Name: localization of odorant receptor genes in locust antennae by rna in situ hybridization
Uploaded: 2017-07-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
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Este trabalho é apoiado por uma doação da National Natural Science Foundation of China (nº31472037). A menção de nomes comerciais ou produtos comerciais neste artigo é exclusivamente para fornecer informações específicas e não implica recomendação.

NOTA: Para limitar a degradação de ARN, prepare soluções usando água destilada em autoclave em húmido (a 121 ° C por 60 min) e também materiais em autoclave em molhado. 1. Preparação de RNA ISH Sondas anti-sentido e sentido <ol><li> Objetivo amplificação e purificação de genes <ol><li> Primeiro, produza um fragmento de cadeia dupla de 387 pb de L. migratoria OR1 ( LmigOR1 , GenBank: JQ766965) a partir do plasmídeo contendo o cDNA completo de LmigOR1 com uma Taq DNA Polymerase que adiciona adeninas a ambas as extremidades dos fragmentos. <ol><li> Usar um 100 uL de volume de reacção final, contendo 50? L de mistura de reacção 2x, 4 uL de cada sentido e anti-iniciadores (Tabela 1), 1? L de molde do plasmídeo e 41 uL de RNase H 2 O. A utilização do seguinte PCR Protocolo: 94 ° C durante 5 min, seguido de 30 ciclos de 94 ° C durante 30 s, 55 ° C durante 30 s e 72 ° C durante 1 min, Seguido de 72 ° C durante 10 min. </li><li> Repita estes passos para produzir o fragmento de cadeia dupla de LMigOR2 (GenBank: JQ766966) de 1.303 pb e 1.000 pb de LmigORco (GenBank: JN989549). Os iniciadores utilizados nestas experiências são apresentados na Tabela 1 . </li><li> Execute produtos de PCR em géis de agarose a 1,2% em 1x tampão Tris-acetato-EDTA e visualize usando coloração com brometo de etidio. </li></ol></li><li> Extraia esses produtos de PCR usando um kit de extração de gel. <ol><li> Após a eletroforese, adicione as faixas de DNA do gel e coloque as fatias de gel em um tubo de 1,5 mL. Em seguida, adicione 100 μL de tampão de ligação (Buffer PN) por 0,1 g de fatia de gel. Vortex e incubar a 50 ° C até a fatia de gelar completamente dissolvida. </li><li> Insira uma coluna de adsorção CA2 no tubo de coleta e adicione 500 μL de buffer de equilíbrio (Buffer BL). Isso melhora a capacidade de absorção e a estabilidade da membrana de sílica. CentriFugir em 12.400 xg por 1 min. </li><li> Transferir a mistura de gel dissolvido para o conjunto da coluna de adsorção e incubar à temperatura ambiente durante 2 min. Em seguida, centrifugue os tubos a 12.400 xg durante 1 min. Descarte o fluxo e reinsira a coluna de adsorção no tubo de coleta. </li><li> Adicione 600 μL de solução de lavagem (etanol adicionado, Buffer PW) duas vezes. Centrifugar a 12.400 xg por 1 min. Descarte o fluxo e reinsira a coluna de adsorção no tubo de coleta. </li><li> Esvazie o tubo de recolha e recentrifique o conjunto da coluna em 12.400 xg durante 2 minutos para permitir a evaporação de qualquer etanol residual. </li><li> Transfira cuidadosamente a coluna de adsorção para um tubo de centrífuga de 1,5 mL. Secar ao ar a pastilha por 5-10 min e redissolver o DNA num volume adequado ( por exemplo, 30 μL) de água isenta de nuclease. </li><li> Incubar à TA por 2 min. Centrifugar a 12.400 xg por 2 min. Descarte a coluna de adsorção e armazene o DNA a 4 ° C ou -20 ° C. </li></ol></li></ol></li><li> Construa os plasmídeos recombinantes <ol><li> Ligar individualmente o fragmento de 387 pb de LmigOR1 , fragmento de 1,303 pb de LmigOR2 e 1,251 pb de LmigORco em um vetor T que contém promotores para as polimerases de ARN T7 (a montante) e SP6 (a jusante) adjacentes ao DNA inserido usando T4 DNA ligase. Prepare a seguinte reação de 10 μL: 5 μL de tampão de ligação 2x, 1 μL de vetor T, 3 μL (~ 100 ng) do DNA do gene inserido e 1 μL de ADN ligase T4 e incuba O / N a 4 ° C. </li><li> Adicionar 5 uL de cada plasmídeo recombinante contendo o fragmento de 387 pb de LmigOR1, 1303 pb fragmento de LmigOR2 e 1251 pb fragmento de LmigORco separadamente em 50 uL de células de Escherichia coli DH5a competentes em tubos de 1,5 mL esteis. <ol><li> Misture suavemente e coloque os tubos em gelo durante 30 min e depois incubri-los durante 90 s a 42ºC.° C. Transfira-os de volta ao gelo por 3 min. </li><li> Adicione 450 μL de meio líquido Luria-Bertani (LB) sem ampicilina a cada tubo e incuba-os em um agitador a 150 rpm durante 1 h a 37 ° C para restaurar o E. coli DH5a. </li><li> Pegue uma alíquota de 100 μL de cada transformante e use-os para inocular placas de substrato sólido LB contendo 50 μg / mL de ampicilina, 24 μg / mL de isopropil p-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) e 40 μg / mL de 5-bromo-4 -cloro-3-indolil-p-D-galactopiranósido (X-gal). </li><li> Incubar estas placas em uma incubadora constante a 37 ° C durante 18 h. Tira os plasmídeos recombinantes alvo usando o método de triagem azul-branco. Seqüencie os plasmídeos recombinantes alvo usando a seqüência de Sanger e identifique as direções de inserção dos genes OR. </li></ol></li></ol></li><li> Selecione endonucleases de restrição para linearizar plasmídeos recombinantes <ol><li> Usar endonucleases de restrição tNão apenas digerir no site de clonagem múltipla do vetor, mas também não cortar o DNA da inserção. Nesta experiência, todos os 3 genes são inseridos no vetor T na direção correspondente à do vetor. </li><li> Utilize a endonuclease de restrição Nco I para linearizar os plasmídeos recombinantes contendo o fragmento de 387 pb de LmigOR1 , fragmento de L30mm de LmigOR2 e 1.251 pb de LmigORco para produzir as sondas anti-sentido. Use a endonuclease de restrição Sp e I para produzir as sondas