Este trabalho foi financiado em parte pelo nacional pesquisa básica programa da China (2012CB825504), Nacional Natural Science Foundation da China (91232720 e 9163210042), da Academia Chinesa de Ciências (CAS) (GJHZ201302 e SMC015-QYZDY-SSW), Bill e Melinda Gates Foundation (OPP1119434) e 100-talentos programa de CAS para Y. Zhu.

1. preparar a câmara de alimentação
Nota: A câmara de alimentação para criação de etiquetas de corante alimentar ensaio consiste de duas partes: o recipiente externo (como uma capa) e o interior contêiner (como fonte de alimento).
<ol><li>Modificar o recipiente externo de um frasco de vidro para o cultivo da drosófila com (diâmetro interno de 31,8 mm) e uma altura de 80 mm (figura 1A, 1C). Cobrir o fundo do recipiente com uma camada de agarose a 1% (5 mL) para manter a configuração de alimentação adequadamente humedecidas e servir como um substrato macio para as moscas andar em cima (figura 1B). O recipiente, desse modo, oferece um ambiente controlado mas naturalista, carregando com o mínimo de estresse ou perturbação para as moscas.<ol>
<li>Prepare o recipiente externo. Suspender a 0,5 g de agarose em 50 mL de água bidestilada, calor com agitação frequente e ferva até para dissolver completamente em um agitador magnético com uma placa de calor.</li>
		<li>Quando esfria de agarose a 1% para cerca de 60 ° C, transferir 5ml de agarose a 1% para um vazio fora do recipiente (figura 1B) e deixe o recipiente ficar aberto até arrefecido à temperatura ambiente para produzir uma almofada de agarose.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare alimentos tingir-etiquetados. Composição dos alimentos tingir-etiquetados varia de acordo com diferentes fins experimentais. Aqui está um exemplo de preparar o alimento tingir-etiquetados, contendo apenas a sacarose.<ol>
<li>Adicionar 0,5 g de agarose a 50 mL de água bidestilada, calor com agitação frequente e deixe ferver até para dissolver completamente em um agitador magnético com uma placa de calor.</li>
		<li>Quando a agarose 1% acima esfria a cerca de 60 ° C, adicione 1,71 g de sacarose para o agarose para obter sacarose 100 mM.</li>
		<li>Adicione 0,25 g de corante azul (erioglaucine dissódico) para a solução de agarose para obter comida de tingir-etiquetados de 0,5% (p/v).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparar o interior recipiente. Colocar o vazio dentro de recipientes sobre uma superfície plana e horizontal e, em seguida, adicione 750 µ l de comida azul tingir-etiquetados para recipiente de alimento individuais, deixe solidificar durante pelo menos 5 min. Nota: Dentro do recipiente é um pequeno prato de plástico com diâmetro interno de 13,6 mm e uma altura de 7,5 mm (figura 1A, 1C). Ele está cheio de comida tingir-etiquetados e então está posicionado no centro da almofada do agarose do recipiente externo.</li>
	<li>Transferir um enchido dentro de contêiner para um recipiente fora preparado e posicioná-lo no centro do painel de agarose. Deixe-as câmaras de alimentação ficar aberto à temperatura ambiente por 40 min até a parede do recipiente externo é livre de condensação. Nota: Parede seca é necessária para impedir que as moscas sendo preso na parede, entrando em contato com gotas de água.</li>
	<li>Preparar a alimentação câmaras com comida sem corantes (mesma composição mas sem tingem) para subtração de fundo.</li>
</ol>2. preparação de moscas
Nota: Fêmea adulta voa 5 a 10 dias após a eclosão são normalmente utilizados para ensaios de alimentação. É recomendável para moscas de genótipos diferentes, incluindo controles de genéticas, de preparar e testar em paralelo. 20 moscas (a partir de uma câmara de alimentação) geram um ponto de dados.
<ol><li>Considere a densidade de população para a criação de moscas adultas. Normalmente, controle a densidade de população, variando o número de moscas parentais de acordo com as tensões e as dimensões dos frascos de cultura. Por exemplo, transferir 15 machos e 30 fêmeas de Cantão-S para um frasco de cultura com (de 31,8 mm de diâmetro) e uma altura de 80 mm e deixe as fêmeas para pôr ovos para um dia, em seguida, remover que o adulto voa.</li>
	<li>Prepare-se para ativação thermogenetic moscas.<ol>
<li>Use o sistema de Gal4/UAS38 para expressar dTRPA133 em vários neurônios por cruzamento que UAS-dTrpA1 voa com diferentes linhas de motorista GAL4 (Figura 2B).</li>
		<li>Mantenha as moscas adultas no padrão alimentar de 22 ° C, umidade relativa de 60% e um ciclo claro-escuro de 12 h/12 h.</li>
		<li>Dois dias antes da alimentação do ensaio, classificar e coletar moscas num CO2 bloco voar sob um microscópio estéreo em um frasco de alimentos frescos e manter uma densidade de 20 moscas por frasco.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare-se para a ativação de optogenetic moscas.<ol>
<li>Use o sistema de Gal4/UAS38 para expressar CsChrimson36 nos neurônios diferentes por moscas de UAS-CsChrimson cruzando com linhas diferentes de motorista GAL4.</li>
		<li>Coletar recém eclosed (dentro de 24 h) moscas e transferi-los em um frasco com o alimento padrão contendo 400 µM all-trans-retinal.</li>
		<li>Para prevenir a ativação prematura, embrulhar os frascos de criação com folha de alumínio e em seguida, colocá-los em uma caixa escura para proteger moscas de estimulação de luz indesejada. Manter as moscas a 25 ° C, umidade de 60% no escuro por 4-6 dias.</li>
		<li>Dois dias antes do ensaio de alimentação, fêmea tipo voa em CO2 pad voar sob um microscópio estéreo. Recolher 20 moscas no frasco de um alimento e mantê-los no escuro antes do teste de alimentação.</li>
		<li>Realizar todas as operações sob a luz ofuscante tão rapidamente quanto possível, para evitar os efeitos causados pela luz ambiente. Usar uma lâmpada de LED colocada longe da área de trabalho, a intensidade na área de trabalho é 5 µW/cm2. Nota: Uso de fome Cantão-S voa como um controle positivo para o ensaio de alimentação. Privar estas moscas de comida e manter em agarose a 1% por 24 horas antes do teste de alimentação. Os níveis de consumo de alimentos destas moscas ajudam a avaliar as flutuações diárias.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. thermogenetic ativação
