Espectroscopia de força de molécula única pode fornecer enormes insights sobre biologia molecular na escala atômica, permitindo-nos manipular moléculas únicas com força. Aqui, demonstramos uma medição constante de velocidade usando microscópio de força atômica. Podemos, em última análise, usar os dados para determinar a estabilidade da proteína, a taxa de desdobramento e o caminho desdobrado.
Para iniciar o procedimento, conecte uma guia adesiva não condutora a um disco de ferro limpo de 15 milímetros de largura. Remova a folha de cobertura e pressione firmemente um deslizamento de vidro limpo, sem revestimento ou revestido de ouro sobre o adesivo exposto. Guarde o slide em uma placa de Petri limpa e coberta.
Em seguida, concentre a poliproteína purificada em um filtro centrífuga, depois reverta a coluna e eute a proteína no tampão a ser usado no experimento. Determine a concentração proteica apropriada com base na absorvância a 280 nanômetros e, em seguida, prepare 100 microliters de uma solução de 100 microgramas por mililitro da proteína. Aplique uma gota de 60 microliter da solução proteica no centro do slide.
Tome cuidado para não deixar o líquido escorregar entre o slide e o disco de ferro, pois isso levará a movimentos amostrais descontroladas durante o experimento. Deixe a amostra ficar em temperatura ambiente por pelo menos 10 minutos. Primeiro, pegue cuidadosamente o cantilever até o final e coloque-o na célula de retenção da sonda.
Certifique-se de que o cantilever está firmemente sentado. Em seguida, coloque a célula de retenção na cabeça afm. Coloque a cabeça em um estágio de microscópio invertido e conecte uma bateria à cabeça AFM para alimentar o laser.
Configure uma câmera para o detector de microscópio para visualizar a luz laser em um monitor ou tela de TV. Guiado pelo microscópio, posicione o laser para que ele seja direcionado para a ponta cantilever. Uma vez que a amostra esteja pronta, lave 10 microliters do buffer de experimento em cada porta da célula de retenção da sonda.
Decante aproximadamente 40 microliters de fluido do slide da amostra e adicione 40 microliters de tampão. Enquanto isso, comece a preparar o microscópio de força atômica para a medição. Primeiro, coloque o slide sobre o ímã acima do motor piezo.
Confirme se o estágio AFM está na posição elevada e coloque a cabeça AFM no palco com o cantilever acima da gota da amostra. Em seguida, coloque um pequeno pedaço de papel em frente ao fotodiodo AFM. Ajuste o laser até que o ponto no papel esteja brilhante e focado e, em seguida, remova o papel.
Inicie o software AFM para visualizar o sinal do fotodiodo. Ajuste o espelho da cabeça AFM para que o sinal laser seja maximizado em todos os quatro quadrantes de fotodiodo, e um sinal diferente entre os pares do quadrante superior e inferior é zero. Para começar a calibrar o AFM, gire a configuração do filtro para o sinal da cabeça AFM para largura de banda completa e certifique-se de que o piezo está desligado.
No software AFM, meça a média de 512 cálculos do espectro de energia, com 1.024 pontos de dados por cálculo. Integre a densidade espectral de potência através do primeiro pico, que corresponde ao modo principal de vibração para o cantilever. Em seguida, ligue o controlador piezo e coloque o filtro em 500 Hertz.
Mova rapidamente a cabeça do AFM para baixo algumas centenas de micrômetros enquanto monitora o sinal diferente. Continue movendo a cabeça para baixo algumas centenas de micrômetros de cada vez enquanto observa saltos consistentes no sinal diferente. Quando os saltos de sinal começam a aumentar em altura, a ponta fica muito próxima da superfície da amostra.
Uma vez que o sinal de deflexão satura no contato da ponta com a superfície, levante ligeiramente a cabeça, em seguida, ajuste a tensão piezo para mover a cabeça AFM para cima ou para baixo em 100 a 5.000 nanômetros para encontrar a superfície da amostra. Depois disso, realize um experimento de puxar com um tamanho de varredura de cerca de 500 nanômetros para que a ponta entre em contato com a superfície, ou cerca de 100 nanômetros de viagem a motor piezo. Use os resultados para calcular a constante e sensibilidade da mola.
No software, defina o tamanho da varredura para 40% maior do que o tamanho teórico total da poliproteína desdobrada. Posicione a cantilever de modo que seja 80% do tamanho da varredura longe da superfície. Defina a velocidade de varredura para 300 nanômetros por segundo.
Realize um experimento de puxar e meça a posição piezo resultante e o sinal de fotodiodo. Adicione o tampão do experimento à célula fluida de hora em hora durante toda a medição para evitar que a amostra seque. Os desdobramentos em gravações de uma poliproteína I91 e de uma poliproteína em que três domínios I91 flanquearam a molécula DE NI10C em cada lado, foram equipados com um modelo de cadeia semelhante a um verme.
Ambas as gravações mostram os incrementos característicos de força e comprimento do contorno do I91, indicando que a calibração AFM foi bem sucedida. As gravações da poliproteína contendo a molécula N110C mostraram eventos I91 suficientes para confirmar que os novos eventos eram da proteína de interesse desdobrando. O comprimento médio do contorno para a repetição de anquilrina foi de cerca de 10,5 nanômetros, e as forças desdobrantes estavam entre oito e 25 piconewtons.
É essencial usar uma poliproteína porque os eventos desdobramentos das proteínas de flanqueamento fornecem um controle positivo para imprimir o evento da molécula única. Sem isso, os dados são passíveis de má interpretação.
