Agradecemos Jonatan Lucas pela sua assistência técnica com a cultura de pilha do alimentador, serviço Estabulari de la UAB para cuidados com animais e Domènec Martín para gravar o vídeo. Este trabalho foi apoiado pelo Ministerio de Economia y AGL2014 competitividade-52408-R e a Generalitat de Catalunya 2014 SGR-524. MVC é beneficiário de uma bolsa de PIF-UAB.

o uso dos animais descritos nas seções abaixo foi aprovado pelo Comitê de ética em pesquisa humana da Universitat Autònoma de Barcelona e Animal e pelo departamento d &#39; Agricultura, Ramaderia, Pesca eu Alimentació da Generalitat de Catalunya (protocolo #8741).
 1. armazenamento e inativação de célula alimentador Nota: fibroblastos humanos prepúcio (HFF-1) foram previamente congelados em 1 mL de solução de congelação composta de 90% soro Fetal bovino (FBS) e 10% de dimetil sulfóxido ( DMSO) e armazenados em nitrogênio líquido até uso.
<ol><li>Descongelar um frasco criogênico do HFF-1 (1 mL) mergulhando o frasco em banho maria a 37 ° C.</li>
	<li>Adicionar o conteúdo descongelado do frasco criogênico para pré-aquecido Dulbecco &#39; s Modified Eagle &#39; s médio (DMEM) suplementado com 10% FBS tornar um 01:10 diluição.</li>
	<li>As células diluídas (10 mL) de sementes num balão T75 e cultura-los a 37 ° C e 5% de CO 2.</li>
	<li>No dia seguinte, mudar o meio para eliminar os restos de DMSO. Retire o meio e adicione 10 mL de DMEM pré-aquecido suplementado com 10% FBS.</li>
	<li>Cultura os HFFs e mudar o meio cada 48 h até a cultura atinge o estágio confluente. Isto pode demorar cerca de 7 a 10 dias.</li>
	<li>Para preparar a solução de inactivação, diluir mitomicina C em DMEM suplementado com 10% FBS em uma concentração final de 10 µ g/mL. Incubar as células com a solução de inativação por 3 h a 37 ° C e 5% de CO 2.</li>
	<li>Remover a solução de inactivação e enxágue as células três vezes com 2 mL de Hanks equilibrado sal solução (HBSS) para eliminar os restos de mitomicina C.</li>
	<li>Para desprender as células inactivadas, adicionar 1 mL de solução de tripsina-EDTA pré-aquecido e incubar durante 5 min a 37 ° C e 5% de CO 2.</li>
	<li>Observar as células sob um microscópio invertido para garantir que eles são desanexados (10 x objetivo com 0,3 abertura numérica ou nd). Se não forem, incube-los por mais uns minutos a 37 ° C e 5% de CO 2. Verifique as células novamente sob o microscópio invertido.</li>
	<li>Pipetar a solução com uma pipeta Pasteur para dissociar as touceiras de celular.</li>
	<li>Neutralizar a solução enzimática adicionando 4 mL de DMEM suplementado com 10% FBS e ressuspender.</li>
	<li>Tomar uma alíquota da suspensão celular e faça uma diluição de 1: 100 em HBSS. Para determinar o número de células, carregar 10 µ l da diluição em um Neubauer &#39; câmara de s. Contar as células, localizadas em uma das grandes praças da câmara sob um microscópio invertido (objetivo de x 20 com um at 0.45).
	<ol><li>Repetir a contagem em um total de quatro quadrados grandes. Calcular o número total de células (N) como N = número médio de células contadas x volume total x diluição x 10 4.</li>
	</ol></li> <li>Centrifugar o resto da amostra durante 5 min à 200 x. g. descartar o sobrenadante e ressuspender o precipitado com o congelamento solução em uma concentração de 10 6 células / mL.</li>
	<li>Alíquota a suspensão em frascos criogênicos com 10 6 células (1 mL) cada. Coloque os frascos criogênicos num recipiente frio e congelar a -80 ° C.</li>
	<li>No dia seguinte, conservar os frascos criogênicos em azoto líquido.</li>
</ol> 2. Cultura de pilha alimentador <ol><li>um a quatro dias antes de iniciar o processo de derivação, descongelar um frasco criogênico contendo 1 x 10 6 inativada HFF-1 células em um banho de água a 37 ° C.</li>
	<li>Fazer uma diluição de 1:6 do HFF-1 descongeladas em pré aquecido DMEM suplementado com 10% FBS e manter a temperatura a 37 ° C.</li>
	<li>Encha cada poço de uma placa de 4 com 500 µ l de gelatina previamente aquecido de 0,2% de pele suína e manter a placa a 37 ° C durante 10 min.</li>
	<li>Remover a 500 µ l de gelatina de poços e adicionar 500 µ l da diluição HFFs. Agitar suavemente a placa para garantir uma distribuição uniforme dos HFFs no fundo dos poços. Evite movimentos circulares, caso contrário, as células irão concentrar-se no centro do poço.</li>
	<li>Incubar a placa pelo menos 24 h a 37 ° C e 5% CO 2 para obter uma monocamada de HFFs inactivadas em cada poço.</li>
