antes da coloração. Nota: As seções podem também ser secadas usando um prato quente a 60 ° C por 15 min. Um processo de secagem lento faz com que as seções suave.</li>
</ol>4. azul de toluidina coloração
<ol><li>Preparar a solução de azul de toluidina 1% pela dissolução de 2 g de borato de sódio em 100 mL de água desionizada, em seguida, adicionar 1 g de azul de toluidina e mexa até dissolver. Filtrar a solução usando papel de filtro (reduz o tamanho dos poros: 11 µm) e manter a solução em um frasco opaco em temperatura ambiente por até duas semanas.</li>
	<li>Utilizando uma pipeta plástica ou micro pipeta, adicione uma gota de solução de azul de toluidina no topo as seções de nervo e deixar por 20-30 s.</li>
	<li>Enxaguar com solução de azul de toluidina todo excesso mergulhando suavemente as lâminas em frasco de água desionizada e repita 3 - 4 vezes até seções são claras. Seque o slides pelo menos 15 min a 60 ° C, ou durante a noite à temperatura ambiente e em seguida, cubra as seções com uma lamela utilizando o meio de montagem regular. Examinar os slides montados imediatamente ou armazenar à temperatura ambiente.</li>
	<li>Examine sob um microscópio de luz. Uma lente de imersão de óleo X 100 é recomendado para imagens detalhadas, usadas para calcular índices de g.</li>
</ol>

<ol>
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Os autores declaram que têm não há conflitos de interesse.

Exames das estruturas morfológicas da lesão de nervo periférico e regeneração são temas frequentes de estudo13. Este protocolo, descreveremos os passos para obter imagens de alta qualidade para quantificações dados histológicos utilizando tecido de nervo ciático rato incorporado em blocos de resina e corados com azul de toluidina. Esta técnica fornece uma imagem da morfologia do nervo em que a regeneração do nervo pode ser quantificada através da medição do número de axônios, gra...

