Name: application of chronic stimulation to study contractile activity-induced rat skeletal muscle phenotypic adaptations
Uploaded: 2018-01-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 50 s
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Nós estamos gratos ao Liam Tyron para seu especialista em leitura do manuscrito. Este trabalho foi apoiado pelo financiamento das ciências naturais e engenharia pesquisa Conselho de Canadá (NSERC) para D. A. Hood. M. r. Hood também é o titular de uma cadeira de pesquisa do Canadá em fisiologia celular.

Todos os procedimentos com animais foram revistos e aprovados pela York University Animal conta Comissão. À chegada à instalação de animal na Universidade de York, todos os ratos receberam um mínimo de cinco dias se adapte ao seu ambiente antes do procedimento cirúrgico, com alimentos fornecidos ad libitum. Embora este protocolo tem sido anteriormente aplicado a outras espécies15,17,22, o papel atual baseia-se o trabalho pioneiro de Pette e colegas23 e incide sobre o modelo de rato, especificamente.
1. preparação da unidade de atividade contrátil crônica
<ol><li>Usando um voltímetro, verifica o potencial das baterias de lítio de moeda. Nota: O potencial de cada bateria deve ser de 3,0 ± 0,10 V.</li>
	<li>Insira duas ou três baterias no slot da unidade para que o potencial total é de 6-9 V. Nota: É o critério dos pesquisadores a considerar quanto potencial (6 ou 9 V) para manter durante o procedimento todo experimental. Dependendo do projeto de estudo e a intensidade desejada do estímulo, ou 2 ou 3 baterias podem ser usadas.</li>
	<li>Verificar se a unidade está funcionando corretamente através do indicador de pulso, por sujeitar o aparelho a 1 pulso emitido por uma luz de estroboscópio portátil infravermelha.</li>
</ol>2. cirurgia da atividade contrátil crônica
Nota: É necessário esterilize todos os instrumentos cirúrgicos antes do procedimento cirúrgico. Durante e imediatamente após a cirurgia, a temperatura do corpo dos ratos é mantida por uma almofada de aquecimento. É desejável para realizar o procedimento cirúrgico em um pano cirúrgico. O cirurgião deve usar luvas cirúrgicas estéreis, bem como um jaleco limpo. Se necessário, é recomendável usar uma máscara respirador descartável.
<ol><li>ANESTHETIZE ratos abaixo de 1-3% isoflurano inalação com oxigênio, que é operado por um sistema de evaporação de gás. Confirme o animal está totalmente sedada, verificando a pitada de dedo do pé do membro posterior e observando o ritmo e profundidade respiratória. Aplique lubrificante ocular nos olhos para evitar ressecamento. Aplica uma injeção subcutânea de Meloxicam (0,5 mg/mL) em 2 mg/kg. Nota: Também é recomendável ter uma aplicação multimodal de analgesia (por exemplo, Meloxicam mais lidocaína) para minimizar a dor durante e após a cirurgia.</li>
	<li>Delicadamente raspe o membro posterior esquerdo, bem como uma faixa ao redor do tronco da parte de trás do pescoço, ao redor atrás dos membros dianteiros e do outro lado do tórax anterior. Limpe suavemente áreas depiladas com iodo e álcool etílico para desinfectar.</li>
	<li>Com o animal deitado no seu estômago, faça uma pequena incisão (~0.5 cm) na parte de trás do pescoço no centro da região depilada (área palpável entre omoplatas) usando um bisturi (lâmina n º 10).</li>
	<li>Localize o nervo fibular comum.<ol>
<li>Rolar o animal para o seu lado direito e faça um ~ 2-3 cm-longo corte na pele do membro posterior esquerdo. A área de incisão em torno de grupos do músculo da coxa que é pérgula entre a covinha da articulação do joelho e a parte traseira perto da origem da cauda do alvo. Nota: Tenha cuidado para não contaminar a primeira área de incisão quando muda a posição do corpo.</li>
		<li>Usando a ponta romba curva tesoura cirúrgica, dissecar a área subcutânea amplamente ~3.5 - 4 cm, separando a pele do músculo subjacente a fim de fazer uma bolsa entre o músculo subjacente e pele aberta. Abra a pele do tecido subjacente em torno da circunferência inteira da incisão (~1.5 cm2).</li>
		<li>Faça uma pequena incisão (menos de 0,5 cm) no músculo bíceps femoral com tesoura cirúrgica, garantindo que as pontas da tesoura estão cortando diretamente através do músculo.</li>
		<li>Abra cuidadosamente a área de corte até os grupos musculares interna e o nervo fibular comum são visíveis (a profundidade dos tecidos musculares externos (ou seja, bíceps femoral) é em torno de ~0.5 cm). Usando fórceps, suavemente toque/pitada nervo visível e observar as respostas dos grupos músculo-alvo (por exemplo, TA muscular) e pés (dorsiflexão visível) para confirmar que o nervo fibular comum é isolado. Nota: Este passo deve ser feito com extrema cautela para evitar cortar ou danificar o nervo.</li>
		<li>Consertar a janela, puxando-a aberta com retractores de metal, tal que o tamanho da janela é ~1.5 cm2 com o nervo fibular deitado no centro da janela. Use pequenos ganchos de metal ligados a correias e/ou bandas de borracha que são prendidas para baixo para a superfície da mesa (ou placa de cirurgia) (Figura 2A).</li>
	</ol></li>
	<li>Conecte o cabo a ambos os lados do nervo.<ol>
<li>Preparar ~ 50-60 cm de politetrafluoretileno (PTFE)-revestido de fio de aço fino e dobre ao meio. Nota: Pode ser útil para expor o arame revestido PTFA sob a luz UV antes da cirurgia.</li>
		<li>Prenda a parte dobrada do fio na fenda de uma haste de aço inoxidável 30 cm de comprimento. Passe a haste, juntamente com o fio, por via subcutânea do bolso aberto do membro posterior em direção da área de pequena incisão na parte de trás do pescoço, em um padrão em forma de L até a perna e ao longo do centro do dorso.</li>