<ol><li>Conduzir experimentos de alimentação todas ao mesmo tempo do dia, em torno de Zeitgeber tempo 4-631,,32, para minimizar variações devido ao ritmo circadiano.</li>
	<li>Prepare uma incubadora (ou uma pequena sala com um aquecedor de temperatura controlada) como o ambiente de aquecimento.</li>
	<li>Antes de experimentos comportamentais, equilibrar as câmaras de alimentação preparadas à temperatura experimental (30 ° C) por 2 h assegurar que a temperatura é uniforme relativo na câmara de alimentação.</li>
	<li>Para iniciar o processo de alimentação, cuidadosamente transferi 20 moscas de seu frasco em casa em uma câmara de alimentação pré-aquecida tocando suave. Continuar o processo de alimentação a 30 ° C por 60 min ( Figura 3A) . Nota: Frequentes agitações, tais como abertura e fechamento da porta de incubadora, afetar adversamente o comportamento alimentar, assim, devem ser minimizadas.</li>
	<li>Cesse a alimentação a 60 min por congelamento as câmaras de alimentação de-80 ° C (ou a-20 ° C) por 30 min. Nota: Congelamento ajuda a parar as mamadas em todas as câmaras em simultâneo. Congelamento de moscas a-80 ° C tem duas finalidades, para eutanásia as moscas e para armazenamento até homogeneização por até uma semana.</li>
	<li>Para o grupo de controle de temperatura, transferi 20 moscas para uma temperatura ambiente alimentando câmara com cor de corante alimentar para iniciar o processo de alimentação a 22 ° C por 60 min.</li>
	<li>Cesse a alimentação do grupo de controle de temperatura congelando as câmaras a-80 ° C (ou a-20 ° C) por 30 min.</li>
</ol>4. Optogenetic ativação
<ol><li>Conduzir experimentos de alimentação todas ao mesmo tempo do dia, em torno de Zeitgeber tempo 4-631,,32, para minimizar variações devido ao ritmo circadiano.</li>
	<li>Transferir com cuidado 20 moscas de um frasco para uma câmara de alimentação suave tocando e em seguida, colocar a câmara lateralmente sobre a instalação de iluminação (Figura 4A, 4B).<ol>
<li>Para manipulação de optogenetic, usar uma matriz de LEDs laranja (607 nm) como a fonte da luz de estimulação e fixar uma placa horizontal do plexiglás acima os LEDs para apoiar a alimentação câmaras durante a iluminação. Manter a instalação em uma incubadora a 25 ° C, com 60% de umidade (Figura 4A, 4B).</li>
		<li>Estimular as controle genético de moscas em paralelo com o Taotie > CsChrimson voa, mas em diferentes câmaras de alimentação.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Continue o processo de alimentação para 60 min com iluminação traseira pela luz laranja.<ol>
<li>Determinar as intensidades de iluminação ideal para optogenetics experimentalmente36. Para o Taotie > CsChrimson moscas, uma intensidade de 2,2 mW/mm2 induz paralisia (cessação de locomoção) e perda de controle postural, portanto, use uma intensidade intermediária de 0.1 mW/mm2 para estimular o Taotie > CsChrimson voa durante o teste de alimentação.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cesse a alimentação por congelamento câmaras de alimentação de-80 ° C (ou a-20 ° C) por 30 min.</li>
</ol>5. visual estimativa de consumo de alimentos
Nota: A abordagem de Pontuação visual fornece uma estimativa semi-quantitativa de consumos de alimentos. Embora não seja tão objectiva quanto o método óptico, este método permite a passar por um grande número de estirpes voar em tempo hábil, tornando-o adequado para a primeira rodada de uma tela de genética para rapidamente reduzir a lista de candidatos para testes adicionais.
<ol><li>Após o processo de alimentação, anestesiar e marcar as moscas em um CO2 almofada voar sob um microscópio estéreo. Dar Pontuação individual para cada mosca com base no volume e intensidade de cor de corante de comida em seu abdômen (Figura 2A). Nota: Critérios para estimativa visual: o sistema de Pontuação tem 4 níveis de ingestão de alimentos, correspondentes a diferentes volumes e intensidades de alimentos coloridos no abdômen.<ol>
<li>Pontuação voa sem detectável cor de corante alimentar uma pontuação de 0; aqueles com corante azul (mal detectável) fraco ou com cor de corante alimentar ocupando menos de um terço do volume do abdome dar uma pontuação de 1.</li>
		<li>Pontuação voa com intensa cor de corante alimentar, ocupando metade do abdome um placar de 2.</li>
		<li>Aqueles com intensa tingido conteúdo ocupando metade do abdome superior a marcar uma pontuação de 3 (Figura 2A).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Calcule a proporção de moscas com pontuações diferentes em cada condição experimental (Figura 2B).</li>
</ol>6. colorimétrica quantificação do consumo de alimentos
<ol><li>Após cessação da alimentação, despejar todas as 20 moscas de uma alimentação de câmara em um pedaço de papel de pesagem, em seguida, transferi-los para um tubo de 1,5 mL, usando uma escova macia. Nota: Não tome todas as câmaras de armazenamento-80 ° C ao mesmo tempo para evitar moscas, furar a parede da câmara devido a condensação de água na câmara fria.</li>
	<li>Adicionar 500 µ l de PBST ao tubo e homogeneizar as moscas usando um moinho de moedura em 60Hz para 5 s.<ol>
<li>Confirme a homogeneização suficiente pela observação quando existem não detectáveis fragmentos de partes do corpo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Gire os tubos com homogenates por 30 min a 13.000 rpm para limpar os escombros.</li>
	<li>Após a centrifugação, transferi 100 µ l do sobrenadante para um poço de uma placa de 96 poços.</li>
	<li>Depois que todas as amostras são carregadas, coloquei a placa em um leitor de placa para medir a absorvância das amostras em 630 nm.</li>
	<li>Para remover a absorvância de fundo, subtrair o valor da absorvância dos sobrenadantes de moscas alimentados com comida sem tintura valor da absorvância do líquido sobrenadante de moscas alimentados com comida azuis. Nota: Esta etapa é opcional, dependendo das composições dos alimentos utilizados. Quando um alimento voar (sem tintura) gera a absorvância a 630 nm, é necessário efectuar este passo para eliminar o fundo.</li>
</ol>