	<li>No dia seguinte, observar as células sob um microscópio invertido (objetivo de X 10 com 0,3 ND) e verifique se eles estão anexados e homogeneamente distribuídos. Mude o meio para eliminar os restos de DMSO. Remover o meio e adicione 500 µ l de DMEM pré-aquecido suplementado com 10% FBS.</li>
</ol> 3. Colheita de embriões e cultura <ol><li>quatro dias antes da colheita de embriões, administrar 5 IU de égua grávida &#39; gonadotropina do soro s por injeção intraperitoneal de ratos fêmeas de 6 a 12 semana. 
	Nota: Nós usamos fêmeas do 129S2 ou estirpes de B6CFAF1, embora as fêmeas de outras tensões do mouse podem ser usadas. No entanto, quando trabalhar com fêmeas de cepas não-permissivo (por exemplo, CBA), médio deve ser complementado com 2i como mencionado na etapa 4.2.</li>
	<li>Após 48 h, administrar 5 UI de gonadotrofina coriônica humana por injeção intraperitoneal e acasalar as fêmeas com os machos, pelo menos 8 semanas de idade, na proporção de 1:1. Separar as fêmeas os machos no dia seguinte.</li>
	<li>No dia anterior a colheita de embriões, preparar uma cultura de células de 35mm placa de Petri com vários 40 gotas de µ l de KSOMaag suplementado com 4 mg/mL de albumina de soro bovino (BSA) e encher o prato com óleo mineral para cobrir totalmente as gotas. Incubar o prato em 37 ° C e 5% CO 2 para equilibrar o meio.</li>
	<li>Para preparar pipetas de manipulação do embrião, aqueça a parte mais fina de um vidro com ponta longa pipeta Pasteur usando um bico de Bunsen. Depois de macio, tire-a da chama e separar as duas extremidades. Quebrá-lo para o comprimento desejado. O diâmetro interno na ponta deve ser de 100-150 µm.</li>
	<li>Eutanásia de ratos fêmeas por deslocamento cervical 45-48 h post-coitum (p.c.).</li>
	<li>Dissecar os ratos para expor na cavidade abdominal por um corte a pele com curva suave tesoura afiada e o peritônio com tesoura afiada em linha reta. Pegar um útero com fórceps, cortar o oviduto usando tesouras afiadas direto e colocá-lo no tampão Hepes CZB médio (HCZB) 13 a 37 ° C. Repita o processo para remover outro oviduto.</li>
	<li>Flush os ovidutos com uma seringa de 1 mL carregados com HCZB mantido no lugar por pinças de relojoeiro para coletar os embriões de 2 células. 
	Nota: Para preparar a tomada de agulha-lavagem uma agulha hipodérmica de 30g, corte a extremidade e à terra para uma ponta romba sobre uma pedra abrasiva.</li>
	<li>Usando o aparelho de pipeta de boca, pegar os embriões, lavá-los com HCZB e cultura-los a placa de cultura de embrião previamente preparado em 37 ° C e 5% de CO 2 até o estágio de blastocisto. Até 50 embriões podem ser cultivados em cada gota de 40 µ l. Monitorar o desenvolvimento do embrião cada 24 h sob um estereomicroscópio. 
	Nota: Como alternativa, os embriões podem ser coletados na fase de blastocisto para encurtar em vitro cultura de embriões. Neste caso, abater as fêmeas no dia 3.5-4.5 p.c., dissecar o útero. e nivelá-lo com HCZB.</li>
</ol> 4. Derivação de células-tronco <ol><li>preparação das placas de derivação <ol><li>no dia da semeadura de embrião, prepare o suporte de derivação, complementando o meio DMEM com 100 µM 2 β Mercaptoetanol, 1 x não-aminoácidos essenciais , 20% de substituição do soro e 10 3 U/mL LIF.</li>
		<li>Se desejar, adicione também 1 µM do inibidor MEK PD0325901 e 3 µM do inibidor GSK3 CHIR99021 para obter um meio de 2i.</li>
		<li>Levar a placa com a monocamada de HFFs inactivadas (passo 2.6) de 4 a incubadora. Remover o meio e adicionar 800 µ l de meio de derivação pré-aquecido a cada poço. Devolve a chapa para a incubadora.</li>
	</ol></li> <li>Remoção de Zona pelúcida e embrião semeadura <ol><li>preparar uma cultura celular de 35 mm placa de Petri com gotas de três 30 µ l de ácido Tyrode &#39; s solução 14 e gotas de três 30 µ l de meio de derivação. Cubra as gotas com óleo mineral e mantenha o prato em 37 ° C.</li>
		<li>Retirar o prato de cultura de embrião da incubadora. Um por um, transferir os blastocistos de gotas a cultura para um ácido Tyrode &#39; gota de solução de s usando uma pipeta de manipulação do embrião. Se possível, selecione apenas os blastocistos expandidos para iniciar o processo de derivação.</li>
		<li>Monitor a zona pelúcida digestão sob o microscópio. Assim que a zona pelúcida desaparece, transferência de blastocisto para uma queda média de derivação para lavar o ácido Tyrode &#39; solução de s.</li>