		<li>Encontre as duas extremidades do fio para o membro posterior. Tira os fios, uma vez que todos os fios são isolados de PTFE. Usando um bisturi, cuidadosamente tira as extremidades do fio de ~1.5 cm. Se os fios tornam-se desgastadas, cortá-los fora e re-tira. Enrole as extremidades do fio descascado em torno de uma agulha cega de 21-G (5 vezes), fazendo uma bobina. Uma vez que as bobinas são feitas corretamente, liberar a agulha com eles.</li>
		<li>Usando um tamanho de fio cirúrgico 6-0, prenda cada uma das bobinas em ambos os lados do nervo peroneal comum (Figura 2A).<ol>
<li>Faça um nó no final da bobina e sutura-la do lado esquerdo do nervo. Verifique se a bobina está a 1.5-2.5 mm do nervo.</li>
			<li>Para fixar a bobina, aplique duas ou três suturas adicionais ao longo da bobina.</li>
			<li>Repita essas etapas no lado direito do nervo.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Aplicar 2-3 gotas de solução de antibiótica (Ampicilina em soro fisiológico; 132 mg/mL) e então cuidadosamente suturar a janela (ou seja, o tecido muscular bíceps femoris) usando tamanho 5-0 de seda.</li>
	</ol></li>
	<li>Vagamente vento a folga restante do fio (sobre o diâmetro do dedo) e empurrar para a bolsa subcutânea acima da incisão suturada do músculo bíceps femoral (aproximadamente acima do quadril).</li>
	<li>Aplica 2-3 gotas de solução antibiótica novamente (Ampicilina em soro fisiológico; 132 mg/mL). Feche a pele aberta por grampeamento.</li>
	<li>Ligue os fios (saindo da área de incisão do pescoço) para o estimulador CCA.<ol>
<li>Conecte o pino soquetes com os fios.<ol>
<li>Corte o laço de fio saindo a incisão na parte superior do pescoço para criar 2 extremidades do fio (estes chumbo para as bobinas suturado para ambos os lados do nervo peroneal).</li>
			<li>Usando um bisturi, dispam-se as extremidades dos fios de ~0.5 cm. cortar fora os fios, se for o caso.</li>
			<li>Lentamente empurre as peças despojadas dos fios dentro do buraco das tomadas de pino e usando um ferro de solda, solda os fios sobre as tomadas de pino.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Opcionalmente, verifique a conexão dos fios.<ol>
<li>Conecte os pinos para uma unidade de bancada grande estimulador através de jacaré.</li>
			<li>Entrega um único pulso de 9 V (0,1 ms, 10 Hz) para confirmar que os contratos de músculo TA e esquerda pés dorsiflexes.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Passe as extremidades do fio conectado pino através da gaze estéril que é ~ 4 x 4 cm.</li>
		<li>Conecte os pinos para a unidade de estimulador do CCA.<ol>
<li>Passe os fios através do furo da base da caixa do estimulador. Nota: Esta caixa é uma câmara de caseiros para a unidade de estimulador do CCA e 3,5 cm × 3,5 cm × 2,5 cm13.</li>
			<li>Inserir os pinos os soquetes de conexão da unidade de CCA. Gentilmente colocou a unidade CCA para a câmara. Use uma aderência pegajosa para proteger a unidade CCA, na parte inferior da câmara.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Usando uma fita atlética ou o esparadrapo poroso, consertar a câmara com a fita ao redor do tronco raspada. Fechar a parte superior da câmara com três camadas de gravação e terminar por uma fita de embrulho em torno dos lados da caixa estimulador para prender a caixa (Figura 2B).</li>
	</ol></li>
	<li>Verifique se o CCA está trabalhando por sujeitar o aparelho a um único pulso de luz infravermelha (espectro de comprimento de onda > 770 nm) que é emitida por uma luz de estroboscópio portátil infravermelha. Nota: Se o CCA está funcionando corretamente, os investigadores será capazes de ver que os músculos do membro posterior (ou seja, TA) são contratantes em resposta à luz infravermelha.</li>
	<li>Observar o rato e monitorar sua temperatura até que recuperou totalmente a consciência. Abrigá-lo em uma gaiola de single-ocupante para evitar qualquer dano dos outros animais e não deixe qualquer túneis ou objetos de plástico na gaiola para o restante do estudo para mitigar o risco de danos à unidade de estimulador ou ferimentos ao animal. Fornecer com uma garrafa de água amoxicilina-incluído (0,5 mg/mL).</li>
	<li>Aplica a dose de 1 mg/kg de Meloxicam por via subcutânea cada 24 h após a cirurgia, que continua pelo menos por 72 h.</li>
</ol>3. crônica atividade contrátil
<ol><li>Após a cirurgia, permitir que pelo menos 5-7 dias para uma recuperação completa de incisão e sutura áreas em/em torno dos músculos esqueléticos. Nota: Durante e após o procedimento CCA, verifique cuidadosamente condição de cada animal, observando seus comportamentos (por exemplo, comer, beber e/ou em movimento). Além disso, determine qualquer estresse severo ou efeitos adversos, verificando uma mudança de peso corporal antes e após o procedimento CCA.</li>
	<li>No dia da estimulação de CCA, ativar CCA por sujeitar o aparelho estimulador para um único pulso de luz infravermelha (comprimentos de onda > 770 nm) por uma luz de estroboscópio portátil infravermelha.</li>
	<li>Aplica 3 ou 6 h de estimulação de CCA 10 Hz. Nota: O prazo para a estimulação cabe ao pesquisador. A frequência de estimulação nunca foi alterada nesses experimentos e melhorias muito modestas na adaptação mitocondrial têm sido observadas, estendendo a estimulação de 3 a 6 h/dia, em nossa experiência. Se possível, verificar a estimulação e o animal cada 30-60 min.</li>
	<li>Seguindo o período desejado de CCA, desligue a unidade CCA através de exposição à luz infravermelha (mesmo procedimento de ligar o aparelho).</li>
	<li>Aplicação de vários dias, repita a etapa 3.2. a 3.4.</li>
	<li>Determine o momento da coleta de tecido. Por exemplo, colete tecidos 24 h após o início da luta final do CCA (ou seja, 18 h após a última estimulação CCA de 6 h), que é realizado sob anestesia, como feito durante o procedimento cirúrgico do CCA. Imediatamente após a coleta todos os tecidos, eutanásia em animais por excisão do coração, enquanto o animal ainda está sob anestesia.</li>
</ol>