<ol>
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N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+internal+thermal+sensor+controlling+temperature+preference+in+Drosophila.">An internal thermal sensor controlling temperature preference in Drosophila.</a> Nature. 454 (7201), 217-255 (2008).</li><li>Viswanath, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+channels+-+Opposite+thermosensor+in+fruitfly+and+mouse.">Ion channels - Opposite thermosensor in fruitfly and mouse.</a> Nature. 423 (6942), 822-823 (2003).</li><li>Yu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+starvation-induced+hyperactivity+by+insulin+and+glucagon+signaling+in+adult+Drosophila.">Regulation of starvation-induced hyperactivity by insulin and glucagon signaling in adult Drosophila.</a> Elife. 5, (2016).</li><li>Klapoetke, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Independent+optical+excitation+of+distinct+neural+populations.">Independent optical excitation of distinct neural populations.</a> Nat Methods. 11 (3), 338-346 (2014).</li><li>Viswanath, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opposite+thermosensor+in+fruitfly+and+mouse.">Opposite thermosensor in fruitfly and mouse.</a> Nature. 423 (6942), 822-823 (2003).</li><li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+Gene-Expression+as+a+Means+of+Altering+Cell+Fates+and+Generating+Dominant+Phenotypes.">Targeted Gene-Expression as a Means of Altering Cell Fates and Generating Dominant Phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li><li>Lee, K. S., You, K. H., Choo, J. K., Han, Y. M., Yu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+short+neuropeptide+F+regulates+food+intake+and+body+size.">Drosophila short neuropeptide F regulates food intake and body size.</a> J Biol Chem. 279 (49), 50781-50789 (2004).</li><li>Marella, S., Mann, K., Scott, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopaminergic+Modulation+of+Sucrose+Acceptance+Behavior+in+Drosophila.">Dopaminergic Modulation of Sucrose Acceptance Behavior in Drosophila.</a> Neuron. 73 (5), 941-950 (2012).</li><li>Albin, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Subset+of+Serotonergic+Neurons+Evokes+Hunger+in+Adult+Drosophila.">A Subset of Serotonergic Neurons Evokes Hunger in Adult Drosophila.</a> Current Biology. 25 (18), 2435-2440 (2015).</li><li>Ro, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotonin+signaling+mediates+protein+valuation+and+aging.">Serotonin signaling mediates protein valuation and aging.</a> eLife. 5, e16843 (2016).</li></ol>

Os autores declaram não concorrentes interesses financeiros.

Este relatório concentra-se no processo técnico de ensaios de alimentação corante-rotulagem de consumo de alimentos no contexto de thermogenetic e ativação de optogenetic para manipular os neurônios controlando a alimentação. Este protocolo simples e de confiança vai ajudar a elucidar a função dos neurônios do candidato na alimentação de controle, para medir a preferência alimentar de moscas e para identificar novos jogadores nos circuitos de controle de alimentação através de telas de genética basead...

