Este trabalho foi financiado pelo NIH AI099854 e AI126742 a chave.

1. induzir PFV em expressão em e. coli
<ol><li>
Adicionar 1 μL do plasmídeo de expressão IN PFV (10 ng/μL) de 20 μL de Escherichia coli BL21(DE3) pLysS (20 alíquota μL de células disponíveis comercialmente tem > 2 x 106 UFC/μg plasmídeo) em um tubo de 1,5 mL. Misture suavemente pelo dedo tocar ou passar rapidamente o tubo. Incubar em gelo 5 min.
	<ol>
<li>Aqueça o choque por exatamente 30 s em um 42 ˚ c banho de água e em seguida, retornar imediatamente para gelo por 2 min.</li>
		<li>Adicione 80 µ l de caldo super ideal de temperatura com meios de repressão (SOC) catabolite. Incube durante 1 h a 37 ˚ c com 225 rotações por minuto (rpm) a tremer.</li>
		<li>Placa 25 μL da mistura em uma 100 x 15 mm placa de Petri contendo 25 mL de ágar de caldo (LB) de Luria (ágar-ágar LB 1L: 10 g NaCl, extrato de levedura 5 g, 10 g bacto-triptona, ágar 15 g) e 100 μg/mL ampicilina (100 mg/mL de solução).</li>
		<li>Os restantes 75 μL das células transformadas em uma segunda placa idêntica da placa. Incubar as placas com as tampas para baixo durante a noite a 37 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Recuperar as placas de transformada Escherichia coli. Usar uma única colônia para inocular 3 mL de LB (L 1 LB: 10g de bacto-triptona, 10 g de NaCl, 5 g de fermento extrato) suplementado com 100 ampicilina μg/mL em um tubo de polipropileno cultura 14 mL de fundo redondo. Encube por ~ 8 h em 37 ˚ c com 225 rpm a tremer.
	<ol>
<li>Adicione a 3 mL de cultura a 50 mL LB suplementado com 100 μg/mL ampicilina e cloranfenicol 34 μg/mL (34 mg/mL de solução) em um Erlenmeyer de 250 mL. Incube a cultura durante a noite a 37 ° C, com 225 rpm a tremer.</li>
		<li>Transferi o 53 mL da cultura para L 1 LB, 100 μg/mL ampicilina e 34 cloranfenicol μg/mL em um frasco de Erlenmeyer de 4 L. Incube a 37 ° C, com 225 rpm a tremer.</li>
		<li>Medir a densidade óptica em 600 nm (OD600) da cultura periodicamente. Inicialmente, verifica a cultura OD600 cada h. Como a cultura atinge o desejado OD600, verificar a cada 15 min para não overgrow. Cresce a cultura para uma OD600 entre 0,9 e 1,0. Transferir o balão para um banho de gelo e agite para reduzir a temperatura da cultura.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Transferi 1 mL da cultura para um tubo de 1,5 mL para análise posterior por desnaturação análise de SDS-PAGE.
	<ol>
<li>Granule as células no tubo de 1,5 mL por centrifugação por 1 min em uma microcentrífuga a 14.000 x g, à temperatura ambiente. Desprezar o sobrenadante. Resuspenda o pellet em 150 μL tampão fosfato soro fisiológico (PBS), pipetando. O PBS pode ser com ou sem CaCl2 e MgCl2.</li>
		<li>Adicionar 150 μL de tampão de amostra SDS-PAGE de 2x (150 mM Tris-HCl, pH 6,8, SDS de 1,2%, 30% de glicerol, 15% de β-mercaptoetanol (βME), 0,0018% bromofenol) e misture bem por pipeta ou vórtice. Ferva por 3 min. loja a-20 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Adicionar a cultura bacteriana: uma concentração final de 0,25 mM isopropil-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG, solução estoque de 0,25 M) e 50 μM ZnCl2 (solução de 50 milímetros). IPTG induz a expressão do gene PFV IN o promotor T7 e ZnCl2 é adicionado como um suplemento para o dobramento correto de um domínio do dedo de zinco terminal amino em PFV IN. Incubate a cultura, a 25 ° C com agitação imediatamente a 225 rpm para 4 h. transferi o balão para um banho de gelo. Salve 1 mL da cultura para análise de SDS-PAGE, seguindo o mesmo protocolo como acima no ponto 1.3.</li>
	<li>
Transferi a cultura bacteriana para garrafas de centrífuga de tamanho apropriado. Por exemplo, uma cultura de 1L pode ser transferida para quatro garrafas de polipropileno parte inferior cónica estéril descartável 250 mL. Gire as garrafas em uma centrífuga de mesa refrigerada a 3000 x g durante 20 minutos a 4 ˚ c. Descarte os sobrenadantes derramando.
	<ol>
<li>Todas as pelotas de uma cultura bacteriana de 1 L, em um volume total de 25 mL (6,25 mL / frasco) PBS frio (com ou sem CaCl2 e MgCl2) Ressuspender pipetando. Combinar e transferir as suspensões bacterianas para um tubo cónico de 50 mL. Girar numa centrifugadora refrigerada a 3.000 x g por 20 min a 4 ° C. Desprezar o sobrenadante por derramar ou pipetagem.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Resuspenda o pellet bacteriano em 10 mL de tampão de ressuspensão (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 500 mM de NaCl e 500 inibidor da protease phenylmethylsulfanoxide (PMSF) μM) por pipetagem. Snap congelar a pelota, colocando o tubo em um frasco de Dewar com nitrogênio líquido suficiente para submergir o tubo de 50 mL. Cuidadosamente Retire o tubo do nitrogênio líquido e armazene a-80 ° C. Nota: Pelotas bacterianas podem ser armazenadas por vários meses a-80 ° C. Temos visto sem perda de proteína ativa após armazenamento-80 ° C durante dois anos.</li>
	<li>
Análise das amostras de pré- indução e pós-indução por 8,3 cm de largura, 7,3 cm de altura, 0,75 mm espessura SDS-PAGE géis com poliacrilamida 6% de 1,5 mL camada de empilhamento (125 mM Tris-HCl, pH 6,8, persulfato de amónio do acrilamido 6%, 0,1% SDS, 0,1%, 0.001% TEMED) e 3,5 mL 10% poliacrilamida resolvendo camada (375 mM Tris-HCl, pH 8.8, 10% do acrilamido, 0,1% SDS, 0,1% persulfato de amónio, 0,001% TEMED)12.
	<ol>
<li>Depois de derramar o gel de empilhamento, inserir um pente bem 10. Quando o gel tem polimerizado, montar o aparato da página e adicionar suficiente buffer corrente de SDS-PAGE (25 mM Tris, glicina 192mm, 0,1% SDS).</li>
		<li>Carrega 10 μL de cada amostra e 4 μL de padrões da proteína de prestained. Execute a 16.5 V/cm até a frente do corante atinge a parte inferior do gel, aproximadamente 60 min.</li>
		<li>Desmontar as placas de gel e gel de transferência para uma banheira de plástico. Adicione Coomassie brilhante azul coloração solução (0,1% R-250 azul brilhante de Coomassie, 40% de metanol, ácido acético a 10%) generosamente cobrir o gel e mancha por 20 min à temperatura ambiente.</li>
		<li>Remover a solução de coloração derramando e substituir com destain solução (40% de metanol, ácido acético a 10%) até bandas são facilmente visíveis. Remover a solução de descoloração derramando e substituir com água desionizada. PFV IN devem ser facilmente identificado na amostra pós-indução. PFV em com um tag de hexahistidine tem um peso molecular de 47374 Da.</li>
		<li>Se em PFV não estiver visível, repita a indução, começando com uma colônia diferente de uma das placas de transformação.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. níquel cromatografia de afinidade
<ol><li>Descongele uma pelota bacteriana no gelo. Nota: Isso levará um tempo significativo (aproximadamente 2-3h). Quando a pelota descongelou para uma suspensão de células, adicione um adicional de 500 μM PMSF (solução estoque de 100 mM).</li>
	<li>Mantenha o tubo de 50 mL de bactérias chorume no gelo. Proceda à sonicação as bactérias em amplitude de 30% para 30 s (1 s na, 1 s fora) por pelota derivada da cultura de 1 L, usando um sonicador com um chifre de bio 0,5 polegada de diâmetro com um diâmetro de 0,125 polegada afilado microtip, uma frequência de 20 kHz e potência máxima de 400 w.</li>
	<li>Transferi a amostra de células para um tubo frio se. Use o policarbonato garrafa assemblies (25 mm de diâmetro, altura de 89 mm) compatíveis com um rotor de ângulo fixo tipo 60 de Ti. Rotores e tubos alternativos podem ser utilizados se a mesma força de gravitação é alcançada. Girar a 120.000 x g, durante 60 min a 4 ° C. Deve haver um pellet óbvio. O sobrenadante pode ter uma cor amarela.</li>
	<li>Transferi o sobrenadante por derramar ou Pipetar para um tubo cônico de frio 50 mL. Nota o volume; Este volume deve ser aproximadamente o volume de ressuspensão buffer usado antes da congelação de snap. Se o sobrenadante é viscoso, podem estar contaminado por ADN bacteriano que pode obstruir a coluna de cromatografia. Neste caso, repita a ultracentrifugação para o DNA bacteriano de Pelotas.</li>
	<li>
Preparar 500 mL Buffer uma (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 500 mM de NaCl, 500 μM PMSF) e 500 mL Buffer B (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 500 mM de NaCl, 500 μM PMSF, imidazol 200 mM). Nota: No presente protocolo, manter o sistema de cromatografia líquida (FPLC) proteína rápida, todos os buffers e a amostra a 4 ° C, em uma sala fria.<ol>
<li>Buffers de filtro estéril A e B com 0,2 μm unidades de filtro descartável. Dependendo do sistema FPLC, lave bomba A e B de bomba com tampão A e B do Buffer, respectivamente. B de Buffer de fluxo 90% A de Buffer e 10% através do sistema até estabilizar a condutividade e leituras de UV. A taxa de fluxo máxima vai depender do instrumento; Use uma taxa de fluxo de 5 mL/min com um limite de pressão máxima de 1,0 MPa.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparar uma 110 mm, 5 mm diâmetro FPLC coluna com resina de níquel-cobrado 1,5 mL (capacidade de ligação máxima 50 mg/mL, máximo 1 MPa de pressão). A coluna pode ser preparada no dia antes da purificação e armazenada a 4 ˚ c.</li>