<ol>
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Os autores não têm nada para divulgar.

O modelo de atividade contrátil crônica (CCA) do exercício, com baixa frequência músculo estimulação na vivo, é um excelente modelo para o estudo adaptações fenotípica do músculo para exercer13,24,25 , 26. como mostrado em anteriores estudos20,27, CCA é uma ferramenta eficaz pelo qual os pesquisadores podem control...

Músculo esquelético pode adaptar-se para exercer a formação através de mudanças na sua Bioenergética e estrutura física1. Dentre as principais alterações provocadas pelo treinamento de resistência é a biogênese mitocondrial, o que pode ser avaliada por um aumento na expressão de componentes mitocondriais (por exemplo, subunidades de c oxidase [COX] citocromo), bem como a expressão de o coactivator transcriptional, PGC-1 α2. Um número crescente de estudos têm indicado que inúmeros outros fatores, incluindo volume mitocondrial e mitophagy, também são importantes para as adaptações musculares. No entanto, os mecanismos pelo qual o exercício agudo ou crônico regulam estes processos no músculo esquelético não são ainda claras.
Para delinear as vias que regulam as adaptações musculares induzidas pelo exercício, vários modelos de exercício têm sido comumente utilizados em estudos de roedores, incluindo esteira, rodando a roda e exercício de natação. No entanto, estes protocolos têm algumas limitações, em que ~ 4-12 semanas são necessárias para observar essas alterações fenotípicas3,4,5. Como uma alternativa do método experimental, baixa frequência induzida por estimulação crônica atividade contrátil (CCA) tem sido efetivamente utilizada, pode levar a adaptações do músculo em um período substancialmente mais curto (ou seja, até 7 dias) e seus efeitos parecem ser comparável, ou até mesmo maior do que outros protocolos de exercício. Além disso, a presença de hormonais6, temperatura7e efeitos neurológicos8 pode dificultar a entender as respostas específicas do músculo ao exercício crônico. Por exemplo, o hormônio tireoidiano9,10 e fator de crescimento semelhante à insulina (IGF) -111 foram identificadas para mediar adaptações musculares induzidas pelo treinamento, que também podem regular outras vias de sinalização em esquelética muscular. Notavelmente, induzida pela CCA efeitos minimamente são regulados por fatores sistêmicos, permitindo que o foco para ser colocado sobre a resposta direta a atividade contrátil do músculo esquelético.
Unidade externa para CCA foi introduzido pela primeira vez por Tyler e Wright12e foi desenvolvida com modificações12. Em suma, a unidade é composta por três partes principais: um detector de infravermelho que pode ser ligado e desligada pela exposição à luz infravermelha, um gerador de pulso e um indicador de pulso (Figura 1). O projeto de circuito detalhado da unidade estimulador tem sido descrito anteriormente13. As características detalhadas e específicas de CCA podem ser encontradas em maiores profundidade em um número de revisão artigos14,15,16,17. Em breve, o protocolo de estimulação é projetado para ativar o nervo fibular comum em baixa frequência (ou seja, 10 Hz), e os músculos inervados (tibial anterior [TA] e músculo extensor dos dedos longus [EDI]) são obrigados a contratar para um comprimento pré-determinado de tempo (por exemplo, 3-6 h). Ao longo do tempo, esta desloca os músculos acima mencionados para um fenótipo mais aeróbico, demonstrado pelo aumento na densidade capilar18 e conteúdo mitocondrial19,20,21. Assim, esse método é um modelo comprovado para imitar alguns das adaptações de treinamento de grande resistência no músculo esquelético de ratos.
Este trabalho apresenta um procedimento detalhado da cirurgia de implante de eletrodo para induzir o CCA para que os pesquisadores podem aplicar este modelo em seus estudos de exercício. CCA é um excelente modelo para estudar o curso de tempo das adaptações musculares, proporcionando assim uma ferramenta eficaz para a investigação de vários eventos moleculares e sinalização em ambos os pontos de tempo de início e, mais tarde, após o início do exercício.