Quantificar a quantidade de comida ingerida é importante para avaliar vários aspectos da alimentação controles pelo cérebro em responder às necessidades internas (tais como Estados de fome) e fatores externos (como a qualidade dos alimentos e palatabilidade)1, 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9. nos últimos anos, os esforços de decifrar os substratos neurais de controle de alimentação em Drosophila levam ao desenvolvimento de vários ensaios para diretamente a quantificar a quantidade de comida ingerida ou servir como um indicador de alimentação motivação 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16.
O ensaio de alimentador capilar (CAFE)12,13 foi desenvolvido para medir a quantidade de consumo de alimentos líquidos em uma conta de vidro. O ensaio CAFE é altamente sensível e reprodutível17 e simplifica a medição do consumo de alimentos, especialmente para quantificação de alimentação a longo prazo18. No entanto, este ensaio requer as moscas para subir até a ponta da conta e alimentar de ponta-cabeça, que não é adequado para todas as estirpes. Além disso, porque as moscas a ser testado usando o ensaio de café têm de ser criados no alimento líquido, o efeito destas condições no status de metabolismo ou desnutrição a potencial de criação permanece ser determinado.
O ensaio de Proboscis extensão resposta (PER)11,14 conta a frequência de respostas de extensão narigudo em direção a toques suaves de gotas de comida. POR ensaio provado-se como uma excelente maneira de avaliar alimentação motivação de mosca individual e bundas a influência de palatabilidade e conteúdo de alimentos18,19. No entanto, não é uma quantificação directa da quantidade de ingestão.
Recentemente, foi desenvolvido um método semiautomático, manual do ensaio (MAFE)15, de alimentação. Em MAFE, uma única mosca imobilizada é alimentada manualmente com uma conta que contém o alimento. Dado que as respostas de extensão de narigudo e consumo de alimentos podem ser monitorados simultaneamente, MAFE é adequado para avaliar valores de nutrientes e os efeitos da manipulação farmacológica. No entanto, imobilizando uma mosca pode afetar negativamente seu desempenho comportamental, incluindo a alimentação.
Além disso, voar Proboscis e atividade Detector (FlyPAD)10 foi desenvolvido para quantificar automaticamente o comportamento alimentar. Usando métodos de visão de máquina, FlyPAD registros de interações físicas entre uma mosca e comida para quantificar a frequência e duração das extensões de tromba como um indicador de alimentação motivação. FlyPAD fornece uma abordagem de alto rendimento para monitorar os comportamentos de alimentação de uma mosca em movimento livre, embora a sensibilidade e a robustez deste sistema continua a ser confirmada por mais de12estudos.
Estratégias de rotulagem são frequentemente usadas para estimar a ingestão de alimentos em moscas. É comum de rotular os alimentos com traçadores químicos e, após a alimentação, medir a quantidade de traçador ingerido para calcular a quantidade de ingestão de alimentos. Traçadores radioativos,16,17,20,21,22,23,24,25 permitir a detecção através da cutícula sem homogeneização das moscas. Este método fornece notavelmente baixa variabilidade e alta sensibilidade18e é viável para o estudo de longo prazo da ingestão de alimentos. No entanto, a disponibilidade de radioisótopos utilizáveis e diferentes taxas de absorção e excreção devem ser tida em conta quando se trabalha com este ensaio.
Rotulagem e rastreamento de ingestão de alimentos com cores de alimentos tóxicos é um mais simples e mais segura alternativa2,3,26,,27,28. Moscas são homogeneizadas após a alimentação com alimentos que contenham corantes solúveis e não absorvível, e a quantidade do corante ingerido mais tarde é quantificada utilizando um espectrofotômetro3,24,28,29 . A estratégia de rotulagem é fácil de executar e fornece alta eficiência, mas com uma ressalva. O volume de ingestão de alimentos, estimado a partir da tintura ingerida é menor que o volume real porque excreção começa tão cedo quanto 15 min depois moscas Iniciar alimentação17. Além disso, o ensaio avalia a ingestão de comida tipicamente dentro de um período de 60 min, que só é adequado para investigação do comportamento alimentar a curto prazo24,28. Além disso, vários fatores internos e externos, tais como o genótipo17, gênero17, acasalou estado17, criação de densidade30, ritmo circadiano31,32e comida de qualidade3 , 8 , 16, ingestão de alimentos de influência. Portanto, a alimentação duração talvez precise ser ajustado de acordo com as condições experimentais específicas. Além de facilitar a quantificação da ingestão de alimentos, cores de alimentos também são usadas para avaliar opções de comida a2,19,27e visualizar o menisco em uma conta no CAFE ensaio12.
Aqui, apresentamos uma protocolo combinado manipulação da atividade neuronal com abordagem de criação de etiquetas de tintura. Esta estratégia tem sido provada útil em nosso estudo neurogenetic alimentando o controle em adultos de moscas de fruta24. O método de Pontuação visual permite uma rápida estimativa do consumo de alimentos; assim, é útil para o rastreio através de um grande número de estirpes em tempo hábil. Os candidatos a partir da tela são então analisados em detalhe, usando um método colorimétrico para fornecer objectivas e quantificação exacta em estudo adicional.
Além de ensaios de alimentação, também descrevemos o thermogenetic27,33,34,35 e optogenetic36 métodos forçosamente ativando neurônios alvo em Drosophila. Para ativar os neurônios por thermogenetic a operação é simples e conveniente com Drosophila transitória do Receptor potencial Ankyrin 1 (dTRPA1), que é um canal de cação de temperatura e voltagem-dependente que aumenta a excitabilidade neuronal quando a temperatura ambiente temperatura se eleva acima de 23 ° C33,,37; no entanto, testes com animais em altas temperaturas podem produzir efeitos adversos sobre o comportamento. Outra abordagem eficaz para ativar os neurônios em Drosophila é usando o optogenetics com CsChrimson36, que é uma variante avermelhado do channelrhodopsin que aumenta a excitabilidade dos neurônios quando expostos à luz. Optogenetics oferece a maior resolução temporal e a menor perturbação de comportamentos do que thermogenetics. Combinando a medição quantitativa de ingestão de alimentos com a manipulação da atividade neuronal representa uma abordagem eficaz para estudar os mecanismos neurais de alimentação.
Descrevemos em detalhe a preparação da câmara de alimentação e as moscas a ser testado. Usando moscas Taotie-Gal4 como um modelo24, descrevemos ativando neurônios por thermogenetics e optogenetics. Dois ensaios de quantificação do consumo de alimento com comida tingir-etiquetados são também descritos no protocolo.