Nervos periféricos se estendem por todo o corpo, que inervam tecidos-alvo com axônios sensoriais ou motor1. Nervo periférico defeitos causados por doenças e trauma representam uma preocupação de saúde pública e tem grandes impactos econômicos2,3. Apesar dos progressos em avaliar os resultados de lesões nervosas periféricas e entendendo a regeneração do nervo, métodos tradicionais como nervo histologia e técnicas de coloração são ferramentas essenciais para qualitativa e quantitativamente avaliar saúde do nervo como uma medida de resultado terminal em modelos animais ou tecidos humanos extirpado. Isto frequentemente é emparelhado com medições eletrofisiológicas da função do nervo periférico, onde a morfometria pode revelar por regeneração nervosa funcional fez ou não ocorreu.
Azul de toluidina a coloração das seções de nervo periférico semi fina de resina incorporada é um método especializado para as fibras nervosas mielinizadas, proporcionando alta qualidade de imagem e claro imagens detalhadas de nervo estruturas4,5,6 . Azul de toluidina é uma mancha metachromatic acidófilo, descoberta por William Henry Perkin em 1856,7e tem sido utilizada em várias aplicações médicas8. Seções de nervo periférico manchadas de azul de toluidina obtidas de segmentos nervosos resina-incorporado permite a clara visualização das estruturas nervosas. Visualização da bainha de mielina estrutura pode ser reforçada pelo uso de tetróxido de ósmio pós-fixação4,9. Tetróxido de ósmio é um oxidante e lipídios fixador agente tóxico que interage com as ligações duplas em lipídios, resultando em bainhas de mielina rica em lipídios starkly definidos10. No entanto, tetróxido de ósmio é tóxico, caro, exige uma maior incubação de segmentos nervosos e não é sempre usado.
Métodos alternativos de processamento e coloração foram desenvolvidos para visualização da morfologia do nervo periférico; Parafina, criogênico de corte e seccionamento de nervo incorporado de resina epóxi seguiram de coloração com azul de toluidina ou fenilenodiamina solução tem sido usada para quantificar as alterações morfológicas da regeneração de nervo periférico 11,12 . Esses métodos têm suas vantagens e rendimento dados essenciais sobre o número de axônios, espessura da mielina, diâmetro do axônio e diâmetro do axônio para fibras mielinizadas diâmetro (g-ratio) 11,13,14,15 .
A principal distinção de resina-incorporação neste protocolo é que facilita a obtenção de secções de espessura 1-2 μm devido a dureza da resina, mantendo as qualidades histológicas do nervo. Estas seções finas, em oposição as 4-5 μm seções de espessura obtidas de parafina de incorporação, fornecem seções de nervo periférico com maior resolução, permitindo uma quantificação mais precisa de mielinização axônio, tais como o g-relação, que não pode ser Obtido a partir de secções mais espessas16. Enquanto criogênico de corte pode ser usado para obter seções de 1-2 µm, tem sido nossa experiência que é mais difícil obter seções sem numerosas fissuras grandes. Tais seções rachadas podem causar impreciso contagem do número de axônios e aspectos da mielinização.
Além do azul de toluidina coloração17, uma prata coloração método18 e de coloração tricromo de Masson4 também pode ser usada para mostrar os axônios do nervo. No entanto, usar resina incorporação das seções do nervo mediano de rato corados com hematoxilina e eosina ou de Masson tricromo mostrou fracas bainhas de mielina e estruturas não reconhecidas, Considerando que a coloração azul de toluidina mostrou imagem clara da bainha de mielina e pode facilmente ser quantificados4. Apesar de algumas limitações, nervos de toluidina azul coloração de resina incorporada periférica é uma valiosa técnica que pode ser usada quando as imagens de alta resolução da morfologia do nervo são necessárias.
A principal desvantagem para a incorporação de resina é que é demorado e não permite a imunocoloração do mesmo tecido devido à dificuldade de recuperação do antígeno quando comparado com parafina e congelados incorporado seções técnicas. Assim, não é geralmente possível utilizar o mesmo tecido para immunostaining é processado através de incorporação de resina para coloração de azul de toluidina. Embora não usado aqui, se é desejado a imuno-histoquímica em resina seções incorporadas, a utilização de resinas de incorporação de metacrilato de glicol permite imuno-histoquímica ser executada em cortes de tecido, mas é relativamente caro19. Isto pode ser um pouco atenuado pelo corte do nervo periférico em segmentos separados, alguns para a incorporação de resina e outros por imunocoloração diretamente após a fixação.
O processo de coloração de azul de toluidina de resina incorporado os nervos periféricos, como com análise histopatológica mais, pode ser dividido em cinco etapas, incluindo fixação, desidratação, incorporação, corte e coloração20. Pretendemos fornecer um protocolo e orientação prática para usar resina seções do nervo ciático de rato incorporado com imagens de alta qualidade de toluidina azul para adquirir.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&#039;s Phosphate Buffer Saline</td><td>Gibco</td><td>14200-075</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyde Solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6257</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>Toluidine Blue O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3260</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Tetraborate Decahydrate</td><td>Acros Organics</td><td>205950010</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Piramal</td><td>NDC 66794-013-25</td><td></td></tr><tr><td>Epoxy Embedding Medium Kit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>45359</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Hydroxide Solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>72068</td><td>To adjust Trump&#039;s fixative pH</td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Fisher Chemical</td><td>170942</td><td></td></tr><tr><td>Osmium Tetroxide Solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>75632</td><td></td></tr><tr><td>VWR Micro Slides, Superfrost Plus</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Cover Glass</td><td>Fisher Scientific</td><td>12545102</td><td></td></tr><tr><td>Pelco Embedding Cast</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9671811</td><td></td></tr><tr><td>Glass Knife Maker</td><td>RMC Products</td><td>GKM-2</td><td></td></tr><tr><td>Ultramicrotome</td><td>RMC Products</td><td>MT-XL</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Conical Tube</td><td>Falcon</td><td>ISO 9001</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 1.5 mL microcentrifuge tubes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9661</td><td></td></tr><tr><td>4 mL Glass Vial</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>854190</td><td></td></tr><tr><td>Razor Blades</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td>For trimming resin block</td></tr><tr><td>Perfect Loop</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>70944</td><td>For picking up thin resin sections</td></tr><tr><td>Ultra Glass Knife Strips 6.4 mm x 25 mm x 400 mm</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>71012</td><td></td></tr><tr><td>100 Watt Oven</td><td>Millipore&amp;nbsp;</td><td>6350115</td><td></td></tr><tr><td>Whatman Filter Paper</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WHA10010155</td><td></td></tr><tr><td>3 mL plastic pipette</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z331740</td><td></td></tr><tr><td>Micro-surgical Kit</td><td>World precision instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Olympus fluorescence microscope</td><td></td><td></td><td>Dual CCD Color and Monochrome Camera, DP80</td></tr></tbody></table>

toluidine blue staining of resin-embedded sections for evaluation of peripheral nerve morphology