<table><tbody><tr><td>Sprague Dawley Rat</td><td>Charles River</td><td>Strain 400</td><td></td></tr><tr><td>Chronic contractile activity unit</td><td>Home-made</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>CCA unit protective box (3.5 x 3.5 x 2.5 cm)</td><td>Home-made</td><td>n/a</td><td>Box should be made of opaque material or covered in an opague tape</td></tr><tr><td>Coin lithium ion batteries (3V)</td><td>Panasonic</td><td>CR2016</td><td></td></tr><tr><td>Medwire</td><td>Leico Industries</td><td>316SS7/44T</td><td></td></tr><tr><td>Solder pin (socket)</td><td>Digi-Key</td><td>ED6218-ND</td><td></td></tr><tr><td>Zonas porous tape</td><td>Johnson &amp;amp; Johnson</td><td>5104</td><td></td></tr><tr><td>Suture silk (Size 5)</td><td>Ethicon</td><td>640G</td><td></td></tr><tr><td>Suture silk (Size 6)</td><td>Ethicon</td><td>706G</td><td></td></tr><tr><td>Curved blunt scissor (11.5 cm Length)</td><td>F.S.T.</td><td>14075-11</td><td></td></tr><tr><td>Curved blunt scissor (15 cm Length)</td><td>F.S.T.</td><td>14111-15</td><td></td></tr><tr><td>Delicate haemostatic forceps (16 cm Length)</td><td>Lawton</td><td>06-0230</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>Feather</td><td>3</td><td></td></tr><tr><td>Curved forceps</td><td>F.S.T.</td><td>11052-10</td><td></td></tr><tr><td>Stainless-steel rod (30 cm; 7mm diameter)</td><td>Home-made</td><td>n/a</td><td>Rod should have 5 mm slit in one end to hold the wire for tunneling under the skin</td></tr><tr><td>Clip applying forceps</td><td>KLS Martin</td><td>20-916-12</td><td></td></tr><tr><td>Staples (clips)</td><td>Bbraun</td><td>BN507R</td><td></td></tr><tr><td>Metal hooks/retractor</td><td>Home-made</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Povidone-iodine (500 mL)</td><td>Rougier</td><td>#NPN00172944</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin sodium</td><td>Novopharm</td><td>#DIN00872644</td><td></td></tr><tr><td>Metacam</td><td>Boehringer</td><td>#DIN02240463</td><td></td></tr><tr><td>Digital multimeter (voltmeter)</td><td>Soar Corporation</td><td>ME-501</td><td></td></tr><tr><td>LED digital stroboscope</td><td>Lutron Electronic Enterprise</td><td>DT-2269</td><td></td></tr></tbody></table>

application of chronic stimulation to study contractile activity-induced rat skeletal muscle phenotypic adaptations

Músculo esquelético é um tecido altamente adaptável, conforme suas propriedades bioquímicas e fisiológicas são grandemente alteradas em resposta ao exercício crônico. Para investigar os mecanismos subjacentes que trazer várias adaptações musculares, um número de protocolos de exercícios como esteira, corrida de rodas e natação exercício têm sido utilizado nos estudos animais. No entanto, estes exercem modelos requerem um longo período de tempo para alcançar as adaptações musculares, que podem também ser reguladas por fatores humorais ou neurológicas, limitando assim suas aplicações em estudar as adaptações induzida pela contração do músculo específico. Estimulação indireta de baixa frequência (10 Hz) para induzir a atividade contrátil crônica (CCA) tem sido utilizada como um modelo alternativo para o exercício de treinamento, como com êxito pode levar a adaptações mitocondrial muscular dentro de 7 dias, independentes de fatores sistêmicos. Este documento detalha as técnicas cirúrgicas necessárias para aplicar o tratamento de CCA para o músculo esquelético de ratos, para estudos de aplicação generalizada no futuro.