<table><tbody><tr><td>UAS-CsChrimson</td><td>Bloomintoon</td><td>55135</td><td></td></tr><tr><td>UAS-dTrpA1</td><td>Bloomintoon</td><td>26263</td><td></td></tr><tr><td>TDC1-GAL4&amp;nbsp;</td><td>Bloomintoon</td><td>9312</td><td></td></tr><tr><td>TDC2-GAL4</td><td>Bloomintoon</td><td>9313</td><td></td></tr><tr><td>sNPF-GAL4</td><td></td><td></td><td>Provided by Z. Zhao</td></tr><tr><td>NPF-GAL4</td><td></td><td></td><td>Provided by Y. Rao</td></tr><tr><td>TH-GAL4</td><td></td><td></td><td>Provided by Y. Rao</td></tr><tr><td>5-HT-GAL4</td><td></td><td></td><td>Provided by Y. Rao</td></tr><tr><td>AKH-GAL4</td><td></td><td></td><td>Provided by Y. Rao</td></tr><tr><td>dip2-GAL4</td><td></td><td></td><td>Provided by Y. Rao</td></tr><tr><td>Taotie-GAL4</td><td></td><td></td><td>Provided by J. Carlson</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Biowest</td><td>G-10</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>Erioglaucine disodium salt</td><td>Sigma</td><td>861146</td><td></td></tr><tr><td>all-trans-retinal&amp;nbsp;</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>R2500</td><td>stored in darkness</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Amresco</td><td>9002-93-01</td><td></td></tr><tr><td>Fly food</td><td></td><td>1 L food contains: 77.7 g corn meal, 32.19 g yeast, 5 g agar, 0.726 g CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 31.62 g sucrose, 63.2 g glucose, 2 g potassium sorbate, pH&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;1x PBS buffer&amp;nbsp;</td><td></td><td>1 L 1X PBS contains: 8 g Nacl, 0.2 g Kcl, 1.44 g Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 0.24 g KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, pH 7.4</td><td></td></tr><tr><td>PBST buffer</td><td></td><td>1X PBS with 1% Triton X-100</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Grinding mill</td><td>Shang Hai Jing Xin</td><td>Tissuelyser-24</td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Ning Bo Jiang Nan</td><td>HWS-80</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic stirrer with a heat plate</td><td>Chang Zhou Bo Yuan</td><td>CJJ 78-1</td><td></td></tr><tr><td>Spectrometer</td><td>Thorlabs</td><td>CCS200/M</td><td></td></tr><tr><td>Microplate Spectrophotometer</td><td>Thermo Scientific&amp;nbsp;</td><td>Multiskan GO Type: 1510, REF 51119200</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence stereo microscope&amp;nbsp;</td><td>Leica</td><td>&amp;nbsp;M205FA</td><td></td></tr><tr><td>Stereo microscope</td><td>Leica&amp;nbsp;</td><td>S6E</td><td></td></tr><tr><td>Outside container</td><td>Jiang Su Hai Men</td><td>glass vial with a diameter of 31.8 mm and a height of 80 mm (inside dimension)</td><td></td></tr><tr><td>Inside container&amp;nbsp;</td><td>Beijing Yi Ran machinery factory</td><td>plastic dish with a diameter of 13.6 mm and a height of 7.5 mm (inside dimension)</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL Eppendorf tubes</td><td>Hai Men Ning Mong</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;96 well plate</td><td>Corning Incorporated</td><td>&amp;nbsp;Costar 3599</td><td></td></tr><tr><td>LEDs</td><td>Xin Xing Yuan Guangdian</td><td>607 nm, 3W&amp;nbsp;</td><td>https://item.taobao.com/item.htm?id=20158878058</td></tr></tbody></table>

combining quantitative food-intake assays and forcibly activating neurons to study appetite in drosophila

Consumo de alimentos está sob o controle apertado do cérebro, que integra o estado fisiológico, palatabilidade e conteúdo nutricional dos alimentos e questões de comandos para iniciar ou parar a alimentação. Decifrando os processos subjacentes a tomada de decisão oportuna e moderada alimentação traz implicações importantes em nossa compreensão de distúrbios fisiológicos e psicológicos relacionados ao controle de alimentação. Métodos quantitativos, simples e robustos são necessários para mensurar a ingestão de alimentos de animais após manipulação experimental, como à força, aumentando as atividades de certos neurônios do alvo. Aqui, nós introduzimos a ensaios de alimentação corante-rotulagem-based para facilitar o estudo neurogenetic de controle de alimentação em adultos de moscas de fruta. Podemos rever ensaios de alimentação disponíveis e em seguida descrever nossos métodos passo a passo da configuração para análise, que combinam thermogenetic e manipulação de optogenetic de neurônios controlando alimentação motivação com ensaio de ingestão de alimentos tingir-etiquetados. Também discutimos as vantagens e limitações dos nossos métodos, em comparação com outros ensaios de alimentação, para ajudar os leitores a escolher um ensaio apropriado.

Thermogenetic tela.
Anormalmente, aumento do apetite faz com que a ingestão de alimentos elevados, independentemente de necessidades fisiológicas. Utilizamos este regime para projetar um elevado-throughput comportamental tela para obter alças genéticas de neurônios relacionados à fome e saciado Estados (Figura 1). A tela rendeu Taotie-Gal424. Quando os neurôni...

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Combining Quantitative Food-intake Assays and Forcibly Activating Neurons to Study Appetite in Drosophila

Ensaios quantitativos de ingestão de alimentos com comida tingido fornecem um robusto e alta produtividade significa avaliar a motivação de alimentação. Combinando o ensaio de consumo de alimentos com thermogenetic e telas de optogenetic é uma poderosa abordagem para investigar os circuitos neurais subjacentes apetite em adultos melanogaster da drosófila.

Combinando os ensaios quantitativos de ingestão de alimentos e forçosamente, ativando os neurônios para estudar o apetite em Drosophila

Food consumption is under the tight control of the brain, which integrates the physiological status, palatability, and nutritional contents of the food, ...

combining-quantitative-food-intake-assays-forcibly-activating-neurons

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Behavior

Combining Quantitative Food-intake Assays and Forcibly Activating Neurons to Study Appetite in Drosophila

8.2K visualizações.  University of Science and Technology of China. Ensaios quantitativos de ingestão de alimentos com comida tingido fornecem um robusto e alta produtividade significa avaliar a motivação de alimentação. Combinando o ensaio de consumo de alimentos com thermogenetic e telas de optogenetic é uma poderosa abordagem para investigar os circuitos neurais subjacentes apetite em adultos melanogaster da drosófila.