	<li>A coluna Conecte o instrumento FPLC. Equilibrar a coluna com 20 mL de 90% A de Buffer e 10% B Buffer (imidazol 20mm) a uma taxa de fluxo de 0,5 mL/min, com um limite de pressão máxima de 0,5 MPa. O instrumento deve estar coletando dados em tempo real de condutividade e absorção UV em 280 nm (280). A condutividade e leituras de UV devem estabilizar. Se estas leituras não tem estabilizado, continue a buffers de fluxo através da coluna até que estejam estáveis.</li>
	<li>
Carrega a amostra de proteínas (~ 10 mL por pelota) para a coluna em uma taxa de fluxo de 0,15 mL/min, com um limite de pressão máxima de 0,5 MPa. A pressão de coluna e a taxa de fluxo permanece a mesma em toda a purificação. Colete o fluxo através de um tubo de 50 mL.
	<ol>
<li>Lavar a coluna com 20 mL de 90% A de Buffer e 10% Buffer B. coletar a lavagem em um tubo de 50 mL. Eluir as proteínas com um gradiente linear de 20 mL de 10% a 100% B Buffer (20 mM para imidazole 200 mM).</li>
		<li>Finalmente, lave a coluna com 5 mL 100% B Buffer (imidazol 200 mM). Recolher a lavagem final e gradiente em frações de 0,27 mL.
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Aliam 15 μL de tampão de amostra SDS-PAGE 2 x 15 μL do fluxo através de lavagem e pico A280 fracções. Ferva as amostras por 3 min.
	<ol>
<li>Prepare dois 10% gel de SDS-PAGE, conforme descrito anteriormente na etapa 1.6 exceto com 15 pentes bem. Carrega 10 μL de cada amostra para os géis e 4 μL de padrões da proteína de prestained. Executar, manchar e analisar os geles, conforme descrito na etapa 1.6.</li>
		<li>Fracções de combinar que parecem conter quase puro PFV IN baseiam na inspeção visual. Medir o volume de pipetagem, normalmente de 8 a 10 mL.</li>
		<li>Usando um spectrophotometer, medir a um280 das frações combinadas e calcular a quantidade total de proteínas em PFV; nosso rendimento típico é ~ 10 mg / L de cultura induzida. O coeficiente de extinção da PFV IN com a tag hexahistidine é 59360 cm-1 M-1.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para remover a marca de hexahistidine, suplemento PFV IN com 10 mM ditiotreitol (DTT, solução estoque de 1 M) e 0,1 mM EDTA, pH 8.0 (solução 0,5 M). Adicione 15 μg de protease de 3C rinovírus humano (VFC) por mg PFV IN. Incubate no 4 ˚ c durante a noite. Clivagem reduz o peso molecular PFV IN de 47374 para Da 44394 e pode ser verificada pela análise de SDS-PAGE 10%.</li>
</ol>3. cromatografia de afinidade heparina
<ol><li>
Preparar 250 mL Buffer C (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM DTT, 0,1 mM de EDTA e 500 μM PMSF) e 250 mL de tampão D (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM DTT, 0,1 mM EDTA, 500 μM PMSF, 1 M NaCl). Nota: Este protocolo, o sistema FPLC, buffers e amostra são mantidos em uma sala fria no 4 ˚ c.<ol>
<li>Filtro estéril Buffers C e D com 0,2 μm unidades de filtro descartável. Dependendo do sistema FPLC, lave bomba A e B de bomba com Buffer C e D do Buffer, respectivamente. Fluxo de Buffer C 80% e 20% D reserva através do sistema até estabilizar a condutividade e leituras de UV. A taxa de fluxo máxima vai depender do instrumento; rotineiramente usamos uma taxa de fluxo de 5 mL/min, com um limite de pressão máxima de 1,0 MPa.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Prepare uma 80 mm, 5 mm diâmetro FPLC de coluna com 1 mL de resina sepharose de heparina (máxima capacidade de ligação 2,0 mg de bovinos antitrombina III / mL da resina; 1,4 MPa de pressão máxima). A coluna pode ser preparada no dia antes da purificação e armazenada a 4 ° C. A coluna Conecte o instrumento FPLC.
	<ol>
<li>Equilibrar a coluna com 20 mL de tampão C de 80% e 20% D Buffer (200 mM NaCl) a uma taxa de fluxo de 0,5 mL/min, com um limite de pressão máxima de 1 MPa. O instrumento deve estar coletando dados em tempo real de condutividade e absorção UV em 280 nm (280). A condutividade e leituras de UV devem estabilizar. Se estas leituras não tem estabilizado, continue a buffers de fluxo através da coluna até que estejam estáveis.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Reduzir a concentração de NaCl de amostra PFV em 200mm adicionando 1,5 volumes Buffer C. Por exemplo, adicionar 15 mL de tampão C para 10 mL PFV IN. Nosso volume total é tipicamente ~ 25 mL.</li>
	<li>
A amostra em PFV diluída à coluna de sepharose heparina em taxa de fluxo de 0,5 mL/min com pressão máxima de carga limite 1,0 MPa. A pressão de coluna e a taxa de fluxo permanece a mesma em toda a purificação. Colete o fluxo através de um tubo cónico de 50 mL.
	<ol>
<li>Lavar a coluna com 20 mL de tampão C de 80% e 20% D Buffer (200 mM NaCl), coletando a lavagem em um tubo cónico de 50 mL. Eluir a coluna com um gradiente linear de 30 mL de 20% a 100% D Buffer (200 mM a 1 M NaCl).</li>
		<li>Lave a coluna com 5 mL de 100% Buffer D. coletar o gradiente e lavagem final em frações de 0,37 mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Analisar o fluxo através de carga, lavagem e frações em 8% SDS-PAGE, conforme descrito em 2.9. PFV em clivagem da hexahistidine marca a seguir tem um peso molecular de 44394 Da e o coeficiente de extinção permanece 59360 cm-1 M-1 sem a marca de hexahistidine. Armazene todas as frações no 4 ˚ c até a conclusão de um ensaio de nuclease.</li>
</ol>4. ensaio de nuclease
<ol><li>
Identificar frações de sepharose heparina que parecem conter quase puro PFV pol. combinar 3 μL de fração de heparina e 50 ng de 3KB supercoiled Plasmídeo em reação buffer (10 mM HEPES, pH 7,5, 110 mM de NaCl, 5 mM de MgSO4, 4 μM ZnCl2 10 mM DTT) com um volume final de 15 µ l. Incubar a 37 ˚ c por 90 min. incluir um controle negativo com nenhum PFV IN.
	<ol>
<li>Parar a reação com 1 mg/mL da protease K (20 mg/mL de solução) e 0,5% SDS (solução a 10% das ações). Incube a 37 ° C por 1 h. amostras podem ser armazenadas a-20 ° C para posterior análise.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Prepare um gel de 125 mL de 1% peso por volume (p/v) de agarose em 1 x TAE buffer (40 mM Tris-Acetato, 1 mM EDTA) com 0,1 µ g/mL ethidium bromide (10 mg/mL de solução)13. Derreter a solução de agarose e despeje para uma bandeja de fundição de gel 15 cm x 10 cm. Inserir um pente bem 15 com ampla, poços de espessura 0,75 mm 5 mm. Poços finos rendem melhor resolução de banda, em comparação com poços de espessura de 1,5 mm. Permitir que o gel solidificar à temperatura ambiente.
	<ol>
<li>Imergir o gel em 1 x TAE com brometo de etídio 0,1 µ g/mL. Adicione 3,5 μL de 6 x Tintura (50% de glicerol, tintura de laranja G 0,15%) de carregamento para as reações de ensaio de nuclease. Carrega todo o volume para o gel. Funcione o gel em constante tensão, 10 volts por centímetro (100 V) à temperatura ambiente durante 1 h ou até a frente de corante laranja G chega ao fim do gel.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
O gel de agarose imediatamente da imagem com um scanner fluorescente definido para detectar o brometo de etídio. DNA linear deve ser executado fiel tamanho em kb 3, DNA supercoiled deve correr mais rápido (~ 2 kb) e círculo relaxado DNA deve executar mais lento (~3.5 kb).
	<ol>
<li>Usando o software de análise de imagem, calcule o volume de pixel do plasmídeo círculo supercoiled, linear e relaxado em cada raia. Chame a soma do pixel volumes para estas três formas de DNA, o DNA"total" de valor e usá-lo para calcular a percentagem de círculos lineares e relaxados. Por exemplo, o volume de pixel de círculos relaxados é dividido pelo valor de pixel de DNA total na lane, multiplique esse número por 100, para determinar uma porcentagem. Frações que contêm contaminante nuclease exibem um percentual maior de círculos lineares e descontraídos, em comparação com o controle negativo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Combine a frações de sepharose heparina que não exibem atividade de nuclease contaminante. Urinar em 10 mm, 6-8 kDa peso molecular corte (MWCO) tubulação da diálise em 4 ° C durante a noite contra 1 L de 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 200 mM NaCl, 50 μM ZnCl2, 10 mM DTT, 20% de glicerol.</li>
	<li>Recupere a amostra PFV IN livre de nuclease da tubulação da diálise. Medir a um280 e calcular a concentração de proteína final. Alíquota e snap freeze em nitrogênio líquido. Alíquotas de loja a-80 ° C.</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Proteínas recombinantes que interagem com o DNA, tais como proteínas, catadores de oxigênio para aplicações de microscopia única molécula ou integrases retroviral, de reparação do DNA devem ser livres de contaminação bacteriana nucleases2,3. Estes contaminantes podem confundir a interpretação dos resultados durante os ensaios bioquímicos ou única molécula de granel.
Achamos que uma nuclease bacteriana frequentemente co ...