Mostramos que a atividade contrátil crônica (CCA) é uma ferramenta eficaz para induzir adaptações mitocondriais favoráveis dentro do músculo esquelético. Ratos submetidos a 7 dias de CCA (6 h por dia) exibem reforçada biogênese mitocondrial no músculo estimulado em comparação com o membro posterior unstimulated contralateral (controle). Este aumento na biogênese mitocondrial é indicado pela expressão da proteína aumento de PGC-1 α (Figura 3A...

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Application of Chronic Stimulation to Study Contractile Activity-induced Rat Skeletal Muscle Phenotypic Adaptations

Este protocolo descreve o uso do modelo de atividade contrátil crônica de exercício para observar adaptações do músculo esquelético induzida por estimulação no membro posterior de ratos.

Aplicação da estimulação crônica para estudar ratos induzida pela atividade contrátil adaptações fenotípica de músculo esquelético

Skeletal muscle is a highly adaptable tissue, as its biochemical and physiological properties are greatly altered in response to chronic exercise. To ...

application-chronic-stimulation-to-study-contractile-activity-induced

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

6.7K visualizações.  York University. Este protocolo descreve o uso do modelo de atividade contrátil crônica de exercício para observar adaptações do músculo esquelético induzida por estimulação no membro posterior de ratos.

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An in vivo Rodent Model of Contraction-induced Injury and Non-invasive Monitoring of Recovery

Muscle strains are one of the most common complaints treated by physicians. A muscle injury is typically diagnosed from the patient history and physical exam alone, however the clinical presentation can vary greatly depending on the extent of injury, the patient's pain tolerance, etc. In patients with muscle injury or muscle disease, assessment of muscle damage is typically limited to clinical signs, such as tenderness, strength, range of motion, and more recently, imaging studies. Biological markers, such as serum creatine kinase levels, are typically elevated with muscle injury, but their levels do not always correlate with the loss of force production. This is even true of histological findings from animals, which provide a "direct measure" of damage, but do not account for all the loss of function. Some have argued that the most comprehensive measure of the overall health of the muscle in contractile force. Because muscle injury is a random event that occurs under a variety of biomechanical conditions, it is difficult to study. Here, we describe an in vivo animal model to measure torque and to produce a reliable muscle injury. We also describe our model for measurement of force from an isolated muscle in situ. Furthermore, we describe our small animal MRI procedure.

An in vivo Rodent Model of Contraction-induced Injury and Non-invasive Monitoring of Recovery

An in vivo animal model of injury is described. The method takes advantage of the subcutaneous position of the fibular nerve. Velocity, timing of muscle activation, and arc of motion are all pre-determined and synchronized using commercial software. Post injury changes are monitored in vivo using MR imaging/spectroscopy.

Um In vivo Modelo de Contração de roedores induzida por lesões e não-invasivos acompanhamento da recuperação

Muscle strains are one of the most  common complaints treated by physicians. A muscle injury is typically diagnosed from the patient history and  physical ...

Medicina

A Murine Model of Muscle Training by Neuromuscular Electrical Stimulation

Neuromuscular electrical stimulation (NMES) is a common clinical modality that is widely used to restore1, maintain2 or enhance3-5 muscle functional capacity. Transcutaneous surface stimulation of skeletal muscle involves a current flow between a cathode and an anode, thereby inducing excitement of the motor unit and the surrounding muscle fibers. 
NMES is an attractive modality to evaluate skeletal muscle adaptive responses for several reasons. First, it provides a reproducible experimental model in which physiological adaptations, such as myofiber hypertophy and muscle strengthening6, angiogenesis7-9, growth factor secretion9-11, and muscle precursor cell activation12 are well documented. Such physiological responses may be carefully titrated using different parameters of stimulation (for Cochrane review, see 13). In addition, NMES recruits motor units non-selectively, and in a spatially fixed and temporally synchronous manner14, offering the advantage of exerting a treatment effect on all fibers, regardless of fiber type. Although there are specified contraindications to NMES in clinical populations, including peripheral venous disorders or malignancy, for example, NMES is safe and feasible, even for those who are ill and/or bedridden and for populations in which rigorous exercise may be challenging. 
Here, we demonstrate the protocol for adapting commercially available electrodes and performing a NMES protocol using a murine model. This animal model has the advantage of utilizing a clinically available device and providing instant feedback regarding positioning of the electrode to elicit the desired muscle contractile effect. For the purpose of this manuscript, we will describe the protocol for muscle stimulation of the anterior compartment muscles of a mouse hindlimb.

A murine model of neuromuscular electrical stimulation (NMES), a safe and inexpensive clinical modality, to the anterior compartment muscles is described. This model has the advantage of modifying a readily available clinical device for the purpose of eliciting targeted and specific muscle contractions in mice.

Um modelo murino de treinamento muscular por eletroestimulação neuromuscular

Neuromuscular electrical stimulation (NMES) is a common clinical modality that is widely used to restore1, maintain2 or enhance3-5 muscle functional ...