		<li>Levar o prato de derivação 4-poço de incubadora e semente de uma zona livre de blastocisto no alimentador de células em cada poço.</li>
		<li>Retornar a chapa 4-poço de derivação para a incubadora e a cultura em 37 ° C e 5% de CO 2.</li>
	</ol></li> <li>Crescimento de células-tronco de monitoramento e médio mudam <ol><li>monitorar as culturas cada 24 h sob um microscópio invertido (objetivo de X 20 com at 0.45). É importante observar se há sinais de diferenciação de células-tronco, como as células inchadas refractivas circundante a consequência natural ou mesmo empurrando o alimentador células lado.</li>
		<li>Todos os outros dias, alterar o meio de cultura. Retirar a placa de 4 a incubadora, remover o meio de cada poço e adicionar 800 µ l de meio de derivação pré-aquecido suplementado com LIF e 2i, se usado. Manter a cultura até Humanisme é observados (6-8 dias).</li>
	</ol></li></ol> 5. Manutenção e cultura de células-tronco <ol><li>preparar Kolle, como alças e pipetas de manipulação de células-tronco. Siga os passos 3.4 para preparar pipetas de manipulação de células-tronco com um diâmetro interno na ponta de 250-300 µm. Use a outra parte da pipeta Pasteur puxada para preparar o cabo de Kolle, como. Aqueça e moldá-la até a obtenção de um gancho.</li>
	<li>Levar o prato de cultura 4-bem fora da incubadora e localize a consequência sob um estereomicroscópio. Use a alça para afastar as células diferenciadas e os alimentadores que cercam a consequência. 
	Nota: Para evitar eventual diferenciação da consequência, é importante remover todas as células diferenciadas da borda da consequência a.</li>
	<li>Aspire a consequência de uma pipeta de manipulação de células-tronco e coloque-o em um prato novo em uma gota de tripsina-EDTA 50 µ l.</li>
	<li>Usar um bisturi para cortar a consequência em várias partes a fim de desagregá-lo tanto mecanicamente e enzimaticamente.</li>
	<li>Imediatamente, transfira os fragmentos de consequência em uma gota fresca de proveniência média para neutralizar a ação da tripsina.</li>
	<li>Transferir os fragmentos de consequência natural para uma nova placa de 4 com uma monocamada de alimentadores. Transferência de até 10 fragmentos por alvéolo e cultura-los com proveniência média em 37 ° C e 5% de CO 2.</li>
	<li>Manter as culturas de células-tronco, como pelo menos seis semanas antes de considerar a linha mESC estabelecida. Alterar o meio de todos os outros dias e subcultura-los uma vez por semana.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Biswas, A., Hutchins, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cells.">Embryonic stem cells.</a> Stem Cell Dev. 16 (2), 213-221 (2007).</li><li>Weinberger, L., Ayyash, M., Novershtern, N., Hanna, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+stem+cell+states:+naive+to+primed+pluripotency+in+rodents+and+humans.">Dynamic stem cell states: naive to primed pluripotency in rodents and humans.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (3), 155-169 (2016).</li><li>Evans, M. J., Kaufman, M. 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L., Torres, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+culture+medium+support+development+of+random-bred+1-cell+mouse+embryos+in+vitro.">An improved culture medium support development of random-bred 1-cell mouse embryos in vitro.</a> J Reprod Fertil. 86, 679-688 (1989).</li><li>Nagy, A., Vintersten, K., Behringer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. , (2003).</li><li>Lee, K. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+culture+conditions+support+distinct+states+associated+with+different+developmental+stages+and+potency.">Embryonic stem cell culture conditions support distinct states associated with different developmental stages and potency.</a> Stem Cell Rep. 7 (2), 177-191 (2016).</li></ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Embora a derivação de linha mESC é um procedimento bem conhecido rotineiramente utilizado em muitos laboratórios, sua eficiência não é sempre tão alta quanto o esperado devido os múltiplos fatores que podem perturbar a manutenção da pluripotência. No presente artigo mostramos, passo a passo, como estabelecer linhas de mESC com alta eficiência usando um protocolo simples e confiável. Estas eficiências são semelhantes aos relatados na literatura.
Para garantir a máxima eficiênc...