Estudos bioquímicos e única molécula de interações da proteína com DNA requerem proteínas recombinantes excepcionalmente puras. Contaminar as nucleases de bactérias pode obscurecer os resultados desses ensaios. Um contaminante nuclease foi encontrado em preparações à base de proteínas recombinantes oxigênio ao tesouro protocatechuate-3,4-dioxigenase (PCD) e protótipo vírus espumoso (PFV) integrase (IN) isolados de Escherichia coli (e. coli)1 , 2 , 3.
Ensaios de integração retroviral dependem a conversão de DNA supercoiled produtos entalhadas ou lineares como uma medida da atividade4. Durante a infecção celular IN junta-se as duas extremidades do cDNA viral para o anfitrião cromatina5. Cada participante se juntar a reação é denominado transferência de vertente. Ensaios de recombinação na atividade posso juntar dois oligómeros de DNA imitar o cDNA viral termina para um destino de DNA em uma integração concertada reação4,5,6,7,8. Alternativamente IN recombinante pode aderir apenas um final de DNA em um site não-fisiologicamente relevante metade integração reação9,10. Quando supercoiled Plasmídeo é alvo de integração, integração concertada produtos são linearizadas DNA e produtos de integração local metade são círculos relaxados. Estes produtos de reação são identificados por sua mobilidade relativa durante de eletroforese de gel de agarose1. Se o recombinante em tem uma contaminante nuclease, haverá círculos relaxados espúrios ou um plasmídeo linear possivelmente confundir os resultados experimentais. Oligómeros de DNA virais podem ser rotulados fluorescente para identificar conclusivamente produtos de integração, ao contrário de produtos da nuclease. No entanto, em muito favorece supercoiled alvos do DNA; qualquer perda do plasmídeo supercoiled círculos relaxados ou DNA linear por nucleases contaminantes poderia distorcer os resultados e interpretação de dados11. Assim, é imperativo para remover bacterianas nucleases de retroviral em preparações.
PFV em tem uma diferente afinidade para heparina sepharose comparado ao de nuclease bacteriana1. PFV IN e a nuclease podem estar separadas por uma eluição gradiente linear de heparina-sepharose. A nuclease não é facilmente detectado por uma absorvância (UV) ultravioleta no pico de nm 280 ou por eletroforese em gel de poliacrilamida analítica de sódio Dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE). Em vez disso, a nuclease é detectado por um ensaio de atividade nuclease empregando a conversão de um plasmídeo supercoiled círculos relaxados ou produtos lineares. Cada fração após cromatografia de sepharose heparina é testada para a atividade de nuclease. PFV IN e a contaminação de nuclease não tem nenhuma diferença na afinidade para resina de ânion Mono-Q. Há uma pequena diferença na afinidade para resina de cátion Mono-S. No entanto, a resolução de Mono-S de nuclease bacteriana e em PFV não permitiria eficiente separação das proteínas. Em última análise, purificação da afinidade de sepharose heparina oferece a melhor separação de nuclease bacteriana de PFV IN... e tem a vantagem do volume de carga ilimitada.
Teste para contaminar a atividade de nuclease pode ser adaptada a outras proteínas. A proteína de interesse provavelmente terá características de afinidade alternativos que PFV IN; a diferença de vinculação características da proteína de interesse e a contaminação de nuclease deve ser determinada empiricamente. Esta metodologia para identificar contaminação nuclease pode ser adaptada para outras resinas incluindo cátion Mono-S ou resinas de troca de ânion Mono-Q. Afinidade e troca iônica resinas podem oferecer um método confiável para isolar uma proteína recombinante do interesse de contaminar nucleases sem limites no volume de proteína durante a cromatografia.