sensoriais. NOTA: Se a direção da inserção corresponde à do vetor, então um local de restrição exclusivo do final de T7 é selecionado para linearizar o plasmídeo recombinante e a ARN polimerização de SP6 é usada para preparar a sonda anti-sentido. Um local de restrição exclusivo do final de SP6 é selecionado para linearizar o plasmídeo recombinante, e a polimerase de ARN T7 é usada para preparar a sonda de detecção. Caso contrário, se a direção da inserção não corresponder a tA direção do vetor, então um local de restrição exclusivo do final de SP6 é selecionado para linearizar o plasmídeo recombinante e a polimerase de ARN T7 é usada para preparar a sonda anti-sentido. O site de restrição exclusivo do final de T7 é selecionado para linearizar o plasmídeo recombinante, e a ARN polimerização SP6 é usada para preparar a sonda de detecção. </li></ol></li><li> Purificando os plasmídeos recombinantes linearizados <ol><li> Digerir 20 μg de cada um dos três plasmídeos recombinantes contendo o fragmento de 387 pb de LmigOR1 , fragmento de L30ig de LmigOR2 e 1.251 pb de LmigORco usando a endonuclease de restrição de Nco I em uma reação de 100 μL que contém 10 μL de tampão 10x, 40 μL de 0,5 ug de plasmídeo / L, 3 mL de Nco I e 47 uL de RNase H 2 O, seguido por uma incubação de 3 h a 37 ° C. </li><li> Da mesma forma, digerir 20 μg de cada um desses três plasmídeos recombinantes vocêCante a endonuclease de restrição Spe I. </li><li> Purifique estes plasmídeos digeridos usando um kit de extração de gel como descrito em 1.1.2. Determine as concentrações destes plasmídeos recombinantes linearizados extraídos por espectrofotometria e ajuste para 0,5 μg / μL. </li></ol></li><li> Prepare sondas anti-sentido e sensoriais <ol><li> Use o sistema de transcrição de ARN T7 / SP6 para gerar sondas anti-sentido e sensoriais. A polimerase de ARN de SP6 é usada para transcrever ARN de cadeia dupla para sondas anti-sentido marcadas com DIG e biotina para esses três genes OR usando plasmídeos recombinantes linearizados como modelos in vitro . A polimerase de ARN T7 é utilizada para produzir sondas sensoriais. Realize a reação em um volume final de 20 μL, contendo 2 μL de mistura de NTP 10x, 2 μL de tampão de transcrição 10X, 1 μL de inibidor de RNase, 2 μL de ARN polimerização T7 ou SP6, 4 μL de 0,5 μg / μL de plasmídeo linearizado e 9 ul de ARNase isento de H 2 O, seguidoPor uma incubação de 3 h a 37 ° C. </li><li> Incubar as sondas de detecção anti-sentido marcadas com DIG e biotina durante 30 min com 1 μL de DNase a 37 ° C. Adicionar 2,5 μL de LiCl 5 M e 75 μL de etanol absoluto, depois incubar as reações durante 30 min a -70 ° C. </li><li> Centrifugar a 15,000 xg durante 30 min a 4 ° C. Decanta com cuidado o sobrenadante. Adicione 150 μL de etanol a 70% para lavar o precipitante. Prepare o etanol a 70% (1 L) adicionando 95% de etanol (736,8 mL) a água destilada estéril (263,2 mL). </li><li> Centrifugar a 15,000 xg durante 30 minutos a 4 ° C novamente e secar ao ar a pastilha por 5-10 minutos à TA. Adicione 25 μL de H 2 O isento de RNase para dissolver as sondas anti-sentido e sensoriais de RNA. </li><li> Se o comprimento do gene inserido for superior a 1 kb, subseqüentemente fragmenta sondas de sentido antisentido e de detecção de ARN até um comprimento médio de 300 pb por incubação em soluções tampão de carbonato de carbonato. Realize a reação em um volume final de 50 μL, containing 25 pL da sonda de ARN e 25 uL da solução tampão de bicarbonato-carbonato (80 mM de NaHCO3, 120 mM de Na 2 CO 3, pH 10,2) a 60 ° C. O tempo de hidrólise requerido é dado por uma fórmula 17 previamente publicada. </li><li> Adicione 5 μL de ácido acético a 10% para parar a reação. Neste experimento, fragmentar as sondas de sentido antisense e LmigOR2 LmigOR2 e LmigORco durante 24 e 23 minutos, respectivamente. T = (L o -L f ) / kXL o XL f L o = os comprimentos de fragmentos iniciais em kb L f = o comprimento final dos fragmentos em kb K = a constante de taxa para hidrólise, aproximadamente 0,11 kb -1 min -1 T = tempo de hidrólise em min </li><li> Finalmente, adicione 250 μL de tampão de hibridação e armazene a -80 ° C. </li></ol></li></ol> 2. Preparação de seções de criostato <ol><li> Precool o freeziNg microtome a -24 ° C. </li><li> Selecione novos gafanhotos adulto em muda que estejam ativos e tenham antenas intactas. Corte as antenas em pedaços de 2-3 mm usando máquinas de barbear estéreis. </li><li> Coloque o composto OCT em um suporte de micrótomo congelante e coloque uma ou duas amostras sobre o composto horizontalmente. Em seguida, transfira o suporte para o micrótomo de congelação a -24 ° C para equilibrar até o composto congelar. Retire o suporte e cubra as amostras com um pouco de composto. Transfira o suporte para o micrótomo de congelação a -24 ° C novamente durante pelo menos 10 minutos ( Figura 1 ). NOTA: Evite obter bolhas no composto. </li><li> Fixar o suporte com as amostras no micrótomo de congelação, depois separar as amostras congeladas em fatias de 12 μm de espessura a -24 ° C. </li><li> Descongelar as fatias uma a uma nas lâminas (25 x 75 mm, livre de nuclease) e secar ao ar por 10 min. </li></ol> 3. Seções de fixação <ol><li> Após a preparação do criostatoSeções, coloque as lâminas em um recipiente de plástico (~ 100 x 40 x 80 mm) e conserte os tecidos incubando as lâminas em solução de paraformaldeído a 4% (PFA) por 30 minutos a 4 ° C. </li><li> Lavar as lâminas em solução salina tamponada com fosfato 1X (PBS) durante 1 min. </li><li> Para eliminar as proteínas alcalinas, transfira as lâminas para HC1 0,2 M por 10 min. </li><li> Para eliminar a proteína superficial do ácido nucleico, transfira