Nervos periféricos se estendem por todo o corpo, que inervam tecidos-alvo com axônios motor ou sensoriais. Devido à ampla distribuição, nervos periféricos são frequentemente danificados devido a trauma ou doença. Como métodos e estratégias foram desenvolvidas para avaliar lesão de nervo periférico em modelos animais, função e regeneração, analisando a morfometria do nervo periférico tornou-se uma medida de resultado terminal essencial. Seções de toluidina azul coloração do nervo Cruz obtidas de seções de nervo resina incorporada é um método reprodutível para avaliações qualitativas e quantitativas dos nervos periféricos, permitindo a visualização do número de morfologia de axônios e grau de mielinização. Esta técnica, tal como acontece com muitos outros métodos histológicos, pode ser difícil de aprender e dominar usando protocolos padrão de escrita. A intenção desta publicação é, portanto acentuar a protocolos escritos para toluidina azul coloração de nervos periféricos com Videografia do método, usando os nervos ciático de ratos colhidos. Neste protocolo, descrevemos na vivo fixação de nervo periférico e coleta do tecido e pós-fixação com 2% de tetróxido de ósmio, incorporação de nervos em resina epóxi e ultramicrotome de seccionamento dos nervos a espessura de 1-2μm. Seções do nervo, em seguida, transferido para uma lâmina de vidro e corados com azul de toluidina, após o qual são quantitativamente e qualitativamente avaliados. São mostrados exemplos dos problemas mais comuns, bem como medidas para atenuar esses problemas.

Resina incorporado seções manchadas de toluidina azuis permitem quantificações dados histológicos precisos de nervo periférico. Uma visão geral do processo é mostrada na (Figura 2). Seções de nervos ciático incorporado no meio de resina e corados com azul de toluidina mostrou clara imagens com resolução ideal (figuras 3). Dano do nervo pode causar muitas alterações no nervo estruturas morfológicas, por exemplo, mudanças nas f...

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Toluidine Blue Staining of Resin-Embedded Sections for Evaluation of Peripheral Nerve Morphology

Aqui nós apresentamos um protocolo para visualizar belas estruturas de nervos periféricos obtendo e seções de 1-2 µm com toluidina a coloração azul

Azul de toluidina mancha de resina-incorporado seções para avaliação da morfologia do nervo periférico

Peripheral nerves extend throughout the body, innervating target tissues with motor or sensory axons. Due to widespread distribution, peripheral nerves ...

toluidine-blue-staining-resin-embedded-sections-for-evaluation

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

18.8K visualizações.  University of Wyoming. Aqui nós apresentamos um protocolo para visualizar belas estruturas de nervos periféricos obtendo e seções de 1-2 µm com toluidina a coloração azul

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Combining Lipophilic dye, in situ Hybridization, Immunohistochemistry, and Histology

Going beyond single gene function to cut deeper into gene regulatory networks requires multiple mutations combined in a single animal. Such analysis of two or more genes needs to be complemented with in situ hybridization of other genes, or immunohistochemistry of their proteins, both in whole mounted developing organs or sections for detailed resolution of the cellular and tissue expression alterations. Combining multiple gene alterations requires the use of cre or flipase to conditionally delete genes and avoid embryonic lethality. Required breeding schemes dramatically enhance effort and cost proportional to the number of genes mutated, with an outcome of very few animals with the full repertoire of genetic modifications desired. Amortizing the vast amount of effort and time to obtain these few precious specimens that are carrying multiple mutations necessitates tissue optimization. Moreover, investigating a single animal with multiple techniques makes it easier to correlate gene deletion defects with expression profiles. We have developed a technique to obtain a more thorough analysis of a given animal; with the ability to analyze several different histologically recognizable structures as well as gene and protein expression all from the same specimen in both whole mounted organs and sections. Although mice have been utilized to demonstrate the effectiveness of this technique it can be applied to a wide array of animals. To do this we combine lipophilic dye tracing, whole mount in situ hybridization, immunohistochemistry, and histology to extract the maximal possible amount of data.