<table><tbody><tr><td>BL21/DE3 Rosetta E. coli</td><td>EMD Millipore</td><td>70956-4</td><td></td></tr><tr><td>LB broth</td><td>EMD biosciences</td><td>1.10285.0500</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Amresco</td><td>0339</td><td></td></tr><tr><td>Chloramphenicol&amp;nbsp;</td><td>Amresco</td><td>0230</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>IPTG&amp;nbsp;</td><td>Denville Scientific</td><td>CI8280</td><td></td></tr><tr><td>ZnCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>208086</td><td></td></tr><tr><td>Tris Ultra Pure</td><td>Gojira Fine Chemicals</td><td>UTS1003</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>P212121</td><td>RP-S23020</td><td></td></tr><tr><td>PMSF&amp;nbsp;</td><td>Amresco</td><td>0754</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0250</td><td></td></tr><tr><td>DTT&amp;nbsp;</td><td>P212121</td><td>SV-DTT</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure EDTA</td><td>Invitrogen/Gibco</td><td>15575</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Amresco</td><td>0662</td><td></td></tr><tr><td>Agarose&amp;nbsp;</td><td>Denville Scientific</td><td>CA3510</td><td></td></tr><tr><td>Ethidium bromide</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP1302</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>G37-20</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA Superflow</td><td>Qiagen</td><td>30430</td><td></td></tr><tr><td>Heparin Sepharose 6 Fast Flow</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-0998-01</td><td></td></tr><tr><td>HRV14 3C protease&amp;nbsp;</td><td>EMD Chemicals</td><td>71493-3</td><td></td></tr></tbody></table>