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Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated. Thus, simultaneous recordings of neuronal activity and behavior are essential to correlate brain activity to behavior. For such behavioral analyses, the fruit fly, Drosophila melanogaster, allows us to incorporate genetically encoded calcium indicators such as GCaMP1, to monitor neuronal activity, and to use sophisticated genetic manipulations for optogenetic or thermogenetic techniques to specifically activate identified neurons2-5. Use of a thermogenetic technique has led us to find critical neurons for feeding behavior (Flood et al., under revision). As a main part of feeding behavior, a Drosophila adult extends its proboscis for feeding6 (proboscis extension response; PER), responding to a sweet stimulus from sensory cells on its proboscis or tarsi. Combining the protocol for PER7 with a calcium imaging technique8 using GCaMP3.01, 9, I have established an experimental system, where we can monitor activity of neurons in the feeding center &#x2013; the suboesophageal ganglion (SOG), simultaneously with behavioral observation of the proboscis. I have designed an apparatus ("Fly brain Live Imaging and Electrophysiology Stage": "FLIES") to accommodate a Drosophila adult, allowing its proboscis to freely move while its brain is exposed to the bath for Ca2+ imaging through a water immersion lens. The FLIES is also appropriate for many types of live experiments on fly brains such as electrophysiological recording or time lapse imaging of synaptic morphology. Because the results from live imaging can be directly correlated with the simultaneous PER behavior, this methodology can provide an excellent experimental system to study information processing of neuronal networks, and how this cellular activity is coupled to plastic processes and memory.

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

The fruit fly, Drosophila melanogaster, extends its proboscis for feeding, responding to a sugar stimulus from its proboscis or tarsus. I have combined observations of the proboscis extension response (PER) with a calcium imaging technique, allowing us to monitor the activity of neurons in the brain, simultaneously with behavioral observation.

De gravação simultânea de sinais de cálcio dos neurônios identificados e comportamento alimentar de Drosophila melanogaster</em

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated.  Thus, ...

Neurociência

Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae

In the following we describe the methodological details of appetitive associative olfactory learning in Drosophila larvae. The setup, in combination with genetic interference, provides a handle to analyze the neuronal and molecular fundamentals of specifically associative learning in a simple larval brain.
Organisms can use past experience to adjust present behavior. Such acquisition of behavioral potential can be defined as learning, and the physical bases of these potentials as memory traces1-4. Neuroscientists try to understand how these processes are organized in terms of molecular and neuronal changes in the brain by using a variety of methods in model organisms ranging from insects to vertebrates5,6. For such endeavors it is helpful to use model systems that are simple and experimentally accessible. The Drosophila larva has turned out to satisfy these demands based on the availability of robust behavioral assays, the existence of a variety of transgenic techniques and the elementary organization of the nervous system comprising only about 10,000 neurons (albeit with some concessions: cognitive limitations, few behavioral options, and richness of experience questionable)7-10.
Drosophila larvae can form associations between odors and appetitive gustatory reinforcement like sugar11-14. In a standard assay, established in the lab of B. Gerber, animals receive a two-odor reciprocal training: A first group of larvae is exposed to an odor A together with a gustatory reinforcer (sugar reward) and is subsequently exposed to an odor B without reinforcement 9. Meanwhile a second group of larvae receives reciprocal training while experiencing odor A without reinforcement and subsequently being exposed to odor B with reinforcement (sugar reward). In the following both groups are tested for their preference between the two odors. Relatively higher preferences for the rewarded odor reflect associative learning - presented as a performance index (PI). The conclusion regarding the associative nature of the performance index is compelling, because apart from the contingency between odors and tastants, other parameters, such as odor and reward exposure, passage of time and handling do not differ between the two groups9.

Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae

Drosophila larvae are able to associate odor stimuli with gustatory reward. Here we describe a simple behavioral paradigm that allows the analysis of appetitive associative olfactory learning.

Aprendizagem associativa apetitiva olfativa em<em&gt; Drosophila</em&gt; As larvas

In the following we describe the methodological  details of appetitive associative olfactory learning in Drosophila larvae. The setup, in combination with ...

A Single-fly Assay for Foraging Behavior in Drosophila

For many animals, hunger promotes changes in the olfactory system in a manner that facilitates the search for appropriate food sources. In this video article, we describe an automated assay to measure the effect of hunger or satiety on olfactory dependent food search behavior in the adult fruit fly Drosophila melanogaster. In a light-tight box illuminated by red light that is invisible to fruit flies, a camera linked to custom data acquisition software monitors the position of six flies simultaneously. Each fly is confined to walk in individual arenas containing a food odor at the center. The testing arenas rest on a porous floor that functions to prevent odor accumulation. Latency to locate the odor source, a metric that reflects olfactory sensitivity under different physiological states, is determined by software analysis. Here, we discuss the critical mechanics of running this behavioral paradigm and cover specific issues regarding fly loading, odor contamination, assay temperature, data quality, and statistical analysis.

A Single-fly Assay for Foraging Behavior in Drosophila

In this video article, we describe an automated assay to measure the effect of hunger or satiety on olfactory dependent food search behavior in the adult fruit fly Drosophila melanogaster.

A Single-fly Ensaio para comportamento de forrageamento em<em&gt; Drosophila</em

For many animals, hunger promotes changes in the olfactory system in a manner that facilitates the search for appropriate food sources. In this video ...