as lâminas para 1XPBS com 1% de Triton X-100 durante 2 min. </li><li> Lave os slides duas vezes por 30 s em 1x PBS. </li><li> Finalmente, enxaguar as lâminas na solução de formamida durante 10 min a 4 ° C. </li></ol> 4. Hibridação <ol><li> Prepare as sondas anti-sentido e sensoriais <ol><li> Use o tampão de hibridação para diluir as sondas antisentido ou sensora de RNA nos tubos livres de nuclease de 1,5 mL. Nesta experiência, para todas as sondas antisentido e sensorial ( LmigOR1, LmigOR2 e LmigOrco ), adicione 1 μL de sonda a 99 μL buffer de hibridação por slide. Geralmente, o uso de diluições 1: 100 de sondas anti-sentido produz sinais positivos significativos e baixos fundos usando este protocolo. </li><li> Para detecção cromogênica, diluir as sondas marcadas com DIG individualmente. </li><li> Para a detecção de TSA, diluir LmigOR1 marcado com DIG com sondas LmigOrco marcadas com biotina ou LmigOR2 marcado com DIG com sondas LmigOR1 marcadas com biotina em conjunto no tampão de hibridação. </li><li> Aquecer as diluições durante 10 min a 65 ° C e colocá-las em gelo durante pelo menos 5 min. </li></ol></li><li> Hibridação <ol><li> Drene as lâminas e adicione 100 μL de sondas de detecção anti-sentido diluídas (Etapa 4.1) às secções de tecido. Em seguida, coloque lamínulas (24 mm x 50 mm, livres de nuclease) nas seções de tecido. </li><li> Coloque as lâminas cobertas horizontalmente em uma caixa úmida (~ 300 x 180 x 50 mm 3 , Figura 2 ) e incubar umaT 55 ° C durante 22 h. Adicione a solução de formamida ou 1X PBS no fundo da caixa para manter o ambiente úmido, mas não submergir as lâminas no líquido. </li></ol></li><li> Lavagem e bloqueio. <ol><li> Após a hibridação, remova cuidadosamente os lamínulas. Lave as lâminas duas vezes por 30 min em citrato de sódio salino 0.1x (SSC) a 60 ° C. NOTA: A lavagem significa colocar as lâminas em um suporte de deslizamento que é então colocado em um recipiente de plástico e agitado suavemente em um balancim (~ 50 rpm, Figura 2 ). </li><li> Enxaguar as lâminas em 1x Tris-Buffered Saline (TBS) durante 30 s. </li><li> Adicionar 1 mL de reagente de bloqueio a 1% em TBS suplementado com Triton X-100 a 0,03% em cada lâmina e incubar durante 30 min. Em seguida, descarte a solução de bloqueio. </li></ol></li><li> Imuno-histoquímica. <ol><li> Para a detecção cromogênica, use reagente de bloqueio no TBS para diluir 750 unidades (U) / mL anti-digoxigenina anti-conjugado APDy a 1,5 U / mL AP solução. Adicione 100 μL de solução AP por deslizamento coberto (24 mm x 50 mm). </li><li> Para detecção de TSA, use reagente de bloqueio em TBS para diluir 750 U / mL de anticorpo anti-digoxigenina AP conjugado e anticorpo anti-biotina com estreptavidina conjugada com HRP para a solução AP / HRP. Adicione 100 μL de solução de AP / HRP por deslizamento coberto (24 mm x 50 mm). </li><li> Incube os slides em uma caixa úmida ( Figura 2 ) durante 60 min a 37 ° C. Use a solução de formamida ou 1X PBS para manter a caixa úmida, mas não encharcada. </li></ol></li></ol> 5. Coloração <ol><li> Remova cuidadosamente os lamínulas. Lavar as lâminas três vezes durante 5 min em 1x TBS suplementado com 0,05% de Tween-20. Enxaguar os slides em tampão DAP (detecção cromogênica: pH 9,5, detecção TSA: pH 8,0) durante 5 min. </li><li> Coloração (detecção cromogênica) <ol><li> Adicionar 100 μL de solução de substrato NBT (375 μg / mL) / BCIP (188 μg / mL) (diluída em DAP;PH 9,5) para cada slide. Coloque cuidadosamente os lamínulos (24 x 50 mm) nos slides. </li><li> Incube as lâminas em uma caixa úmida com solução de substrato por 10 min - O / N a 37 ° C. NOTA: Verifique o desenvolvimento, olhando os slides de vez em quando ao microscópio. </li><li> Quando o desenvolvimento estiver pronto, pare a reação transferindo as lâminas para dentro da água. </li></ol></li><li> Coloração (detecção TSA) <ol><li> Use uma seringa para mover o substrato de HNPP (100 μg / mL) / Fast Red (250 μg / mL) do filtro da seringa (0,22 μm, Figura 2 ). </li><li> Adicione 100 μL de HNPP / Substrato Vermelho Rápido por slide coberto com uma lamínula (24 x 50 mm). Incube as lâminas durante 30 minutos com HNPP / Substrato Vermelho Rápido à RT. </li><li> Remova cuidadosamente os lamínulas e lave as lâminas três vezes por 5 minutos em 1X TBS suplementado com 0,05% de Tween-20. </li><li> Use 100 μL de substrato TSA / coberto (24 x 50 mm 2 ) deslize. Incube as lâminas com substrato de TSA durante 10 min à TA. </li><li> Remova cuidadosamente os lamínulas e lave as lâminas três vezes durante 5 minutos em 1x TBS suplementado com 0,05% de Tween-20. </li></ol></li><li> Incorporar as lâminas em PBS / glicerol (1: 3). NOTA: Depois de concluir estes procedimentos, as lâminas devem ser observadas o mais cedo possível porque o sinal fluorescente vai aplacar rapidamente. </li></ol> 6. Observação <ol><li> Detecção cromogênica <ol><li> Observe as seções de tecido usando um microscópio óptico. Escolha as lentes objetivas 10X, 20X e 40X para observar os resultados da detecção cromogênica. </li><li> Use o software DP-BSW para analisar os resultados e capturar as imagens. </li></ol></li><li> Detecção TSA <ol><li> Observe seções de tecido usando um microscópio confocal. Os genes marcados com DIG devem ser observados sob luz de 543 nm, apresentando uma cor vermelha, e os genes marcados com biotina devem serObservado sob luz de 488 nm, apresentando uma cor verde. Quando emergem, apresentam cor amarela. </li><li> Escolha as lentes objetivas 20X e 40X para observar os resultados da detecção TSA, respectivamente. </li><li> Use o software FV1000 para analisar os resultados e capturar as imagens. </li></ol></li></ol>