Células-tronco embrionárias (ESC) são pluripotentes células derivadas de embriões pré-implantação, que mantêm a capacidade de renovar o Self ou diferenciar sob condições específicas1. Baseado sobre essas propriedades, ESC tornaram-se uma ferramenta útil para a medicina regenerativa, modelagem de doença e de estudos engenharia de tecido2.
ESC foram derivados pela primeira vez embriões pré-implantação do mouse, originando linhas ESC (mESC) rato com sucesso baixa3,4. Durante anos, a eficiência de derivação permaneceu baixa devido à dificuldade de manutenção da pluripotência em vitro. Além disso, a presença de alimentador células5, que melhoram a eficiência de derivação, promover a fixação da colônia e realçar estabilidade espectofotômetro6, várias modificações das protocolo conduzir a uma melhoria na manutenção da pluripotência. As mais importantes foram a adição de fator inibitório de leucemia (LIF) mESC meio de cultura7,8, a utilização de embriões da 129S2 fundo permissiva9 e a cultura dos mESC com suplementado com definido soro, livre de potenciais fatores de diferenciação10. Mais recentemente, evidências convincentes tem mostrado que a adição de um coquetel de dois moduladores da pequeno-molécula de vias de sinalização para o meio de cultura de mESC (conhecido como 2i) é melhor manter a pluripotência. O cocktail de 2i consiste numa combinação de inibidor MEK PD0325901, que reduz os sinais de diferenciação por inibição da via de quinase (MAPK) proteína mitogen-ativado, e o inibidor de GSK3β CHIR99021, que aumenta a sobrevivência da pilha de baixa densidade Ativando o Wnt caminho11.
No presente artigo, descrevemos um protocolo simples derive eficientemente mESC linhas de blastocistos de rato. Seguimos os procedimentos padrão, cultivo de embriões de estirpes permissivas em células alimentador suplementado de derivação com LIF e uma substituição de soro12. Seguir este protocolo, mESC linhas pode ser derivada com eficiências equivalentes às obtidas no meio de 2i. Apesar disso, 2i pode ser adicionado para evitar possíveis problemas com manutenção de pluripotência, ou quando se trabalha com cepas não-permissiva.