detection and removal of nuclease contamination during purification of recombinant prototype foamy virus integrase

A proteína integrase (IN) do vírus espumoso da retrovírus protótipo (PFV) é uma enzima de modelo para o estudo do mecanismo de integração retroviral. Comparado a pol de outros retrovírus, PFV IN é mais solúvel e mais receptivos a manipulação experimental. Além disso, é sensível a inibidores de IN clinicamente relevantes vírus de imunodeficiência humana (HIV-1), sugerindo que o mecanismo catalítico da PFV IN é semelhante do HIV-1 IN. IN catalisa juntarem covalente viral DNA complementar (cDNA) para o alvo DNA em um processo chamado transferência de vertente. Esta reação de transferência de vertente apresenta cortes de ADN do alvo. Análise dos produtos de reacção de integração pode ser confundida pela presença de nucleases que nick da mesma forma o DNA. Uma nuclease bacteriana foi mostrado para purificar co com PFV recombinante expressa em Escherichia coli (e. coli). Aqui nós descrevemos um método para isolar PFV IN das nucleases contaminantes por cromatografia de afinidade de heparina. Frações são facilmente rastreadas por contaminação de nuclease com um plasmídeo supercoiled e eletroforese em gel de agarose. PFV IN e o contaminante nuclease exibem afinidades alternativas para heparina sepharose permitindo uma preparação livre de nuclease da recombinação PFV IN adequado para análise de bioquímica ou única molécula em massa de integração.

Recombinante PFV em muitas vezes está contaminado com uma nuclease bacteriana1. Ensaios bioquímicos integração dependem a quantificação da conversão do plasmídeo supercoiled DNA para círculos relaxados e produtos lineares. A presença de uma contaminante nuclease poderia levar a quantificação espúria destes ensaios. Expressão da PFV IN com um tag de hexahistidine é induzida em e. coli (Figura 1) e primeiro purificado por cromatografia de afinida...

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Detection and Removal of Nuclease Contamination During Purification of Recombinant Prototype Foamy Virus Integrase

Proteína de integrase espumosa vírus recombinante protótipo é frequentemente contaminada com uma nuclease bacteriana durante a purificação. Este método identifica a contaminação da nuclease e remove-lo a preparação final da enzima.