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C., Wilkinson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ.+hybridization+to+cellular+RNA+with+radiolabelled+RNA+probes.">In situ. hybridization to cellular RNA with radiolabelled RNA probes.</a> In situ hybridization. , 2 (1992).</li><li>Komminoth, P., Merk, F. B., Leav, I., Wolfe, H. J., Roth, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+35S-+and+digoxigenin-labeled+RNA+and+oligonucleotide+probes+for+in+situ+hybridization.+Expression+of+mRNA+of+the+seminal+vesicle+secretion+protein+II+and+androgen+receptor+genes+in+the+rat+prostate.">Comparison of 35S- and digoxigenin-labeled RNA and oligonucleotide probes for in situ hybridization. Expression of mRNA of the seminal vesicle secretion protein II and androgen receptor genes in the rat prostate.</a> Histochemistry. 98 (4), 217-228 (1992).</li><li>Leary, J. J., Brigati, D. J., Ward, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+sensitive+colorimetric+method+for+visualizing+biotin-labeled+DNA+probes+hybridized+to+DNA+or+RNA+immobilized+on+nitrocellulose:+Bio-blots.">Rapid and sensitive colorimetric method for visualizing biotin-labeled DNA probes hybridized to DNA or RNA immobilized on nitrocellulose: Bio-blots.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 80 (13), 4045-4049 (1983).</li><li>Hallem, E. A., Ho, M. G., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+basis+of+odor+coding+in+the+Drosophila+antenna.">The molecular basis of odor coding in the Drosophila antenna.</a> Cell. 117 (7), 965-979 (2004).</li><li>Jones, W. D., Nguyen, T. A., Kloss, B., Lee, K. J., Vosshall, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+conservation+of+an+insect+odorant+receptor+gene+across+250+million+years+of+evolution.">Functional conservation of an insect odorant receptor gene across 250 million years of evolution.</a> Curr Biol. 15 (4), R119-R121 (2005).</li></ol>