Combining Lipophilic dye, in situ Hybridization, Immunohistochemistry, and Histology

A combination of different techniques to maximize data collection from mouse tissue is presented.

Combinando corante lipofílico, In situ Hibridação, imunohistoquímica e histologia

Going beyond single gene function to cut deeper into gene regulatory networks requires multiple mutations combined in a single animal.  Such analysis of ...

Neurociência

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Sensory Nerve Fibers Innervating Skin and Limb Bones

Detection and primary processing of physical, chemical and thermal sensory stimuli by peripheral sensory nerve fibers is key to sensory perception in animals and humans. These peripheral sensory nerve fibers express a plethora of receptors and ion channel proteins which detect and initiate specific sensory stimuli. Methods are available to characterize the electrical properties of peripheral sensory nerve fibers innervating the skin, which can also be utilized to identify the functional expression of specific ion channel proteins in these fibers. However, similar electrophysiological methods are not available (and are also difficult to develop) for the detection of the functional expression of receptors and ion channel proteins in peripheral sensory nerve fibers innervating other visceral organs, including the most challenging tissues such as bone. Moreover, such electrophysiological methods cannot be utilized to determine the expression of non-excitable proteins in peripheral sensory nerve fibers. Therefore, immunostaining of peripheral/visceral tissue samples for sensory nerve fivers provides the best possible way to determine the expression of specific proteins of interest in these nerve fibers. So far, most of the protein expression studies in sensory neurons have utilized immunostaining procedures in sensory ganglia, where the information is limited to the expression of specific proteins in the cell body of specific types or subsets of sensory neurons. Here we report detailed methods/protocols for the preparation of peripheral/visceral tissue samples for immunostaining of peripheral sensory nerve fibers. We specifically detail methods for the preparation of skin or plantar punch biopsy and bone (femur) sections from mice for immunostaining of peripheral sensory nerve fibers. These methods are not only key to the qualitative determination of protein expression in peripheral sensory neurons, but also provide a quantitative assay method for determining changes in protein expression levels in specific types or subsets of sensory fibers, as well as for determining the morphological and/or anatomical changes in the number and density of sensory fibers during various pathological states. Further, these methods are not confined to the staining of only sensory nerve fibers, but can also be used for staining any types of nerve fibers in the skin, bones and other visceral tissue.

Immunocytochemical identification of peripheral sensory nerve fiber subtypes (and detection of protein expression therein) are key to the understanding of molecular mechanisms underlying peripheral sensation. Here we describe methods for preparation of peripheral/visceral tissue samples, such as skin and limb bones, for specific immunostaining of peripheral sensory nerve fibers.

Preparação do tecido e imunocoloração de Fibras nervosas sensoriais que inervam rato da Pele e Ossos Limb

Detection and primary processing of physical, chemical and thermal sensory stimuli by peripheral sensory nerve fibers is key to sensory perception in ...

Techniques for Processing Eyes Implanted With a Retinal Prosthesis for Localized Histopathological Analysis

With the recent development of retinal prostheses, it is important to develop reliable techniques for assessing the safety of these devices in preclinical studies. However, the standard fixation, preparation, and automated histology procedures are not ideal. Here we describe new procedures for evaluating the health of the retina directly adjacent to an implant. Retinal prostheses feature electrode arrays in contact with eye tissue. Previous methods have not been able to spatially localize the ocular tissue adjacent to individual electrodes within the array. In addition, standard histological processing often results in gross artifactual detachment of the retinal layers when assessing implanted eyes. Consequently, it has been difficult to assess localized damage, if present, caused by implantation and stimulation of an implanted electrode array. Therefore, we developed a method for identifying and localizing the ocular tissue adjacent to implanted electrodes using a (color-coded) dye marking scheme, and we modified an eye fixation technique to minimize artifactual retinal detachment. This method also rendered the sclera translucent, enabling localization of individual electrodes and specific parts of an implant. Finally, we used a matched control to increase the power of the histopathological assessments. In summary, this method enables reliable and efficient discrimination and assessment of the retinal cytoarchitecture in an implanted eye.

Techniques for visualizing retinal cytoarchitecture directly adjacent to individual electrodes within a retinal stimulator.

Técnicas de Processamento de Olhos implantados com uma prótese de retina para análise histopatológica localizada

With  the recent development of retinal prostheses, it is important to develop  reliable techniques for assessing the safety of these devices in ...