Deteção e remoção de contaminação de Nuclease durante a purificação do protótipo recombinante vírus espumoso Integrase

The integrase (IN) protein of the retrovirus prototype foamy virus (PFV) is a model enzyme for studying the mechanism of retroviral integration. Compared ...

detection-removal-nuclease-contamination-during-purification

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

7.1K visualizações.  The Ohio State University College of Medicine. Proteína de integrase espumosa vírus recombinante protótipo é frequentemente contaminada com uma nuclease bacteriana durante a purificação. Este método identifica a contaminação da nuclease e remove-lo a preparação final da enzima.

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Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the single-stranded genome is encapsidated by the nucleoprotein (NP), and associated with the trimeric polymerase complex consisting of the PA, PB1, and PB2 subunits. However, in contrast to most RNA viruses, influenza viruses perform viral RNA synthesis in the nuclei of infected cells. Interestingly, viral mRNA synthesis uses cellular pre-mRNAs as primers, and it has been proposed that this process takes place on chromatin1. Interactions between the viral polymerase and the host RNA polymerase II, as well as between NP and host nucleosomes have also been characterized1,2.
Recently, the generation of recombinant influenza viruses encoding a One-Strep-Tag genetically fused to the C-terminus of the PB2 subunit of the viral polymerase (rWSN-PB2-Strep3) has been described. These recombinant viruses allow the purification of PB2-containing complexes, including vRNPs, from infected cells. To obtain purified vRNPs, cell cultures are infected, and vRNPs are affinity purified from lysates derived from these cells. However, the lysis procedures used to date have been based on one-step detergent lysis, which, despite the presence of a general nuclease, often extract chromatin-bound material only inefficiently. 
Our preliminary work suggested that a large portion of nuclear vRNPs were not extracted during traditional cell lysis, and therefore could not be affinity purified. To increase this extraction efficiency, and to separate chromatin-bound from non-chromatin-bound nuclear vRNPs, we adapted a step-wise subcellular extraction protocol to influenza virus-infected cells. Briefly, this procedure first separates the nuclei from the cell and then extracts soluble nuclear proteins (here termed the "nucleoplasmic" fraction). The remaining insoluble nuclear material is then digested with Benzonase, an unspecific DNA/RNA nuclease, followed by two salt extraction steps: first using 150 mM NaCl (termed "ch150"), then 500 mM NaCl ("ch500") (Fig. 1). These salt extraction steps were chosen based on our observation that 500 mM NaCl was sufficient to solubilize over 85% of nuclear vRNPs yet still allow binding of tagged vRNPs to the affinity matrix.
After subcellular fractionation of infected cells, it is possible to affinity purify PB2-tagged vRNPs from each individual fraction and analyze their protein and RNA components using Western Blot and primer extension, respectively. Recently, we utilized this method to discover that vRNP export complexes form during late points after infection on the chromatin fraction extracted with 500 mM NaCl (ch500)3.

Influenza viruses replicate their RNA genome in association with host-cell chromatin. Here, we present a method to purify intact viral ribonucleoprotein complexes from the chromatin of infected cells. Purified viral complexes can be analyzed by both Western blot and primer extension of protein and RNA content, respectively.

Purificação por afinidade de Complexos de Influenza Virus ribonucleoproteína da cromatina de células infectadas

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the ...

Imunologia e Infecção

Multi-target Parallel Processing Approach for Gene-to-structure Determination of the Influenza Polymerase PB2 Subunit

Pandemic outbreaks of highly virulent influenza strains can cause widespread morbidity and mortality in human populations worldwide. In the United States alone, an average of 41,400 deaths and 1.86 million hospitalizations are caused by influenza virus infection each year 1. Point mutations in the polymerase basic protein 2 subunit (PB2) have been linked to the adaptation of the viral infection in humans 2. Findings from such studies have revealed the biological significance of PB2 as a virulence factor, thus highlighting its potential as an antiviral drug target.
The structural genomics program put forth by the National Institute of Allergy and Infectious Disease (NIAID) provides funding to Emerald Bio and three other Pacific Northwest institutions that together make up the Seattle Structural Genomics Center for Infectious Disease (SSGCID). The SSGCID is dedicated to providing the scientific community with three-dimensional protein structures of NIAID category A-C pathogens. Making such structural information available to the scientific community serves to accelerate structure-based drug design.
Structure-based drug design plays an important role in drug development. Pursuing multiple targets in parallel greatly increases the chance of success for new lead discovery by targeting a pathway or an entire protein family. Emerald Bio has developed a high-throughput, multi-target parallel processing pipeline (MTPP) for gene-to-structure determination to support the consortium. Here we describe the protocols used to determine the structure of the PB2 subunit from four different influenza A strains.

Structure-based drug design plays an important role in drug development. Pursuing multiple targets in parallel greatly increases the chance of success for lead discovery. The following article highlights how the Seattle Structural Genomics Center for Infectious Disease utilizes a multi-target approach for gene-to-structure determination of the PB2 influenza A subunit.

Abordagem de processamento paralelo multi-alvo para Gene-a-estrutura Determinação da polimerase da gripe PB2 Subunidade

Pandemic outbreaks of highly virulent influenza strains can cause widespread morbidity and mortality in human populations worldwide. In the United States ...