Os autores não têm nada a divulgar ou quaisquer outros conflitos de interesse.

É difícil realizar RNA ISH para localizar genes OU em antenas de insetos porque os níveis de expressão de genes OR, exceto ORco , são muito baixos e a preservação de fatias histológicas de antenas de insetos é muito difícil. Além disso, a detecção TSA também é muito complicada. Para resolver esses problemas, as seguintes medidas devem ser tomadas. As antenas são selecionadas a partir de gafas adultas de muda que possuem cutículas antenas finas e macias, que mantêm sua morfologia no slide. As a...

As antenas de insetos, que são os órgãos quimiossensores mais importantes, são cobertas com muitas estruturas parecidas com o cabelo - chamadas sensilla - que são inervadas pelos neurônios receptores olfatórios (ORNs). Na membrana de ORN de insetos, os receptores de odorantes (OR), um tipo de proteína contendo sete domínios transmembranares, são expressos com um coreceptor (ORco) para formar um heterômero que funciona como um canal iónico 1 , 2 , 3 odorante. OUs diferentes respondem a diferentes combinações de compostos químicos 4 , 5 , 6 . Os gafanhotos ( Locusta migratoria ) dependem principalmente de pistas olfativas para desencadear comportamentos importantes 7 . As ERs do Locustão são fatores-chave para a compreensão dos mecanismos olfativos moleculares. Localizando um gene OR específico para o neurônio de umO tipo de sensibilidade morfológicamente específico por ARN In Situ Hybridization (RNA ISH) é o primeiro passo na exploração da função OR. RNA ISH usa uma sonda de ARN complementar marcada para medir e localizar uma sequência de ARN específica em uma seção de tecido, células ou montagens inteiras in situ , fornecendo informações sobre processos fisiológicos e patogênese da doença. As sondas de ARN marcadas com marcadores de digoxigenina (marcados com DIG) e de biotina foram amplamente utilizadas na hibridação de ARN. A marcação de ARN com digoxigenina-11-UTP ou biotina-16-UTP pode ser preparada por transcrição in vitro com polimerases de ARN de SP6 e T7. As sondas de ARN marcadas com DIG e biotina possuem as seguintes vantagens: não radioativas; seguro; estável; altamente sensível; Altamente específico; E fácil de produzir usando PCR e transcrição in vitro . As sondas de ARN marcadas com DIG e biotina podem ser detectadas cromogenicamente e fluorescentemente. As sondas de ARN marcadas com DIG podem ser detectadas com Alkali anti-digoxigeninaAnticorpos conjugados com fosfatase (AP) que podem ser visualizados quer com os substratos quimioluminescentes altamente sensíveis cloreto de tetrazólio nitroblue / sal de 5-bromo-4-cloro-3-indolil-fosfato toluidina (NBT / BCIP) utilizando um microscópio óptico ou com 2 -hidroxi-3-naftoico-2&#39;-fenilanilida fosfato (HNPP) acoplado com sal de cloreto de hemi-zinco de 4-cloro-2-metilbenzenodiazónio (Fast Red) utilizando um microscópio confocal. As sondas de ARN marcadas com biotina podem ser detectadas com anticorpos conjugados anti-biotina com estreptavidina de rabo cavalo (HRP) que podem ser visualizados com fluoresceína-tiramides usando um microscópio confocal. Assim, a hibridação fluorescente in situ de duas cores pode ser realizada para detectar dois genes alvo em uma fatia usando sondas de RNA marcadas com DIG e biotina. O RNA ISH com sondas marcadas com DIG e / ou biotina foi utilizado com sucesso para localizar genes relacionados ao olfato, tais como OR , receptor ionotrópico, proteína de ligação aos odorantesE proteína da membrana neuronal sensorial, em antenas de insetos de, entre outras, Drosophila melanogaster , Anopheles gambiae , L. migratoria e gafanhoto do deserto, Schistocera gregaria 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 . No entanto, existem dois desafios substanciais ao executar RNA ISH para insetos OR: (1) OU genes (exceto ORco ) são expressos em níveis baixos e somente em algumas células, tornando a detecção de sinal muito difícil e (2) preservando o tecido de insetos para Histologia, de modo que a morfologia seja preservada e o ruído de fundo seja baixo, pode ser desafiador. Neste artigo, um protocolo detalhado e eficaz descrevendo RNA ISH para localizar genes OR em insetosAntenas são apresentadas, incluindo a detecção cromogênica e de ampliação de sinal de Tyramide (TSA).