A High Throughput Microplate Feeder Assay for Quantification of Consumption in Drosophila

Quantifying food intake in Drosophila is used to study the genetic and physiological underpinnings of consumption-associated traits, their environmental factors, and the toxicological and pharmacological effects of numerous substances. Few methods currently implemented are amenable to high throughput measurement. The Microplate Feeder Assay (MFA) was developed for quantifying the consumption of liquid food for individual flies using absorbance. In this assay, flies consume liquid food medium from select wells of a 1536-well microplate. By incorporating a dilute tracer dye into the liquid food medium and loading a known volume into each well, absorbance measurements of the well acquired before and after consumption reflect the resulting change in volume (i.e., volume consumed). To enable high throughput analysis with this method, a 3D-printed coupler was designed that allows flies to be sorted individually into 96-well microplates. This device precisely orients 96- and 1536-well microplates to give each fly access to up to 4 wells for consumption, thus enabling food preference quantification in addition to regular consumption. Furthermore, the device has barrier strips that toggle between open and closed positions to allow for controlled containment and release of a column of samples at a time. This method enables high throughput measurements of consumption of aqueous solutions by many flies simultaneously. It also has the potential to be adapted to other insects and to screen consumption of nutrients, toxins, or pharmaceuticals.

A High Throughput Microplate Feeder Assay for Quantification of Consumption in Drosophila

The microplate feeder assay offers an economical, high throughput method for quantifying liquid food consumption in Drosophila. A 3D-printed device connects a 96-well microplate in which flies are housed to a 1536-well microplate from which flies consume a feeding solution with a tracer dye. The solution volume decline is measured spectrophotometrically.

Um ensaio alimentador de microplaco de alta produtividade para quantificação do consumo em Drosophila

Quantifying food intake in Drosophila is used to study the genetic and physiological underpinnings of consumption-associated traits, their environmental ...

Comportamento

A Simple Way to Measure Alterations in Reward-seeking Behavior Using Drosophila melanogaster

We describe a protocol for measuring ethanol self-administration in fruit flies (Drosophila melanogaster) as a proxy for changes in reward states. We demonstrate a simple way to tap into the fly reward system, modify experiences related to natural reward, and use voluntary ethanol consumption as a measure for changes in reward states. The approach serves as a relevant tool to study the neurons and genes that play a role in experience-mediated changes of internal state. The protocol is composed of two discrete parts: exposing the flies to rewarding and nonrewarding experiences, and assaying voluntary ethanol consumption as a measure of the motivation to obtain a drug reward. The two parts can be used independently to induce the modulation of experience as an initial step for further downstream assays or as an independent two-choice feeding assay, respectively. The protocol does not require a complicated setup and can therefore be applied in any laboratory with basic fly culture tools.

A Simple Way to Measure Alterations in Reward-seeking Behavior Using Drosophila melanogaster

We describe a protocol for inducing rewarding and nonrewarding experiences in fruit flies (Drosophila melanogaster) using voluntary ethanol consumption as a measure for changes in reward states.

Uma maneira simples para medir alterações na Recompensa comportamento de busca Usando<em&gt; Drosophila melanogaster</em

We describe a protocol for measuring ethanol self-administration in fruit flies (Drosophila melanogaster) as a proxy for changes in reward states. We ...

The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster

For most animals, feeding is an essential behavior for securing survival, and it influences development, locomotion, health and reproduction. Ingestion of the right type and quantity of food therefore has a major influence on quality of life. Research on feeding behavior focuses on the underlying processes that ensure actual feeding and unravels the role of factors regulating internal energy homeostasis and the neuronal bases of decision-making. The model organism Drosophila melanogaster, with its great variety of genetically traceable tools for labeling and manipulating single neurons, allows mapping of neuronal networks and identification of molecular signaling cascades involved in the regulation of food intake. This report demonstrates the CApillary FEeder assay (CAFE) and shows how to measure food intake in a group of flies for time spans ranging from hours to days. This easy-to-use assay consists of glass capillaries filled with liquid food that flies can freely access and feed on. Food consumption in the assay is accurately determined using simple measurement tools. Herein we describe step-by-step the method from setup to successful execution of the CAFE assay, and provide practical examples to analyze the food intake of a group of flies under controlled conditions. The reader is guided through possible limitations of the assay, and advantages and disadvantages of the method compared to other feeding assays in D. melanogaster are evaluated.

The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster

The CApillary FEeder (CAFE) assay is a simple, budget-friendly, highly reliable method for investigating mechanisms underlying food intake. Used with the highly versatile genetic model organism Drosophila melanogaster, it provides a powerful means of gaining new insights into regulatory mechanisms of food intake.

O capilar alimentador ensaio mede ingestão alimentar em<em&gt; Drosophila melanogaster</em

For most animals, feeding is an essential behavior for securing survival, and it influences development, locomotion, health and reproduction. Ingestion of ...

Quantification of Macronutrients Intake in a Thermogenetic Neuronal Screen using Drosophila Larvae

Foraging and feeding behaviors allow animals to access sources of energy and nutrients essential for their development, health, and fitness. Investigating the neuronal regulation of these behaviors is essential for the understanding of the physiological and molecular mechanisms underlying nutritional homeostasis. The use of genetically tractable animal models such as worms, flies, and fish greatly facilitates these types of studies. In the last decade, the fruit fly Drosophila melanogaster has been used as a powerful animal model by neurobiologists investigating the neuronal control of feeding and foraging behaviors. While undoubtedly valuable, most studies examine adult flies. Here, we describe a protocol that takes advantage of the simpler larval nervous system to investigate neuronal substrates controlling feeding behaviors when larvae are exposed to diets differing in their protein and carbohydrates content. Our methods are based on a quantitative colorimetric no-choice feeding assay, performed in the context of a neuronal thermogenetic-activation screen. As a read-out, the amount of food eaten by larvae over a 1 h interval was used when exposed to one of the three dye-labeled diets that differ in their protein to carbohydrates (P:C) ratios. The efficacy of this protocol is demonstrated in the context of a neurogenetic screen in larval Drosophila, by identifying candidate neuronal populations regulating the amount of food eaten in diets of different macronutrient quality. We were also able to classify and group the genotypes tested into phenotypic classes. Besides a brief review of the currently available methods in the literature, the advantages and limitations of these methods are discussed and, also, some suggestions are provided about how this protocol might be adapted to other specific experiments.