Utilization of Microscale Silicon Cantilevers to Assess Cellular Contractile Function In Vitro

The development of more predictive and biologically relevant in vitro assays is predicated on the advancement of versatile cell culture systems which facilitate the functional assessment of the seeded cells. To that end, microscale cantilever technology offers a platform with which to measure the contractile functionality of a range of cell types, including skeletal, cardiac, and smooth muscle cells, through assessment of contraction induced substrate bending. Application of multiplexed cantilever arrays provides the means to develop moderate to high-throughput protocols for assessing drug efficacy and toxicity, disease phenotype and progression, as well as neuromuscular and other cell-cell interactions. This manuscript provides the details for fabricating reliable cantilever arrays for this purpose, and the methods required to successfully culture cells on these surfaces. Further description is provided on the steps necessary to perform functional analysis of contractile cell types maintained on such arrays using a novel laser and photo-detector system. The representative data provided highlights the precision and reproducible nature of the analysis of contractile function possible using this system, as well as the wide range of studies to which such technology can be applied. Successful widespread adoption of this system could provide investigators with the means to perform rapid, low cost functional studies in vitro, leading to more accurate predictions of tissue performance, disease development and response to novel therapeutic treatment.

Utilization of Microscale Silicon Cantilevers to Assess Cellular Contractile Function In Vitro

This protocol describes the use of microscale silicon cantilevers as pliable culture surfaces for measuring the contractility of muscle cells in vitro. Cellular contraction causes cantilever bending, which can be measured, recorded, and converted into readouts of force, providing a non-invasive and scalable system for measuring contractile function in vitro.

Utilização de microscópicos de silício Cantilevers para avaliar a função celular contrátil<em&gt; In Vitro</em

The development of more predictive and biologically relevant in vitro assays is predicated on the advancement of versatile cell culture systems which ...

Bioengenharia

Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

Despite the regenerative capacity of skeletal muscle, permanent functional and/or cosmetic deficits (e.g., volumetric muscle loss (VML) resulting from traumatic injury, disease and various congenital, genetic and acquired conditions are quite common. Tissue engineering and regenerative medicine technologies have enormous potential to provide a therapeutic solution. However, utilization of biologically relevant animal models in combination with longitudinal assessments of pertinent functional measures are critical to the development of improved regenerative therapeutics for treatment of VML-like injuries. In that regard, a commercial muscle lever system can be used to measure length, tension, force and velocity parameters in skeletal muscle. We used this system, in conjunction with a high power, bi-phase stimulator, to measure in vivo force production in response to activation of the anterior crural compartment of the rat hindlimb. We have previously used this equipment to assess the functional impact of VML injury on the tibialis anterior (TA) muscle, as well as the extent of functional recovery following treatment of the injured TA muscle with our tissue engineered muscle repair (TEMR) technology. For such studies, the left foot of an anaesthetized rat is securely anchored to a footplate linked to a servomotor, and the common peroneal nerve is stimulated by two percutaneous needle electrodes to elicit muscle contraction and dorsiflexion of the foot. The peroneal nerve stimulation-induced muscle contraction is measured over a range of stimulation frequencies (1-200 Hz), to ensure an eventual plateau in force production that allows for an accurate determination of peak tetanic force. In addition to evaluation of the extent of VML injury as well as the degree of functional recovery following treatment, this methodology can be easily applied to study diverse aspects of muscle physiology and pathophysiology. Such an approach should assist with the more rational development of improved therapeutics for muscle repair and regeneration.

Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

We describe an in vivo protocol to measure dorsiflexion of the foot following stimulation of the peroneal nerve and contraction of the anterior crural compartment of the rat hindlimb. Such measurements are an indispensable translational tool for evaluating skeletal muscle pathology and tissue engineering approaches to muscle repair and regeneration.

aplicações de<em&gt; In Vivo</em&gt; Teste Funcional do Rato tibial anterior para a Avaliação da engenharia de tecidos Repair Músculo Esquelético

Despite the regenerative capacity of skeletal muscle, permanent functional and/or cosmetic deficits (e.g., volumetric muscle loss (VML) resulting from ...

Real Time and Repeated Measurement of Skeletal Muscle Growth in Individual Live Zebrafish Subjected to Altered Electrical Activity

A number of methods can be used to visualize individual cells throughout the body of live embryonic, larval or juvenile zebrafish. We show that live fish with fluorescently-marked plasma membranes can be scanned in a confocal laser scanning microscope in order to determine the volume of muscle tissue and the number of muscle fibers present. Efficient approaches for the measurement of cell number and size in live animals over time are described and validated against more arduous segmentation methods. Methods are described that permit the control of muscle electrical, and thus contractile, activity. Loss of skeletal muscle contractile activity greatly reduced muscle growth. In larvae, a protocol is described that allows reintroduction of patterned electrical-evoked contractile activity. The described methods minimize the effect of inter-individual variability and will permit analysis of the effect of electrical, genetic, drug, or environmental stimuli on a variety of cellular and physiological growth parameters in the context of the living organism. Long-term follow-up of the measured effects of a defined early-life intervention on individuals can subsequently be performed.

Optical clarity is a major advantage for cell biological and physiological work in zebrafish. Robust methods for measurement of cell growth in individual animals are described that permit novel insights into how growth of skeletal muscle and neighboring tissues are integrated with whole body growth.

Medição em tempo real e repetida do crescimento muscular esquelético em peixes-zebra vivos individuais submetidos a atividade elétrica alterada

A number of methods can be used to visualize individual cells throughout the body of live embryonic, larval or juvenile zebrafish. We show that live fish ...