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Materials&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2&amp;times;TSINGKE&lt;sup&gt;TM&lt;/sup&gt; Master Mix</td><td>TSINGKE, China</td><td>TSE004</td><td></td></tr><tr><td>RNase-free H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>TIANGEN, China</td><td>RT121-02</td><td></td></tr><tr><td>REGULAR AGAROSE G-10</td><td>BIOWEST, SPAIN</td><td>91622</td><td></td></tr><tr><td>Binding buffer</td><td>TIANgel Midi Purification Kit, TIANGEN, China</td><td>DP209-02</td><td></td></tr><tr><td>Balance buffer</td><td>TIANgel Midi Purification Kit, TIANGEN, China</td><td>DP209-02</td><td></td></tr><tr><td>Wash solution</td><td>TIANgel Midi Purification Kit, TIANGEN, China</td><td>DP209-02</td><td></td></tr><tr><td>T Vector</td><td>Promega, USA</td><td>A362A</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>Promega, USA</td><td>M180A</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Escherichia coli&lt;/em&gt; DH5&amp;alpha;</td><td>TIANGEN, China</td><td>CB101</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Sigma, USA</td><td>A-6140</td><td></td></tr><tr><td>Isopropyl &amp;beta;-D-1-thiogalactopyranoside</td><td>Inalco, USA</td><td>1758-1400</td><td></td></tr><tr><td>5-bromo-4-chloro-3-indolyl-&amp;beta;-D-galactopyranoside</td><td>SBS Genetech, China</td><td>GX1-500</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Nco&lt;/em&gt; I</td><td>BioLabs, New England</td><td>R0193S</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Spe&lt;/em&gt; I</td><td>BioLabs, New England</td><td>R0133M</td><td></td></tr><tr><td>DIG RNA Labeling Kit</td><td>Roche, Switzerland</td><td>11175025910</td><td></td></tr><tr><td>Biotin RNA Labeling Kit</td><td>Roche, Switzerland</td><td>11685597910</td><td></td></tr><tr><td>DNase</td><td>DIG RNA Labeling Kit, Roche, Switzerland</td><td>11175025910</td><td></td></tr><tr><td>LiCl</td><td>Sinopharm, China</td><td>10012718</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sinopharm, China</td><td>10009257</td><td></td></tr><tr><td>Acetic acid</td><td>BEIJING CHEMICAL REGENTS COMPANY, China</td><td>10000292</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T. Compound</td><td>Sakura Finetek Europe, Zoeterwoude, Netherlands</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Slides</td><td>TINA JIN HAO YANG BIOLOGCAL MANUFACTURE CO., LTE, China</td><td>FISH0010</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sinopharm, China</td><td>80070591</td><td></td></tr><tr><td>Millex</td><td>Millipore, USA</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>AMRESCO, USA</td><td>0777-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Nitroblue tetrazolium chloride / 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate toluidine salt</td><td>Roche, Switzerland</td><td>11175041910</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sinopharm, China</td><td>10010618</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Solutions&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1&amp;times;Tris-acetate-EDTA</td><td>Sigma, USA</td><td>V900483-1KG</td><td>0.04 mol/L Tris-Base</td></tr><tr><td>1&amp;times;Tris-acetate-EDTA</td><td>BEIJING CHEMICAL REGENTS COMPANY, China</td><td>10000292</td><td>0.12% acetic acid</td></tr><tr><td>1&amp;times;Tris-acetate-EDTA</td><td>Sigma, USA</td><td>03677</td><td>Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA)</td></tr><tr><td>Luria-Bertani (LB) liquid medium</td><td>Sinopharm, China</td><td>10019392</td><td>10 g/L NaCl</td></tr><tr><td>Luria-Bertani (LB) liquid medium</td><td>MERCK, Germany</td><td>VM335231</td><td>10 g/L Peptone from casein (Tryptone)</td></tr><tr><td>Luria-Bertani (LB) liquid medium</td><td>MERCK, Germany</td><td>VM361526</td><td>5 g/L Yeast extract</td></tr><tr><td>LB solid substrate plate</td><td>Sinopharm, China</td><td>10019392</td><td>10 g/L NaCl</td></tr><tr><td>LB solid substrate plate</td><td>MERCK, Germany</td><td>VM335231</td><td>10 g/L Peptone from casein (Tryptone)</td></tr><tr><td>LB solid substrate plate</td><td>MERCK, Germany</td><td>VM361526</td><td>5 g/L Yeast extract</td></tr><tr><td>LB solid substrate plate</td><td>WISENT ING, Canada</td><td>800-010-CG</td><td>15 g/L Agar Bacteriological Grade</td></tr><tr><td>10&amp;times;Phosphate-Buffered Saline (PBS, pH 7.1)</td><td>Sinopharm, China</td><td>10019392</td><td>8.5% NaCl</td></tr><tr><td>10&amp;times;Phosphate-Buffered Saline (PBS, pH 7.1)</td><td>Sigma, USA</td><td>V900041-500G</td><td>14 mM KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>10&amp;times;Phosphate-Buffered Saline (PBS, pH 7.1)</td><td>Sigma, USA</td><td>V900268-500G</td><td>80 mM Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>10&amp;times;Tris-Buffered Saline (TBS, pH 7.5)</td><td>Sigma, USA</td><td>V900483-1KG</td><td>1 M Tris-Base</td></tr><tr><td>10&amp;times;Tris-Buffered Saline (TBS, pH 7.5)</td><td>Sinopharm, China</td><td>10019392</td><td>1.5 M NaCl</td></tr><tr><td>Detection Buffer (DAP) &amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; chromogenic