Medicina

Transplantation of Olfactory Ensheathing Cells to Evaluate Functional Recovery after Peripheral Nerve Injury

Olfactory ensheathing cells (OECs) are neural crest cells which allow growth and regrowth of the primary olfactory neurons. Indeed, the primary olfactory system is characterized by its ability to give rise to new neurons even in adult animals. This particular ability is partly due to the presence of OECs which create a favorable microenvironment for neurogenesis. This property of OECs has been used for cellular transplantation such as in spinal cord injury models. Although the peripheral nervous system has a greater capacity to regenerate after nerve injury than the central nervous system, complete sections induce misrouting during axonal regrowth in particular after facial of laryngeal nerve transection. Specifically, full sectioning of the recurrent laryngeal nerve (RLN) induces aberrant axonal regrowth resulting in synkinesis of the vocal cords. In this specific model, we showed that OECs transplantation efficiently increases axonal regrowth.
OECs are constituted of several subpopulations present in both the olfactory mucosa (OM-OECs) and the olfactory bulbs (OB-OECs). We present here a model of cellular transplantation based on the use of these different subpopulations of OECs in a RLN injury model. Using this paradigm, primary cultures of OB-OECs and OM-OECs were transplanted in Matrigel after section and anastomosis of the RLN. Two months after surgery, we evaluated transplanted animals by complementary analyses based on videolaryngoscopy, electromyography (EMG), and histological studies. First, videolaryngoscopy allowed us to evaluate laryngeal functions, in particular muscular cocontractions phenomena. Then, EMG analyses demonstrated richness and synchronization of muscular activities. Finally, histological studies based on toluidine blue staining allowed the quantification of the number and profile of myelinated fibers.
All together, we describe here how to isolate, culture, identify and transplant OECs from OM and OB after RLN section-anastomosis and how to evaluate and analyze the efficiency of these transplanted cells on axonal regrowth and laryngeal functions.

Olfactory ensheathing cells (OECs) are neural crest cells which allow growth of the primary olfactory neurons. This specific property can be used for cellular transplantation. We present here a model of cellular transplantation based on the use of OECs in a laryngeal nerve injury model.

Transplante de células olfativas Ensheathing para avaliar a recuperação funcional após a lesão do nervo periférico

Olfactory ensheathing cells (OECs) are neural crest cells which allow growth and regrowth of the primary olfactory neurons. Indeed, the primary olfactory ...

Assessment of Ultrastructural Neuroplasticity Parameters After In Utero Transduction of the Developing Mouse Brain and Spinal Cord

The present study combines in utero transduction with transmission electron microscopy (TEM) aiming at a precise morphometrical analysis of ultrastructural parameters in unambiguously identified topographical structures, affected by a protein of interest that is introduced into the organism via viral transfer. This combined approach allows for a smooth transition from macrostructural to ultrastructural identification by following topographical navigation maps in a tissue atlas. High-resolution electron microscopy of the in-utero-transduced tissue reveals the fine ultrastructure of the neuropil and its plasticity parameters, such as cross-sectioned synaptic bouton areas, the number of synaptic vesicles and mitochondria within a bouton profile, the length of synaptic contacts, cross-sectioned axonal areas, the thickness of myelin sheaths, the number of myelin lamellae, and cross-sectioned areas of mitochondria profiles. The analysis of these parameters reveals essential insights into changes of ultrastructural plasticity in the areas of the nervous system that are affected by the viral transfer of the genetic construct. This combined method can not only be used for studying the direct effect of genetically engineered biomolecules and/or drugs on neuronal plasticity but also opens the possibility to study the in utero rescue of neuronal plasticity (e.g., in the context of neurodegenerative diseases).

The combination of transmission electron microscopy and in utero transduction is a powerful approach for studying morphological changes in the fine ultrastructure of the nervous system during development. This combined method allows deep insights into changes in structural details underlying neuroplasticity with respect to their topographical representation.

Avaliação dos parâmetros de neuroplasticidade ultraestrutural depois no Utero transdução da medula espinhal e cérebro de rato em desenvolvimento

The present study combines in utero transduction with transmission electron microscopy (TEM) aiming at a precise morphometrical analysis of ...