<table><tbody><tr><td>1 mL sryringe</td><td>BD&amp;nbsp;</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>2-&amp;beta;-mercaptoethanol</td><td>Life Technologies</td><td>31350-010</td><td></td></tr><tr><td>4-well plate</td><td>Thermo Scientific Nunc</td><td>176740</td><td></td></tr><tr><td>Acidic Tyrode&#039;s solution&amp;nbsp;</td><td>Home-made</td><td></td><td>See recipe in Nagy et al, 2003. For short-term storage (up to 1 month) keep it at 4&amp;ordm;C. Alternatively, for long-term storage keep it at -20&amp;ordm;C. If the efficiency of the solution diminishes, it should be acidified by the adition of a small drop of HCl 1M.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A3311</td><td></td></tr><tr><td>Chicken anti-Mouse IgG, Alexa Fluor 488</td><td>Molecular Probes - Invitrogen</td><td>A-21200</td><td>1:500 dilution. Secondary antibody for Oct4, Tuj1, &amp;alpha;SMA and AFP mouse antibodies.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>CHIR990212</td><td>Axon Medchem&amp;nbsp;</td><td>1386</td><td>Reconstitute with 2.15 ml DMSO for each mg of powder, to obtain a 1 mM stock solution. Aliquot at desired volume and store at -20&amp;ordm;C. Avoid freeze and thaw cycles.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>CryoTube</td><td>Thermo Scientific Nunc</td><td>3754518</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>41640</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>BioWest</td><td>L0107</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>BioWest</td><td>S1810</td><td>Inactivate it prior to use by heating for 30 mins at 56&amp;ordm;C. Aliquot and store at -20&amp;ordm;C</td></tr><tr><td>Flushing needle</td><td>BD&amp;nbsp;</td><td>304000</td><td>Cut the end of the needle and ground to a blunt tip on an abrasive stone</td></tr><tr><td>Gelatin from porcine skin</td><td>Fluka</td><td>48724</td><td>Dilute at 0,2% in destilled water and autoclave it. Each dilution can be used for a month.</td></tr><tr><td>Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 594</td><td>Molecular Probes - Invitrogen</td><td>A-11037</td><td>1:500 dilution. Secondary antibody for Sox2 rabbit antibody.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>BioWest</td><td>L0611</td><td></td></tr><tr><td>Hepes-buffered CZB&amp;nbsp;</td><td>Home-made</td><td></td><td>See composition in Chatot et al, 1989</td></tr><tr><td>Human chorionic gonadotropin</td><td>Divasa-Farmavic</td><td>Veterin-Corion 3000 UI</td><td>Dilute in NaCl 0.9% at 50 IU/ml. Aliquot it in 1 ml and store at -20&amp;ordm;C for up to two months. Once thawed do not freeze again.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Human foreskin fibroblasts</td><td>ATCC</td><td>ATCCSCRC-1041</td><td>For long term storage it is recommended to store them in liquid nitrogen.</td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replacement</td><td>Life Technologies</td><td>&amp;nbsp;10828-028</td><td>Photosensitive. It is recommended to aliquot it in small volumes such as 10 ml and store it at -20&amp;ordm;C (check the expiration date). Avoid freeze and thaw cycles.&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>KSOMaag Evolve</td><td>Zenith Biotech</td><td>ZEKS-050</td><td>Supplement with 4 mg/ml BSA. Equilibrate at 37&amp;ordm;C and 5% CO2 a day prior to use.</td></tr><tr><td>Leukemia Inhibitory Factor</td><td>Merk Millipore</td><td>ESG1106</td><td></td></tr><tr><td>Mice&amp;nbsp;</td><td>Charles River/Harlan</td><td></td><td>It is recommended to use mice from a permissive strain in terms of mESC derivation (such as 129S2 or C57BL). However, inbreed strains are less efficient producing embryos. Therefore, it is recomended to use a hybrid strain, such as 129S2 x C57BL or B6CBAF1 to take advantage of the hybrid vigor.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Mineral oil</td><td>Sigma</td><td>M8410</td><td>Embryo tested. Photosensitive.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Mitomycin C</td><td>Serva</td><td>2980501</td><td>Reconstitute the powder with MilliQ water at 0.5 mg/ml. Store at 4&amp;ordm;C protected from light. Attention, it is harmful and suspected of causing cancer.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Mouse anti-tubulin &amp;beta; III (Tuj1)</td><td>Biolegend</td><td>MMS-435P</td><td>1:500 dilution</td></tr><tr><td>Mouse monoclonal anti-&amp;alpha;SMA</td><td>Sigma</td><td>A5228</td><td>1:200 dilution</td></tr><tr><td>Mouse monoclonal anti-AFP</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>MAB1368</td><td>1:50 dilution</td></tr><tr><td>Mouse monoclonal anti Oct3/4&amp;nbsp;</td><td>Santa cruz</td><td>Sc-5279</td><td>1:50 dilution</td></tr><tr><td>Non-Essential Amino Acids</td><td>Life Technologies</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>PD0325901</td><td>Axon Medchem&amp;nbsp;</td><td>1408</td><td>Reconstitute with 2.08 ml DMSO for each mg of powder, to obtain a 1 mM stock solution. Aliquot at desired volume and store at -20&amp;ordm;C. Avoid freeze and thaw cycles.</td></tr><tr><td>Petri dish (35mm)</td><td>Thermo Scientific Nunc</td><td>153066</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish (60mm)</td><td>Thermo Scientific Nunc</td><td>150288</td><td></td></tr><tr><td>Pregnant mare&#039;s serum gonadotropin</td><td>Foligon</td><td>Foligon-1000 UI</td><td>Dilute in NaCl 0.9% at 50 IU/ml. Aliquot it in 1 ml and store at -20&amp;ordm;C for up to two months. Once thawed do not freeze again.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Rabbit policlonal anti-Sox2</td><td>Merck Millipore</td><td>AB5603</td><td>1:200 dilution</td></tr><tr><td>T75 falcon</td><td>Thermo Scientific</td><td>130190</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA 10x</td><td>BioWest</td><td>X0930</td><td>Dilute 1:10 in HBSS to obtain a 1x solution</td></tr></tbody></table>