detection pH 9.5&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; TSA detection pH 8.0</td><td>Sigma, USA</td><td>V900483-1KG</td><td>100 mM Tris-Base</td></tr><tr><td>Detection Buffer (DAP) &amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; chromogenic detection pH 9.5&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; TSA detection pH 8.0</td><td>Sinopharm, China</td><td>10019392</td><td>100 mM NaCl</td></tr><tr><td>Detection Buffer (DAP) &amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; chromogenic detection pH 9.5&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; TSA detection pH 8.0</td><td>Sigma, USA</td><td>V900020-500G</td><td>50 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;middot;6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>20&amp;times;saline-sodium citrate (pH 7.0)</td><td>Sinopharm, China</td><td>10019392</td><td>3 M NaCl</td></tr><tr><td>20&amp;times;saline-sodium citrate (pH 7.0)</td><td>Sigma, USA</td><td>V900095-500G</td><td>0.3 M Na-Citrate</td></tr><tr><td>4% paraformaldehyde solution (PFA, pH 9.5)</td><td>Sigma, USA</td><td>V900894-100G</td><td>4% paraformaldehyde</td></tr><tr><td>Sodium Carbonate Buffer</td><td>Sigma, USA</td><td>V900182-500G</td><td>0.1 M NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>Sodium Carbonate Buffer (pH 10.2)</td><td>Sigma, USA</td><td>V900182-500G</td><td>80 mM NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>Sodium Carbonate Buffer (pH 10.2)</td><td>Sigma, USA</td><td>S7795-500G</td><td>120 mM Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;CO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>Formamide Solution (pH 10.2)</td><td>MPBIO, USA</td><td>FORMD002</td><td>50% Deionized Formamide</td></tr><tr><td>Formamide Solution (pH 10.2)</td><td></td><td></td><td>5&amp;times;saline-sodium citrate</td></tr><tr><td>Blocking Buffer in TBS</td><td>Roche, Switzerland</td><td>11175041910</td><td>1% Blot</td></tr><tr><td>Blocking Buffer in TBS</td><td>AMRESCO, USA</td><td>0694-500ML</td><td>0.03% Triton X-100</td></tr><tr><td>Blocking Buffer in TBS</td><td></td><td></td><td>1&amp;times;Tris buffered saline</td></tr><tr><td>Alkaline phosphatase solution</td><td>Roche, Switzerland</td><td>11175041910</td><td>1.5 U/mL anti-digoxigenin alkaline phosphatase conjugated antibody</td></tr><tr><td>Alkaline phosphatase solution</td><td></td><td></td><td>Blocking Buffer in TBS</td></tr><tr><td>Alkaline phosphatase/ horse radish peroxidase solution</td><td>Roche, Switzerland</td><td>11175041910</td><td>1.5 U/mL anti-digoxigenin alkaline phosphatase conjugated antibody</td></tr><tr><td>Alkaline phosphatase/ horse radish peroxidase solution</td><td>TSA kit, Perkin Elmer, USA</td><td>NEL701A001KT</td><td>1% anti-biotin streptavidin horse radish peroxidase- conjugated antibody</td></tr><tr><td>Alkaline phosphatase/ horse radish peroxidase solution</td><td></td><td></td><td>Blocking Buffer in TBS</td></tr><tr><td>Hybridization Buffer</td><td>MPBIO, USA</td><td>FORMD002</td><td>50% Deionized Formamide</td></tr><tr><td>Hybridization Buffer</td><td></td><td></td><td>2&amp;times;saline-sodium citrate</td></tr><tr><td>Hybridization Buffer</td><td>Sigma, USA</td><td>D8906-50G</td><td>10% dextran sulphate</td></tr><tr><td>Hybridization Buffer</td><td>invitrogen, USA</td><td>AM7119</td><td>20 &amp;micro;g/mL yeast t-RNA</td></tr><tr><td>Hybridization Buffer</td><td>Sigma, USA</td><td>D3159-10G</td><td>0.2 mg/mL herring sperm DNA</td></tr><tr><td>2-hydroxy-3-naphtoic acid-2&#039;-phenylanilide phosphate/ 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt substrate</td><td>Roche, Switzerland</td><td>11758888001</td><td>1% 2-hydroxy-3-naphtoic acid-2&#039;-phenylanilide phosphate (10 mg/mL)</td></tr><tr><td>2-hydroxy-3-naphtoic acid-2&#039;-phenylanilide phosphate/ 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt substrate</td><td>Roche, Switzerland</td><td>11758888001</td><td>1% 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt (25 mg/mL)</td></tr><tr><td>2-hydroxy-3-naphtoic acid-2&#039;-phenylanilide phosphate/ 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt substrate</td><td></td><td></td><td>Detection Buffer</td></tr><tr><td>Tyramide signal amplification substrate</td><td>TSA kit, Perkin Elmer, USA</td><td>NEL701A001KT</td><td>2% fluorescein-tyramides</td></tr><tr><td>Tyramide signal amplification substrate</td><td>TSA kit, Perkin Elmer, USA</td><td>NEL701A001KT</td><td>Amplification Diluent</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Instrument&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Freezing microtome</td><td>Leica, Nussloch, Germany</td><td>Jung CM300 cryostat</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotometer</td><td>Thermo SCIENTIFIC, USA</td><td>NANODROP 2000</td><td></td></tr><tr><td>Optical microscope</td><td>Olympus, Tokyo, Japan</td><td>Olympus IX71microscope</td><td></td></tr><tr><td>Confocal microscope</td><td>Olympus, Tokyo, Japan</td><td>Olympus BX45 confocal microscope</td><td></td></tr></tbody></table>