Quantification of Macronutrients Intake in a Thermogenetic Neuronal Screen using Drosophila Larvae

Described here is a protocol that enables the colorimetric quantification of the amount of food eaten within a defined interval of time by Drosophila melanogaster larvae exposed to diets of different macronutrient quality. These assays are conducted in the context of a neuronal thermogenetic screen.

Quantificação da ingestão de Macronutrientes em uma Tela Neuronal Termogenética usando Larvas de Drosophila

Foraging and feeding behaviors allow animals to access sources of energy and nutrients essential for their development, health, and fitness. Investigating ...

A Rapid Food-Preference Assay in Drosophila

To select food with nutritional value while avoiding the consumption of harmful agents, animals need a sophisticated and robust taste system to evaluate their food environment. The fruit fly, Drosophila melanogaster, is a genetically tractable model organism that is widely used to decipher the molecular, cellular, and neural underpinnings of food preference. To analyze fly food preference, a robust feeding method is needed. Described here is a two-choice feeding assay, which is rigorous, cost-saving, and fast. The assay is Petri-dish-based and involves the addition of two different foods supplemented with blue or red dye to the two halves of the dish. Then, ~70 prestarved, 2-4-day-old flies are placed in the dish and&#160;allowed to choose between blue and red foods in the dark for about 90 min. Examination of the abdomen of each fly is followed by the calculation of the preference index. In contrast to multiwell plates, each Petri dish takes only ~20 s to fill and saves time and effort. This feeding assay can be employed to quickly determine whether flies like or dislike a particular food.

A Rapid Food-Preference Assay in Drosophila

We present a protocol for a two-choice feeding assay for flies. This feeding assay is fast and easy to run and is suitable not only for small-scale laboratory research, but also for high-throughput behavioral screens in flies.

Um ensaio rápido de preferência alimentar em Drosophila

To select food with nutritional value while avoiding the consumption of harmful agents, animals need a sophisticated and robust taste system to evaluate ...

In Vivo Calcium Imaging of Taste-Induced Neural Responses in Adult Drosophila

For nearly two decades, in vivo calcium imaging has been an effective method for measuring cellular responses to taste stimuli in the fruit fly model organism, Drosophila melanogaster. A key strength of this methodology is its ability to record taste-induced neural responses in awake animals without the need for anesthesia. This approach employs binary expression systems (e.g., Gal4-UAS) to express the calcium indicator GCaMP in specific neurons of interest. This protocol describes a procedure in which flies expressing GCaMP are mounted with the labellum securely positioned, enabling fluorescence in the brain to be recorded at millisecond resolution under a confocal microscope while a solution is applied to the labellum, stimulating all labellar taste sensilla. The examples provided focus on calcium responses in primary gustatory receptor neurons of D. melanogaster. However, this approach can be adapted to record from other neurons of interest within the brain of Drosophilids or other insect species. This imaging method enables researchers to simultaneously record collective calcium responses from groups of gustatory neurons across the labellum, complementing electrophysiological tip recordings that quantify action potentials from individual neurons. The in vivo calcium imaging technique outlined here has been instrumental in uncovering molecular and cellular mechanisms of chemosensation, identifying unique temporal response patterns in primary taste neurons, investigating mechanisms of gustatory modulation, and exploring taste processing in downstream circuits.

A calcium imaging approach enables the recording of taste-induced responses in the brains of awake flies while a solution is applied to the labellum. Primary gustatory responses in Drosophila melanogaster are used as an example, but this protocol can be adapted to study downstream neurons or other species.

In vivo Imagem de cálcio de respostas neurais induzidas pelo paladar em Drosophila adulta

For nearly two decades, in vivo calcium imaging has been an effective method for measuring cellular responses to taste stimuli in the fruit fly model ...

Taste Preference Assay: A Method for Measuring Feeding Behavior in Drosophila

Source: Bantel, A. P. and Tessier, C. R. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/video/54403/" target="_blank">Taste Preference Assay for Adult Drosophila</a>. J. Vis. Exp. (2016).
This video describes the taste preference assay, a behavioral method used to measure attraction or avoidance towards colored solutions that taste differently by assessing the fly&#39;s abdominal coloration after ingestion of the preferred substance. The featured protocol demonstrates the procedure used to measure flies&#39; preference towards solutions of varying sucrose concentrations.

Ensaio de Preferência de Sabor: Um Método para Medir o Comportamento Alimentar em Drosophila

Source: Bantel, A. P. and Tessier, C. R. Taste Preference Assay for Adult Drosophila. J. Vis. Exp. (2016).
This video describes the taste preference ...

Combinando os ensaios quantitativos de ingestão de alimentos e forçosamente, ativando os neurônios para estudar o apetite em Drosophila

Resumo

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Capítulos neste vídeo

De gravação simultânea de sinais de cálcio dos neurônios identificados e comportamento alimentar de Drosophila melanogaster

Aprendizagem associativa apetitiva olfativa em

A Single-fly Ensaio para comportamento de forrageamento em

Um ensaio alimentador de microplaco de alta produtividade para quantificação do consumo em Drosophila

Uma maneira simples para medir alterações na Recompensa comportamento de busca Usando

O capilar alimentador ensaio mede ingestão alimentar em

Quantificação da ingestão de Macronutrientes em uma Tela Neuronal Termogenética usando Larvas de Drosophila

Um ensaio rápido de preferência alimentar em Drosophila

In vivo Imagem de cálcio de respostas neurais induzidas pelo paladar em Drosophila adulta

Ensaio de Preferência de Sabor: Um Método para Medir o Comportamento Alimentar em Drosophila