derivation of stem cell lines from mouse preimplantation embryos

Derivação de células-tronco embrionárias (mESC) do mouse é o processo pelo qual pluripotentes linhagens celulares estabelecidas dos embriões pré-implantação. Estas linhas mantêm a capacidade de renovar o Self ou diferenciar sob condições específicas. Devido a essas propriedades, o mESC são uma ferramenta útil na medicina regenerativa, modelagem de doença e estudos de engenharia de tecidos. Este artigo descreve um protocolo simples para obter linhas de mESC com eficiências de alta derivação (60-80%) pelo cultivo de blastocistos de estirpes de rato permissiva em células alimentador definido suplementado com fator inibitório de leucemia. O protocolo também pode ser aplicado derive eficientemente mESC linhas de cepas não-permissiva do mouse, pela simples adição de um coquetel de dois inibidores da pequeno-molécula ao meio de derivação (2i médio). Os procedimentos detalhados sobre a preparação e a cultura de células de alimentador, coleta e cultura de embriões de rato e derivação e cultura das linhas mESC são fornecidos. Este protocolo não requer equipamento especializado e pode ser realizado em qualquer laboratório com conhecimentos de cultura de pilha mamífera básica.

Na sequência deste protocolo, mais 95% da formação de consequência deve ser alcançado após a primeira semana da cultura (figura 1A). Estabelecimento de linhas de mESC após seis passagens é variável entre repetições experimentais, com uma média de 60-80% de sucesso. A adição de 2i não melhorar significativamente os resultados ao trabalhar com cepas de rato permissivas, tais como aqueles com antecedentes de 129S2, mas é necessário quando se tra...

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Derivation of Stem Cell Lines from Mouse Preimplantation Embryos

Derivação das linhas de células-tronco de embriões pré-implantação do rato

Este artigo descreve um protocolo para eficientemente derivar e cultura linhas de células-tronco pluripotentes de embriões de rato no estágio de blastocisto.

Mouse embryonic stem cell (mESC) derivation is the process by which pluripotent cell lines are established from preimplantation embryos. These lines ...

derivation-of-stem-cell-lines-from-mouse-preimplantation-embryos

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

8.3K visualizações.  Universitat Autònoma de Barcelona. Este artigo descreve um protocolo para eficientemente derivar e cultura linhas de células-tronco pluripotentes de embriões de rato no estágio de blastocisto.

Vídeo: Derivation of Stem Cell Lines from Mouse Preimplantation Embryos

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are derived from the blastocyst of the early embryo and are pluripotent in differentiative ability.  Their vast differentiative potential has made them the focus of much research centered on deducing how to coax them to generate clinically useful cell types.  The successful derivation of hematopoietic stem cells (HSC) from mouse ESC has recently been accomplished and can be visualized in this video protocol.  HSC, arguably the most clinically exploited cell population, are used to treat a myriad of hematopoietic malignancies and disorders.  However, many patients that might benefit from HSC therapy lack access to suitable donors.  ESC could provide an alternative source of HSC for these patients.  The following protocol establishes a baseline from which ESC-HSC can be studied and inform efforts to isolate HSC from human ESC.  In this protocol, ESC are differentiated as embryoid bodies (EBs) for 6 days in commercially available serum pre-screened for optimal hematopoietic differentiation.  EBs are then dissociated and infected with retroviral HoxB4.  Infected EB-derived cells are plated on OP9 stroma, a bone marrow stromal cell line derived from the calvaria of  M-CSF-/- mice, and co-cultured in the presence of hematopoiesis promoting cytokines for ten days.  During this co-culture, the infected cells expand greatly, resulting in the generation a heterogeneous pool of 100s of millions of cells.  These cells can then be used to rescue and reconstitute lethally irradiated mice.

This protocol details the derivation of transplantable hematopoietic stem cells from mouse embryonic stem cells (ESC) and their subsequent injection into lethally irradiated recipient mice. Briefly, ESC are differentiated as embryoid bodies, which are then infected with retroviral HoxB4 and co-cultured with OP9 stromal cells and hematopoietic cytokines.

Derivação de Células-Tronco Hematopoéticas murino de Células-Tronco Embrionárias

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Biologia

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse preimplantation embryos. The procedures necessary for embryo collection, immunofluorescence, imaging on a confocal microscope, and image segmentation and analysis are described. This method allows quantitation of the expression of multiple nuclear markers and the spatial (XYZ) coordinates of all cells in the embryo. It takes advantage of MINS, an image segmentation software tool specifically developed for the analysis of confocal images of preimplantation embryos and embryonic stem cell (ESC) colonies. MINS carries out unsupervised nuclear segmentation across the X, Y and Z dimensions, and produces information on cell position in three-dimensional space, as well as nuclear fluorescence levels for all channels with minimal user input. While this protocol has been optimized for the analysis of images of preimplantation stage mouse embryos, it can easily be adapted to the analysis of any other samples exhibiting a good signal-to-noise ratio and where high nuclear density poses a hurdle to image segmentation (e.g., expression analysis of embryonic stem cell (ESC) colonies, differentiating cells in culture, embryos of other species or stages, etc.).