Biologia do Desenvolvimento

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their close-to-surface positioning facilitates microscopic imaging of skin nerve endings in living intact animal. Using multiphoton microscopy, it is possible to obtain fine images overcoming the problem of strong light scattering of the skin tissue. Reporter transgenic mice that express EYFP under the control of Thy-1 promoter in neurons (including periphery sensory neurons) are well suited for the longitudinal studies of individual nerve endings over extended periods of time up to several months or even life-long. Furthermore, using the same femtosecond laser as for the imaging, it is possible to produce highly selective lesions of nerve fibers for the studies of the nerve fiber restructuring. Here, we present a simple and reliable protocol for longitudinal multiphoton in vivo imaging and laser-based microsurgery on mouse skin nerve endings.

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

The protocol for dynamic longitudinal imaging and selective laser lesion of nerve endings in reporter transgenic mice is presented.&#160;

In Vivo Two-Photon Microscopia de terminações nervosas individuais em Pele

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their ...

Experimental Demyelination and Remyelination of Murine Spinal Cord by Focal Injection of Lysolecithin

Multiple sclerosis is an inflammatory demyelinating disease of the central nervous system characterized by plaque formation containing lost oligodendrocytes, myelin, axons, and neurons. Remyelination is an endogenous repair mechanism whereby new myelin is produced subsequent to proliferation, recruitment, and differentiation of oligodendrocyte precursor cells into myelin-forming oligodendrocytes, and is necessary to protect axons from further damage. Currently, all therapeutics for the treatment of multiple sclerosis target the aberrant immune component of the disease, which reduce inflammatory relapses but do not prevent progression to irreversible neurological decline. It is therefore imperative that remyelination-promoting strategies be developed which may delay disease progression and perhaps reverse neurological symptoms. Several animal models of demyelination exist, including experimental autoimmune encephalomyelitis and curprizone; however, there are limitations in their use for studying remyelination. A more robust approach is the focal injection of toxins into the central nervous system, including the detergent lysolecithin into the spinal cord white matter of rodents. In this protocol, we demonstrate that the surgical procedure involved in injecting lysolecithin into the ventral white matter of mice is fast, cost-effective, and requires no additional materials than those commercially available. This procedure is important not only for studying the normal events involved in the remyelination process, but also as a pre-clinical tool for screening candidate remyelination-promoting therapeutics.

Demyelinating diseases can be modeled in animals by focal application of lysolecithin into the CNS. A single injection of lysolecithin into mouse spinal cord produces a lesion that spontaneously repairs over time. The goal is to study factors involved in de- and remyelination, and to test agents for enhancing repair.

Experimental desmielinização e remielinização de Medula Espinhal Murino por Injeção Focal de lisolecitina

Multiple sclerosis is an inflammatory demyelinating disease of the central nervous system characterized by plaque formation containing lost ...

Optical Monitoring of Living Nerve Terminal Labeling in Hair Follicle Lanceolate Endings of the Ex Vivo Mouse Ear Skin

A novel dissection and recording technique is described for optical monitoring staining and de-staining of lanceolate terminals surrounding hair follicles in the skin of the mouse pinna. The preparation is simple and relatively fast, reliably yielding extensive regions of multiple labeled units of living nerve terminals to study uptake and release of styryl pyridinium dyes extensively used in studies of vesicle recycling. Subdividing the preparations before labeling allows test vs. control comparisons in the same ear from a single individual. Helpful tips are given for improving the quality of the preparation, the labeling and the imaging parameters. This new system is suitable for assaying pharmacologically and mechanically-induced uptake and release of these vital dyes in lanceolate terminals in both wild-type and genetically modified animals. Examples of modulatory influences on labeling intensity are given.

Optical Monitoring of Living Nerve Terminal Labeling in Hair Follicle Lanceolate Endings of the Ex Vivo Mouse Ear Skin

Here we describe a novel preparation for imaging live lanceolate sensory terminals of palisade endings that innervate mouse ear skin hair follicles during staining and destaining with styryl pyridinium dyes.

Monitoramento óptico do nervo Viver Terminal Etiquetagem na folículo piloso Lanceolate Endings da<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Mouse pele da orelha

A novel dissection and recording technique is described for optical monitoring staining and de-staining of lanceolate terminals surrounding hair follicles ...