Biologia do Desenvolvimento

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

There are many circumstances where it is desirable to obtain the contractile response of skeletal muscle under physiological circumstances: normal circulation, intact whole muscle, at body temperature. This includes the study of contractile responses like posttetanic potentiation, staircase and fatigue. Furthermore, the consequences of disease, disuse, injury, training and drug treatment can be of interest. This video demonstrates appropriate procedures to set up and use this valuable muscle preparation.
To set up this preparation, the animal must be anesthetized, and the medial gastrocnemius muscle is surgically isolated, with the origin intact. Care must be taken to maintain the blood and nerve supplies. A long section of the sciatic nerve is cleared of connective tissue, and severed proximally. All branches of the distal stump that do not innervate the medial gastrocnemius muscle are severed. The distal nerve stump is inserted into a cuff lined with stainless steel stimulating wires. The calcaneus is severed, leaving a small piece of bone still attached to the Achilles tendon. Sonometric crystals and/or electrodes for electromyography can be inserted. Immobilization by metal probes in the femur and tibia prevents movement of the muscle origin. The Achilles tendon is attached to the force transducer and the loosened skin is pulled up at the sides to form a container that is filled with warmed paraffin oil. The oil distributes heat evenly and minimizes evaporative heat loss. A heat lamp is directed on the muscle, and the muscle and rat are allowed to warm up to 37&deg;C. While it is warming, maximal voltage and optimal length can be determined. These are important initial conditions for any experiment on intact whole muscle. The experiment may include determination of standard contractile properties, like the force-frequency relationship, force-length relationship, and force-velocity relationship.
With care in surgical isolation, immobilization of the origin of the muscle and alignment of the muscle-tendon unit with the force transducer, and proper data analysis, high quality measurements can be obtained with this muscle preparation.

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

This video demonstrates the surgical preparation and procedures needed to study the contractile responses of the rat medial gastrocnemius muscle preparation in situ. This preparation allows measurement of skeletal muscle contractile properties under physiological conditions. The animal is anesthetized and the muscle is separated from surrounding tissue at its distal end. The Achilles tendon is attached to a force transducer, allowing measurement of the muscle&#x2019;s contractile response at 37 degrees C with an intact circulation.

Procedimentos para Rat<em&gt; In situ</em&gt; Propriedades contrátil do músculo esquelético

There are many circumstances where it is desirable to obtain the contractile response of skeletal muscle under physiological circumstances: normal ...

Biologia

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, fatigability, and recovery after fatigue can be obtained to assess specific aspects of the excitation-contraction coupling (ECC) process such as excitability, contractile machinery and Ca2+ handling ability. This method removes the nerve and blood supply and focuses on the isolated skeletal muscle itself. We routinely use this method to identify genetic components that alter the contractile property of skeletal muscle though modulating Ca2+ signaling pathways. Here, we describe a newly identified skeletal muscle phenotype, i.e., mechanic alternans, as an example of the various and rich information that can be obtained using the in vitro muscle contractility assay. Combination of this assay with single cell assays, genetic approaches and biochemistry assays can provide important insights into the mechanisms of ECC in skeletal muscle.

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

We describe a method to directly measure muscle force, muscle power, contractile kinetics and fatigability of isolated skeletal muscles in an in vitro system using field stimulation. Valuable information on Ca2+ handling properties and contractile machinery of the muscle can be obtained using different stimulating protocols.

Avaliação ex vivo de Fatigabilidade Contratilidade e Alternans em músculos esqueléticos isolados

 
Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, ...

In Vivo Intracellular Recording of Type-Identified Rat Spinal Motoneurons During Trans-Spinal Direct Current Stimulation

Intracellular recording of spinal motoneurons in vivo provides a &#8220;gold standard&#8221; for determining the cells&#8217; electrophysiological characteristics in the intact spinal network and holds significant advantages relative to classical in vitro or extracellular recording techniques. An advantage of in vivo intracellular recordings is that this method can be performed on adult animals with a fully mature nervous system, and therefore many observed physiological mechanisms can be translated to practical applications. In this methodological paper, we describe this procedure combined with externally applied constant current stimulation, which mimics polarization processes occurring within spinal neuronal networks. Trans-spinal direct current stimulation (tsDCS) is an innovative method increasingly used as a neuromodulatory intervention in rehabilitation after various neurological injuries as well as in sports. The influence of tsDCS on the nervous system remains poorly understood and the physiological mechanisms behind its actions are largely unknown. The application of the tsDCS simultaneously with intracellular recordings enables us to directly observe changes of motoneuron membrane properties and characteristics of rhythmic firing in response to the polarization of the spinal neuronal network, which is crucial for the understanding of tsDCS actions. Moreover, when the presented protocol includes the identification of the motoneuron with respect to an innervated muscle and its function (flexor versus extensor) as well as the physiological type (fast versus slow) it provides an opportunity to selectively investigate the influence of tsDCS on identified components of spinal circuitry, which seem to be differently affected by polarization. The presented procedure focuses on surgical preparation for intracellular recordings and stimulation with an emphasis on the steps which are necessary to achieve preparation stability and reproducibility of results. The details of the methodology of the anodal or cathodal tsDCS application are discussed while paying attention to practical and safety issues.