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analysis of protein expression to study lineage specification in mouse preimplantation embryos. The procedures necessary for collection of blastocysts, whole-mount immunofluorescent detection of proteins, imaging of samples on a confocal microscope, and nuclear segmentation and image analysis are described.

Análise quantitativa da expressão da proteína para estudar Especificação Lineage no mouse Preimplantation Embriões

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

Biologia do Desenvolvimento

Loss- and Gain-of-function Approach to Investigate Early Cell Fate Determinants in Preimplantation Mouse Embryos

Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene modification in preimplantation embryos provides a means to study the underlying mechanisms of genes implicated in, for instance, cellular differentiation into the trophectoderm (TE) and the inner cell mass (ICM). Here, we describe a protocol that examines the role of neogenin as an authentic receptor for initial cell fate determination in preimplantation mouse embryos. First, we discuss the experimental manipulations that were used to produce gain and loss of neogenin function by microinjecting neogenin cDNA and shRNA; the effectiveness of this approach was confirmed by a strong correlation between the pair-wise expression levels of either red fluorescent protein (RFP) or green fluorescent protein (GFP) and the immunocytochemical quantification of neogenin expression. Secondly, overexpression of neogenin in preimplantation mouse embryos leads to normal ICM development while neogenin knockdown causes the ICM to develop abnormally, implying that neogenin could be a receptor that relays extracellular cues to drive blastomeres to early cell fates. Given the success of this detailed protocol in investigating the function of a novel embryonic developmental stage-specific receptor, we propose that it has the potential to aid in exploration and identification of other stage-specific genes during embryogenesis.

The goal of this protocol is to describe a loss- and gain-of function method that is applicable to identify neogenin as a stage-specific receptor that leads to trophectoderm and inner cell mass differentiation in preimplantation mouse embryos.

Deficitária e Abordagem de ganho de função para Investigar celular precoce Destino Determinantes na pré-implantação embriões de camundongos

 Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene ...

Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass. 


The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass.

Derivação de células estaminais embrionárias humanas por Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both ...

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum (dpc) mouse embryos.  Developing gonadal ridges from mouse embryos (C57BL6J) were dissociated by mechanical disruption with collagenase, then plated in a mouse embryo fibroblast feeder layer (MEF-CF1) that was previously mitotically inactivated with mitomycin C in the presence of knockout media and supplemented with Leukemia Inhibitor Factor (LIF), basic Fibroblast Growth Factor (bFGF), and Stem Cell Factor (SCF).  Using these optimized methods for PCG identification, isolation, and establishment of culture conditions permits long term cultures of EG cells for more than 40 days.  The embryonic germinal cell lines showed embryonic phenotype and expression of common used markers of the pluripotent state.  Isolation and derivation of germinal cells in culture provide a tool to understand their development in vitro and offer the opportunity to monitor cumulative damage at genetic and epigenetic levels after exposure to oxidative stress.

The ability of embryonic germinal cells to differentiate into primordial germinal cells during early development stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum mouse embryos.

Isolamento e derivação de células embrionárias de rato Germinal

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Derivation of Mouse Trophoblast Stem Cells from Blastocysts

Specification of the trophectoderm is one of the earliest differentiation events of mammalian development. The trophoblast lineage derived from the trophectoderm mediates implantation and generates the fetal part of the placenta. As a result, the development of this lineage is essential for embryo survival. Derivation of trophoblast stem (TS) cells from mouse blastocysts was first described by Tanaka et al. 1998. The ability of TS cells to preserve the trophoblast specific property and their expression of stage- and cell type-specific markers after proper stimulation provides a valuable model system to investigate trophoblast lineage development whereby recapitulating early placentation events. Furthermore, trophoblast cells are one of the few somatic cell types undergoing natural genome amplification. Although the molecular pathways underlying trophoblast polyploidization have begun to unravel, the physiological role and advantage of trophoblast genome amplification remains largely elusive. The development of diploid stem cells into polyploid trophoblast cells in culture makes this ex vivo system an excellent tool for elucidating the regulatory mechanism of genome replication and instability in health and disease. Here we describe a protocol based on previous reports with modification published in Chiu et al. 2008.