Purification and Visualization of Influenza A Viral Ribonucleoprotein Complexes

The influenza A viral genome consists of eight negative-sense, single stranded RNA molecules, individually packed with multiple copies of the influenza A nucleoprotein (NP) into viral ribonulceoprotein particles (vRNPs). The influenza vRNPs are enclosed within the viral envelope. During cell entry, however, these vRNP complexes are released into the cytoplasm, where they gain access to the host nuclear transport machinery. In order to study the nuclear import of influenza vRNPs and the replication of the influenza genome, it is useful to work with isolated vRNPs so that other components of the virus do not interfere with these processes. Here, we describe a procedure to purify these vRNPs from the influenza A virus. The procedure starts with the disruption of the influenza A virion with detergents in order to release the vRNP complexes from the enveloped virion. The vRNPs are then separated from the other components of the influenza A virion on a 33-70% discontinuous glycerol gradient by velocity sedimentation. The fractions obtained from the glycerol gradient are then analyzed on via SDS-PAGE after staining with Coomassie blue. The peak fractions containing NP are then pooled together and concentrated by centrifugation. After concentration, the integrity of the vRNPs is verified by visualization of the vRNPs by transmission electron microscopy after negative staining. The glycerol gradient purification is a modification of that from Kemler et al. (1994)1, and the negative staining has been performed by Wu et al. (2007).2

The genome of the influenza A virus consists of eight separate complexes of RNA and proteins, termed viral ribonucleoprotein complexes (vRNPs). This paper describes the glycerol gradient purification and transmission electron microscopy visualization of influenza A vRNPs.

Purificação e Visualização de Influenza A complexos de ribonucleoproteínas Viral

The influenza A viral genome consists of eight negative-sense, single stranded RNA molecules, individually packed with multiple copies of the influenza A ...

Biologia

InSET: A Novel Tool for Unbiased Genome-Wide Functional Element Discovery

Identification of Functionally-Relevant Lentivirus Integration Sites in an Insertional Mutagenesis Cell Library

The extent of functional sequences within the human genome is a pivotal yet debated topic in biology. Although high-throughput reverse genetic screens have made strides in exploring this, they often limit their scope to known genomic elements and may introduce non-specific effects. This underscores the urgent need for novel functional genomics tools that enable a deeper, unbiased understanding of genome functionality. This protocol introduces the Insertion-based Screen for functional Elements and Transcripts (InSET), a method for identifying lentivirus integration sites within a lentivirus-based insertional mutagenesis cell library. InSET facilitates the capture of genome-wide lentiviral integration sites, with next-generation sequencing used to detect and quantify flanking sequences. InSET's design enables the analysis of integration site abundance variations in phenotypic screens on a large scale, establishing it as a robust tool for forward genetics and for identifying functional genomic elements. A key benefit of InSET is its capacity to reveal previously unidentified genomic elements, including novel functional exons of both protein-coding and non-coding RNAs, independent of prior annotation. Overall, InSET holds significant value in studying the intricate complexity of the human genome and transcriptome, where many genomic elements await functional characterization.

Insertional mutagenesis is an essential tool in forward genetics for identifying functional genomic elements. Here, we describe the Insertion-based Screen for functional Elements and Transcripts (InSET), a method for detecting lentivirus integration sites within a lentivirus-based insertional mutagenesis cell library.

The extent of functional sequences within the human genome is a pivotal yet debated topic in biology. Although high-throughput reverse genetic screens ...

Genética

Isolation of Viral Replication Compartment-enriched Sub-nuclear Fractions from Adenovirus-infected Normal Human Cells

During infection of human cells by adenovirus (Ad), the host cell nucleus is dramatically reorganized, leading to formation of nuclear microenvironments through the recruitment of viral and cellular proteins to sites occupied by the viral genome. These sites, called replication compartments (RC), can be considered viral-induced nuclear domains where the viral genome is localized and viral and cellular proteins that participate in replication, transcription and post-transcriptional processing are recruited. Moreover, cellular proteins involved in the antiviral response, such as tumor suppressor proteins, DNA damage response (DDR) components and innate immune response factors are also co-opted to RC. Although RC seem to play a crucial role to promote an efficient and productive replication cycle, a detailed analysis of their composition and associated activities has not been made. To facilitate the study of adenoviral RC and potentially those from other DNA viruses that replicate in the cell nucleus, we adapted a simple procedure based on velocity gradients to isolate Ad RC and established a cell-free system amenable to conduct morphological, functional and compositional studies of these virus-induced subnuclear structures, as well as to study their impact on host-cell interactions.

We provide a novel strategy to isolate viral replication compartments (RC) from adenovirus (Ad)-infected human cells. This approach represents a cell-free system that can help to elucidate the molecular mechanisms regulating viral genome replication and expression as well as regulation of viral-host interactions established at the RC.

Isolamento de Frações Sub-nuclear Viral Replication Compartimento enriquecidas de Adenovirus-infectados células normais Humanos

During infection of human cells by adenovirus (Ad), the host cell nucleus is dramatically reorganized, leading to formation of nuclear microenvironments ...

Purification of Viral DNA for the Identification of Associated Viral and Cellular Proteins

The goal of this protocol is to isolate herpes simplex virus type 1 (HSV-1) DNA from infected cells for the identification of associated viral and cellular proteins by mass spectrometry. Although proteins that interact with viral genomes play major roles in determining the outcome of infection, a comprehensive analysis of viral genome associated proteins was not previously feasible. Here we demonstrate a method that enables the direct purification of HSV-1 genomes from infected cells. Replicating viral DNA is selectively labeled with modified nucleotides that contain an alkyne functional group. Labeled DNA is then specifically and irreversibly tagged via the covalent attachment of biotin azide via a copper(I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition or click reaction. Biotin-tagged DNA is purified on streptavidin-coated beads and associated proteins are eluted and identified by mass spectrometry. This method enables the selective targeting and isolation of HSV-1 replication forks or whole genomes from complex biological environments. Furthermore, adaptation of this approach will allow for the investigation of various aspects of herpesviral infection, as well as the examination of the genomes of other DNA viruses.