Establishing a Mouse Model of a Pure Small Fiber Neuropathy with the Ultrapotent Agonist of Transient Receptor Potential Vanilloid Type 1

Patients with diabetes mellitus (DM) or those experiencing the neurotoxic effects of chemotherapeutic agents may develop sensation disorders due to degeneration and injury of small-diameter sensory neurons, referred to as small fiber neuropathy. Present animal models of small fiber neuropathy affect both large- and small-diameter sensory fibers and thus create a neuropathology too complex to properly assess the effects of injured small-diameter sensory fibers. Therefore, it is necessary to develop an experimental model of pure small fiber neuropathy to adequately examine these issues. This protocol describes an experimental model of small fiber neuropathy specifically affecting small-diameter sensory nerves with resiniferatoxin (RTX), an ultrapotent agonist of transient receptor potential vanilloid type 1 (TRPV1), through a single dose of intraperitoneal injection, referred to as RTX neuropathy. This RTX neuropathy showed pathological manifestations and behavioral abnormalities that mimic the clinical characteristics of patients with small fiber neuropathy, including intraepidermal nerve fiber (IENF) degeneration, specifically injury in small-diameter neurons, and induction of thermal hypoalgesia and mechanical allodynia. This protocol tested three doses of RTX (200, 50, and 10 &#181;g/kg, respectively) and concluded that a critical dose of RTX (50 &#181;g/kg) is required for the development of typical small fiber neuropathy manifestations, and prepared a modified immunostaining procedure to investigate IENF degeneration and neuronal soma injury. The modified procedure is fast, systematic, and economic. Behavioral evaluation of neuropathic pain is critical to reveal the function of small-diameter sensory nerves. The evaluation of mechanical thresholds in experimental rodents is particularly challenging and this protocol describes a customized metal mesh that is suitable for this type of assessment in rodents. In summary, RTX neuropathy is a new and easily established experimental model to evaluate the molecular significance and intervention underlying neuropathic pain for the development of therapeutic agents.

This study establishes an experimental model of pure small fiber neuropathy with resiniferatoxin (RTX). A unique dose of RTX (50 &#181;g/kg) is optimal for developing a small fiber neuropathy model that mimics patient characteristics and could help investigate the nociceptive molecular significance underlying neuropathic pain.

Estabelecer um modelo de Mouse de uma neuropatia de pura fibra pequena com o ultrapotente agonista do Receptor transitório potencial Vanilloid tipo 1

Patients with diabetes mellitus (DM) or those experiencing the neurotoxic effects of chemotherapeutic agents may develop sensation disorders due to ...

Imaging and Analysis of Neurofilament Transport in Excised Mouse Tibial Nerve

Neurofilament protein polymers move along axons in the slow component of axonal transport at average speeds of ~0.35-3.5 mm/day. Until recently the study of this movement in situ was only possible using radioisotopic pulse-labeling, which permits analysis of axonal transport in whole nerves with a temporal resolution of days and a spatial resolution of millimeters. To study neurofilament transport in situ with higher temporal and spatial resolution, we developed a hThy1-paGFP-NFM transgenic mouse that expresses neurofilament protein M tagged with photoactivatable GFP in neurons. Here we describe fluorescence photoactivation pulse-escape and pulse-spread methods to analyze neurofilament transport in single myelinated axons of tibial nerves from these mice ex vivo. Isolated nerve segments are maintained on the microscope stage by perfusion with oxygenated saline and imaged by spinning disk confocal fluorescence microscopy. Violet light is used to activate the fluorescence in a short axonal window. The fluorescence in the activated and flanking regions is analyzed over time, permitting the study of neurofilament transport with temporal and spatial resolution on the order of minutes&#160;and microns, respectively. Mathematical modeling can be used to extract kinetic parameters of neurofilament transport including the velocity, directional bias and pausing behavior from the resulting data. The pulse-escape and pulse-spread methods can also be adapted to visualize neurofilament transport in other nerves. With the development of additional transgenic mice, these methods could also be used to image and analyze the axonal transport of other cytoskeletal and cytosolic proteins in axons.

We describe fluorescence photoactivation methods to analyze the axonal transport of neurofilaments in single myelinated axons of peripheral nerves from transgenic mice that express a photoactivatable neurofilament protein.

Imagem e Análise do Transporte de Neurofilamento em Nervo Tibial de Camundongo Excised

Neurofilament protein polymers move along axons in the slow component of axonal transport at average speeds of ~0.35-3.5 mm/day. Until recently the study ...