In this video, we demonstrate the isolation of mouse blastocysts and the derivation of trophoblast stem cells from blastocysts. We also describe conditions for maintenance of the stem cell property as well as induction of differentiation in culture.

Derivação de células-tronco do rato trofoblasto de blastocistos

Specification of the trophectoderm is one of the earliest differentiation events of mammalian development. The trophoblast lineage derived from the ...

Application of Mouse Parthenogenetic Haploid Embryonic Stem Cells as a Substitute of Sperm

In organisms with sexual reproduction, germ cells are the source of totipotent cells that develop into new individuals. In mice, fertilization of an oocyte by a spermatozoon creates a totipotent zygote. Recently, several publications have reported that haploid embryonic stem cells (haESCs) can be a substitute for gametic genomes and contribute to embryos, which develop into mice. Here, we present a protocol to apply parthenogenetic haESCs as a substitute of sperm to construct embryos by intracytoplasmic injection into oocytes. This protocol consists of steps for preparing haESCs as sperm replacement, for injection of haESC chromosomes into oocytes, and for culture of semi-cloned embryos. The embryos can yield fertile semi-cloned mice after embryo transfer. Using haESCs as sperm replacement facilitates genome editing in the germline, studies of embryonic development, and investigation of genomic imprinting.

This article aims to demonstrate the use of parthenogenetic haploid embryonic stem cells as a substitute for sperm for the construction of semi-cloned embryos.

Aplicação de Células-Tronco Embrionárias Haploid Partehenogenéticas do Rato como um substituto do esperma

In organisms with sexual reproduction, germ cells are the source of totipotent cells that develop into new individuals. In mice, fertilization of an ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

Geração de camundongos derivadas de células-tronco pluripotentes induzidas

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

Studying germ cell formation and differentiation has traditionally been very difficult due to low cell numbers and their location deep within developing embryos. The availability of a "closed" in vitro based system could prove invaluable for our understanding of gametogenesis. The formation of oocyte-like cells (OLCs) from somatic stem cells, isolated from newborn mouse skin, has been demonstrated and can be visualized in this video protocol. The resulting OLCs express various markers consistent with oocytes such as Oct4 , Vasa , Bmp15, and Scp3. However, they remain unable to undergo maturation or fertilization due to a failure to complete meiosis. This protocol will provide a system that is useful for studying the early stage formation and differentiation of germ cells into more mature gametes. During early differentiation the number of cells expressing Oct4 (potential germ-like cells) reaches ~5%, however currently the formation of OLCs remains relatively inefficient. The protocol is relatively straight forward though special care should be taken to ensure the starting cell population is healthy and at an early passage.

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

In recent years the formation of germ cells using in vitro culture methods has been demonstrated using several different types of somatic stem cells. This article will visually present the differentiation of newborn mouse derived stem cells to early oocyte-like cells.

Diferenciação de camundongos neonatos pele derivadas de células-tronco em células germinativas semelhantes<em&gt; In vitro</em

Studying  germ cell formation and differentiation has traditionally been very difficult  due to low cell numbers and their location deep within developing ...

Cell Labeling and Injection in Developing Embryonic Mouse Hearts

Testing the fate of embryonic or pluripotent stem cell-derivatives in in vitro protocols has led to controversial outcomes that do not necessarily reflect their in vivo potential. Preferably, these cells should be placed in a proper embryonic environment in order to acquire their definite phenotype. Furthermore, cell lineage tracing studies in the mouse after labeling cells with dyes or retroviral vectors has remained mostly limited to early stage mouse embryos with still poorly developed organs. To overcome these limitations, we designed standard and ultrasound-mediated microinjection protocols to inject various agents in targeted regions of the heart in mouse embryos at E9.5 and later stages of development. &#160;Embryonic explant or embryos are then cultured or left to further develop in utero. These agents include fluorescent dyes, virus, shRNAs, or stem cell-derived progenitor cells. Our approaches allow for preservation of the function of the organ while monitoring migration and fate of labeled and/or injected cells. These technologies can be extended to other organs and will be very helpful to address key biological questions in biology of development.

We describe a series of methods to inject dyes, DNA vectors, virus, and cells in order to monitor both cell fate and phenotype of endogenous and grafted cells derived from embryonic or pluripotent cells within mouse embryos at embryonic day (E)9.5 and later stages of development.

Rotulagem celular e injeção em Desenvolvimento embrionárias corações do rato

Testing the fate of embryonic or pluripotent stem cell-derivatives in in vitro protocols has led to controversial outcomes that do not necessarily reflect ...