The goal of this protocol is to specifically tag and selectively isolate viral DNA from infected cells for the characterization of viral genome associated proteins.

Purificação de DNA Viral para a identificação de proteínas Viral e celulares associadas

The goal of this protocol is to isolate herpes simplex virus type 1 (HSV-1) DNA from infected cells for the identification of associated viral and ...

Assembly and Purification of Prototype Foamy Virus Intasomes

A defining feature and necessary step of the retrovirus life cycle is the integration of the viral genome into the host genome. All retroviruses encode an integrase (IN) enzyme that catalyzes the covalent joining of viral to host DNA, which is known as strand transfer. Integration may be modeled in vitro with recombinant retroviral IN and DNA oligomers mimicking the ends of the viral genome. In order to more closely recapitulate the integration reaction that occurs in vivo, integration complexes are assembled from recombinant IN and synthetic oligomers by dialysis in a reduced salt concentration buffer. The integration complex, called an intasome, may be purified by size exclusion chromatography. In the case of prototype foamy virus (PFV), the intasome is a tetramer of IN and two DNA oligomers and is readily separated from monomeric IN and free oligomer DNA. The integration efficiency of PFV intasomes may be assayed under a variety of experimental conditions to better understand the dynamics and mechanics of retroviral integration.

Recombinant retroviral integrase and DNA oligomers mimicking viral DNA ends can form an enzymatically active complex known as an intasome. Intasomes may be used for biochemical, structural, and kinetic studies. This protocol details how to assemble and purify prototype foamy virus intasomes.

Montagem e purificação do protótipo vírus espumoso Intasomes

A defining feature and necessary step of the retrovirus life cycle is the integration of the viral genome into the host genome. All retroviruses encode an ...

Detection of Low Copy Number Integrated Viral DNA Formed by In Vitro Hepatitis B Infection

Hepatitis B Virus (HBV) is a common blood-borne pathogen causing liver cancer and liver cirrhosis resulting from chronic infection. The virus generally replicates through an episomal DNA intermediate; however, integration of HBV DNA fragments into the host genome has been observed, even though this form is not necessary for viral replication. The exact purpose, timing, and mechanism(s) by which HBV DNA integration occurs is not yet clear, but recent data show that it occurs very early after infection. Here, the in vitro generation and detection of HBV DNA integrations are described in detail. Our protocol specifically amplifies single copies of virus-cell DNA integrations and allows both absolute quantification and single-base pair resolution of the junction sequence. This technique has been applied to various HBV-susceptible cell types (including primary human hepatocytes), to various HBV mutants, and in conjunction with various drug exposures. We foresee this technique becoming a key assay to determine the underlying molecular mechanisms of this clinically relevant phenomenon.

Detection of Low Copy Number Integrated Viral DNA Formed by In Vitro Hepatitis B Infection

We describe here the in vitro generation of HBV DNA via a Hepatitis B virus infection system and the highly sensitive detection of its (1&#8211;2 copies) integration using inverse nested PCR.

Deteção de cópia baixa número de DNA Viral integrado formado por In Vitro infecção de hepatite B

Hepatitis B Virus (HBV) is a common blood-borne pathogen causing liver cancer and liver cirrhosis resulting from chronic infection. The virus generally ...

Purificação de vetores AAV por cromatografia de afinidade de heparina de etapa única

Isolation of Adeno-Associated Viral Vectors Through a Single-Step and Semi-Automated Heparin Affinity Chromatography Protocol

Adeno-associated virus (AAV) has become an increasingly valuable vector for in vivo gene delivery and is currently undergoing human clinical trials. However, the commonly used methods to purify AAVs make use of cesium chloride or iodixanol density gradient ultracentrifugation. Despite their advantages, these methods are time-consuming, have limited scalability, and often result in vectors with low purity. To overcome these constraints, researchers are turning their attention to chromatography techniques. Here, we present an optimized heparin-based affinity chromatography protocol that serves as a universal capture step for the purification of AAVs.
This method relies on the intrinsic affinity of AAV serotype 2 (AAV2) for heparan sulfate proteoglycans. Specifically, the protocol entails the co-transfection of plasmids encoding the desired AAV capsid proteins with those of AAV2, yielding mosaic AAV vectors that combine the properties of both parental serotypes. Briefly, after the lysis of producer cells, a mixture containing AAV particles is directly purified following an optimized single-step heparin affinity chromatography protocol using a standard fast protein liquid chromatography (FPLC) system. Purified AAV particles are subsequently concentrated and subjected to comprehensive characterization in terms of purity and biological activity. This protocol offers a simplified and scalable approach that can be performed without the need for ultracentrifugation and gradients, yielding clean and high viral titers.

Autor em destaque: Método aprimorado para produção e purificação de vetores virais adeno-associados

This manuscript describes a detailed protocol for the generation and purification of adeno-associated viral vectors using an optimized heparin-based affinity chromatography method. It presents a simple, scalable, and cost-effective approach, eliminating the need for ultracentrifugation. The resulting vectors exhibit high purity and biological activity, proving their value in preclinical studies.

Isolamento de vetores virais adeno-associados por meio de um protocolo de cromatografia de afinidade de heparina de etapa única e semiautomatizada

Adeno-associated virus (AAV) has become an increasingly valuable vector for in vivo gene delivery and is currently undergoing human clinical trials. ...

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Resumo

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Isolamento de vetores virais adeno-associados por meio de um protocolo de cromatografia de afinidade de heparina de etapa única e semiautomatizada

Isolamento de vetores virais adeno-associados por meio de um protocolo de cromatografia de afinidade de heparina de etapa única e semiautomatizada