A principal contribuição do nosso artigo é que exploramos uma paisagem precisa e fina da patologia beta amiloide do cérebro da doença de Alzheimer com a tecnologia de imagem da espectrometria de massa de imagem MALDI. Alcançamos avanços tecnológicos gerando um protocolo especial com pré-tratamento de ácido fórmico das lâminas teciduais. Seguindo o MALDI-IMS, mapas de segmentação são gerados e cálculos são realizados para descobrir novas proteínas marcadoras ou peptídeos colocados com placa e vasculatura subaracnóides.
Obtenha amostras corticais humanas para IMS de cérebros que foram removidos, processados e armazenados a menos 80 graus Celsius dentro de oito horas após a morte. Pegue a amostra cerebral do córtex occipital de pacientes com DA e controles com idade compatível. Para cortar as seções teciduais em um criostat, primeiro lugar, o óxido de lata de índio condutivo ou o vidro do microscópio revestido de ITO desliza dentro do criostat.
Aqueça a amostra cerebral da autópsia de menos 80 graus Celsius a menos 22 graus Celsius dentro do criostat. Conecte uma nova lâmina descartável ao criostat para cada experimento. Tente sempre usar uma parte limpa da lâmina.
Coloque os cérebros congelados da autópsia no palco junto com uma pequena quantidade de composto de temperatura de corte ideal. Para IMS e imunohistoquímica, corte de cinco a seis seções de cada amostra de tecido. Quando a lâmina estiver apenas começando a cortar o tecido, gire a roda e enfrente o bloco até que todo o tecido seja exposto.
Se houver uma pequena raia ou rasgar a seção, espere no criostat até que o ajuste de temperatura o corrija automaticamente. Conte alguns segundos antes de abrir o anti-rolo com um tecido por baixo. Coloque imediatamente a fatia de tecido no lado revestido de ITO do slide de vidro.
Descongele a fatia de tecido colocando um dedo por baixo do slide no lado não revestido de ITO. O tecido vai grudar na lâmina. Certifique-se de que o tecido é o mais plano possível sem rugas.
Para enxaguar as seções teciduais, mergulhe as amostras em 40 a 100 mililitros de 70% de etanol em um frasco de coloração de vidro por 30 segundos para remover lipídios endógenos e sais inorgânicos. Lave as amostras usando a sequência de lavagem listada no protocolo de texto. Em seguida, seque as amostras no vácuo por 30 minutos.
Agora, trate as seções teciduais com um vapor de ácido fórmico para uma melhor ionização das proteínas beta amiloides do tecido cerebral autópsia. Para isso, prepare o forno a 60 graus Celsius e um prato de vidro de incubação com cinco mililitros de ácido 100% fórmico. Mantenha a umidade do ar na antena de vidro de incubação ao nível de saturação.
Coloque os slides de tecido na antena de vidro de incubação enquanto evita submersão no ácido fórmico e trate por seis minutos. Pegue uma imagem óptica das amostras usando um scanner de filme, scanner de gel ou um microscópio digital. Faça esta etapa em temperatura ambiente.
O alinhamento da imagem óptica das amostras é necessário quando o alvo da amostra é colocado dentro do instrumento. Normalmente, não será possível reconhecer a seção tecidual sob a camada matricial. Para correlacionar as imagens ópticas com as amostras, faça marcas guia que são visíveis tanto na imagem óptica quanto sob a camada de matriz na ótica da câmera.
A maneira mais fácil é detectar pelo menos três marcas de fluido de correção ao redor da amostra antes de tirar a imagem óptica. Para pulverizar a matriz com um pulverizador ultrassônico, remova o tecido a ser pulverizado do desiccador e coloque-o na câmara. Certifique-se de que o tecido não está cobrindo a janela do sensor.
Inicie a preparação apertando o botão Iniciar. Normalmente, o tempo de preparação é em torno de 90 minutos. A preparação será regulada automaticamente através do monitoramento da espessura da camada matricial e da umidade.
Alternativamente, para pulverizar a solução matricial na superfície do tecido com um pulverizador automático, use um sistema de bomba de solvente definido a 10 psi e 0,15 mililitros por minuto para entregar a solução matricial. Um fluxo constante de gás aquecido de baia será entregue em juntamente com o spray de solução matricial. Realize experimentos de imagem de alta produtividade e alta resolução espacial com MALDI-IMS.
Para medição de espectrometria de massa, defina as áreas teciduais usando o software de controle MALDI e o software de análise de dados. Adquira espectros em um modo linear positivo com uma faixa de proporção de massa para carga de 2.000 a 20.000 e uma resolução espacial de 20 e 100 mícrons. Para fazer o padrão de calibração, dissolva o padrão de calibração do peptídeo e o padrão de calibração de proteínas em uma proporção de um a quatro com a solução CHCA e TA30 e, em seguida, dilui-lo 10 vezes.
Coloque um microliter de padrão de calibração no slide em quatro locais diferentes. Usando o software de histologia molecular, sobreponha múltiplas imagens de sinal para encontrar a correlação espacial de vários sinais, como diferentes peptídeos beta amiloides em placas senil e paredes arteriais. A angiopatia amiloide cerebral ou fenótipos caa do paciente número três foram os mais proeminentes neste estudo.
MALDI-IMS do tecido cerebral deste paciente visualizaram claramente que o beta amiloide 1-42 e o beta amiloide 1-43 foram preferencialmente depositados como placas senil no parenchyma cerebral. Em contraste, betas amiloides mais curtos, como beta amiloide 1-36 a 1-41, foram preferencialmente depositados nas áreas vasculares leptomeningeais. Não houve sinais significativos no controle não patológico.
As distribuições de beta amiloide 1-40 e beta amiloide 1-42 foram validadas com imunohistoquímica usando seções congeladas adjacentes dos tecidos. O anticorpo beta 1-40 anti-amilóide rotulado CAA e revelado beta 1-40 é preferencialmente depositado em vasos sanguíneos leptomeningeais, o que é um claro contraste com a distribuição do beta amiloide 1-42 no parenchyma cerebral como placas senil. Mostrado aqui é um mapa de segmentação obtido com uma análise de k-meios de bissecção aplicada na mesma seção do paciente número três.
Este método de agrupamento identificou com sucesso estruturas semelhantes a placas no parenchyma e estruturas vasculares no espaço subaracnóide. É interessante encontrar uma pequena área circular no parenchyma que é detectada apenas em torno de uma pequena arteriola no parenchyma, bem como no espaço subaracnóide. Isso é verificado por imagens de íons únicos desses peptídeos beta amiloides individuais.
Há um limite para rastrear uma ampla gama de betas amiloides simultaneamente, mesmo que usando os anticorpos específicos. Aqui, mostramos a distribuição de beta amiloide em cérebros humanos usando o método de espectrometria de massa de imagem MALDI de ponta. Acreditamos que essa contribuição faz avanços na pesquisa da doença de Alzheimer porque este relatório oferece a caracterização do conjunto completo de proteínas beta amiloides em cérebros autopsiados humanos.
A descoberta mais impressionante é que apenas uma única alteração de aminoácidos no terminal C da proteína beta amiloide faz uma mudança drástica em sua distribuição. As etapas de preparação tecidual são fundamentais para obter uma ionização eficaz de proteínas agregadas no tecido cerebral humano. Cocristalização homogênea do analito com matrizes cruciais para alta sensibilidade e imagem livre de artefatos.