This protocol describes in vivo intracellular recording of rat lumbar motoneurons with simultaneous trans-spinal direct current stimulation. The method enables us to measure membrane properties and to record rhythmic firing of motoneurons before, during and after anodal or cathodal polarization of the spinal cord.

In Vivo Intracelular Gravação de Motoneurons vertebrais de rato identificados tipo durante estimulação de corrente direta trans-espinhal

Intracellular recording of spinal motoneurons in vivo provides a &#8220;gold standard&#8221; for determining the cells&#8217; electrophysiological ...

Neurociência

Contractility Measurements on Isolated Papillary Muscles for the Investigation of Cardiac Inotropy in Mice

Papillary muscle isolated from adult mouse hearts can be used to study cardiac contractility during different physiological/pathological conditions. The contractile characteristics can be evaluated independently of external influences such as vascular tonus or neurohumoral status. It depicts a scientific approach between single cell measurements with isolated cardiac myocytes and in vivo studies like echocardiography. Thus, papillary muscle preparations serve as an excellent model to study cardiac physiology/pathophysiology and can be used for investigations like the modulation by pharmacological agents or the exploration of transgenic animal models. Here, we describe a method of isolating the murine left anterior papillary muscle to investigate cardiac contractility in an organ bath setup. In contrast to a muscle strip preparation isolated from the ventricular wall, the papillary muscle can be prepared in toto without damaging the muscle tissue severely. The organ bath setup consists of several temperature-controlled, gassed and electrode-equipped organ bath chambers. The isolated papillary muscle is fixed in the organ bath chamber and electrically stimulated. The evoked twitch force is recorded using a pressure transducer and parameters such as twitch force amplitude and twitch kinetics are analyzed. Different experimental protocols can be performed to investigate the calcium- and frequency-dependent contractility as well as dose-response curves of contractile agents such as catecholamines or other pharmaceuticals. Additionally, pathologic conditions like acute ischemia can be simulated.

Murine left ventricular papillary muscle can be used to investigate cardiac contractility in vitro. This article describes in detail the isolation and experimental protocols to study cardiac contractile characteristics.

Medidas de contratilidade no isolado músculos papilares de Investigação de Cardiac inotropia em Ratos

Papillary muscle isolated from adult mouse hearts can be used to study cardiac contractility during different physiological/pathological conditions. The ...

Analysis of Cardiac Contractile Dysfunction and Ca2+ Transients in Rodent Myocytes

Contractile dysfunction and Ca2+ transients are often analyzed at the cellular level as part of a comprehensive assessment of cardiac-induced injury and/or remodeling. One approach for assessing these functional alterations utilizes unloaded shortening and Ca2+ transient analyses in primary adult cardiac myocytes. For this approach, adult myocytes are isolated by collagenase digestion, made Ca2+ tolerant, and then adhered to laminin-coated coverslips, followed by electrical pacing in serum-free media. The general protocol utilizes adult rat cardiac myocytes but can be readily adjusted for primary myocytes from other species. Functional alterations in myocytes from injured hearts can be compared to sham myocytes and/or to in vitro therapeutic treatments. The methodology includes the essential elements needed for myocyte pacing, along with the cell chamber and platform components. The detailed protocol for this approach incorporates the steps for measuring unloaded shortening by sarcomere length detection and cellular Ca2+ transients measured with the ratiometric indicator Fura-2 AM, as well as for raw data analysis.

Analysis of Cardiac Contractile Dysfunction and Ca2+ Transients in Rodent Myocytes

A set of protocols are presented that describe the measurement of contractile function via sarcomere length detection along with calcium (Ca2+) transient measurement in isolated rat myocytes. The application of this approach for studies in animal models of heart failure is also included.

Análise da disfunção contrátil cardíaca e dos transientes de Ca2+ em miócitos de roedores

Contractile dysfunction and Ca2+ transients are often analyzed at the cellular level as part of a comprehensive assessment of cardiac-induced injury ...

Aplicação da estimulação crônica para estudar ratos induzida pela atividade contrátil adaptações fenotípica de músculo esquelético

Resumo

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Um In vivo Modelo de Contração de roedores induzida por lesões e não-invasivos acompanhamento da recuperação

Um modelo murino de treinamento muscular por eletroestimulação neuromuscular

Utilização de microscópicos de silício Cantilevers para avaliar a função celular contrátil

aplicações de

Medição em tempo real e repetida do crescimento muscular esquelético em peixes-zebra vivos individuais submetidos a atividade elétrica alterada

Procedimentos para Rat

Avaliação ex vivo de Fatigabilidade Contratilidade e Alternans em músculos esqueléticos isolados

In Vivo Intracelular Gravação de Motoneurons vertebrais de rato identificados tipo durante estimulação de corrente direta trans-espinhal

Medidas de contratilidade no isolado músculos papilares de Investigação de Cardiac inotropia em Ratos

Análise da disfunção contrátil cardíaca e dos transientes de Ca²⁺ em miócitos de roedores