localization of odorant receptor genes in locust antennae by rna in situ hybridization

Os insetos evoluíram sofisticados sistemas de recepção olfativa para detectar sinais químicos exógenos. Esses sinais químicos são transduzidos por neurônios receptores olfatórios (ORNs) alojados em estruturas parecidas com o cabelo, chamados de quimiosensila, das antenas. Nas membranas dos ORN, pensa-se que os receptores de odorantes (RUP) estão envolvidos na codificação de odor. Assim, ser capaz de identificar genes localizados nas ORNs é necessário reconhecer genes OR e fornece uma base fundamental para novos estudos funcionais in situ . Os níveis de expressão de RNA de OR específicos em antenas de insetos são muito baixos e a preservação do tecido de insetos para a histologia é desafiadora. Assim, é difícil localizar um OR para um tipo específico de sensilla usando hibridização in situ RNA. Neste artigo, é introduzido um protocolo de hibridação in situ ARN detalhado e altamente eficaz, particularmente para genes OR de insetos pequenos. Além disso, um OR específico Gene waS identificado pela realização de experiências de hibridação in situ fluorescentes de duas cores utilizando um gene de receptor coexpressivo , Orco , como marcador.

Com a detecção cromogênica, um pequeno subconjunto das células antenais em todas as seções antenais adultas foi indicado pelas sondas antisentidades LmigOR1 e LmigOR2 marcadas com DIG ( Figura 3 ). ARN ISH em secções consecutivas para localizar LmigOR1 e LmigOR2 mostrou que as células que expressam antenares os dois genes foram localizados em aglomerados ORN expressam LmigORco, indicando que o LmigOR1...

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Localization of Odorant Receptor Genes in Locust Antennae by RNA In Situ Hybridization

Este artigo descreve um protocolo de hibridação in situ ARN detalhado e altamente eficaz, particularmente para genes de receptores de odorantes (OR) de baixo nível, bem como outros genes, em antenas de insetos usando sondas marcadas com digoxigenina (DIG) ou marcadas com biotina.

Localização de Genes de Receptor de Odorantes em Antenas de Locustídeo por RNA<em&gt; In Situ</em&gt; Hibridação

Insects have evolved sophisticated olfactory reception systems to sense exogenous chemical signals. These chemical signals are transduced by Olfactory ...

localization-odorant-receptor-genes-locust-antennae-rna-situ

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Localization of Odorant Receptor Genes in Locust Antennae by RNA In Situ Hybridization

8.0K visualizações.  China Agricultural University.  Este artigo descreve um protocolo de hibridação in situ ARN detalhado e altamente eficaz, particularmente para genes de receptores de odorantes (OR) de baixo nível, bem como outros genes, em antenas de insetos usando sondas marcadas com digoxigenina (DIG) ou marcadas com biotina. 

Vídeo: Localization of Odorant Receptor Genes in Locust Antennae by RNA In Situ Hybridization

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed in sensory hairs called sensilla, which cover the surface of olfactory organs. The surface of each sensillum is covered with tiny pores, through which odorants pass and dissolve in a fluid called sensillum lymph, which bathes the sensory dendrites of the OSNs housed in a given sensillum. The OSN dendrites express odorant receptor (OR) proteins, which in insects function as odor-gated ion channels4, 5. The interaction of odorants with ORs either increases or decreases the basal firing rate of the OSN. This neuronal activity in the form of action potentials embodies the first representation of the quality, intensity, and temporal characteristics of the odorant6, 7.
Given the easy access to these sensory hairs, it is possible to perform extracellular recordings from single OSNs by introducing a recording electrode into the sensillum lymph, while the reference electrode is placed in the lymph of the eye or body of the insect. In Drosophila, sensilla house between one and four OSNs, but each OSN typically displays a characteristic spike amplitude. Spike sorting techniques make it possible to assign spiking responses to individual OSNs. This single sensillum recording (SSR) technique monitors the difference in potential between the sensillum lymph and the reference electrode as electrical spikes that are generated by the receptor activity on OSNs1, 2, 8. Changes in the number of spikes in response to the odorant represent the cellular basis of odor coding in insects. Here, we describe the preparation method currently used in our lab to perform SSR on Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae, and show representative traces induced by the odorants in a sensillum-specific manner.

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

Electrophysiological responses of olfactory sensory neurons to odorants can be measured in insects using single sensillum recordings. In this video article we will demonstrate how to perform single sensillum recordings in the antennae of the vinegar fly (Drosophila melanogaster) and the maxillary palps of the malaria mosquito (Anopheles gambiae).

Único Recordings Sensillum na Insetos Drosophila melanogaster E Anopheles gambiae</em

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed ...

Neurociência

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust (Schistocerca Americana) Olfactory Circuits

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar olfactory systems suggesting that the biological approach to chemical sensing has been optimized over evolutionary time1. In the insect olfactory system, odorants are transduced by olfactory receptor neurons (ORN) in the antenna, which convert chemical stimuli into trains of action potentials. Sensory input from the ORNs is then relayed to the antennal lobe (AL; a structure analogous to the vertebrate olfactory bulb). In the AL, neural representations for odors take the form of spatiotemporal firing patterns distributed across ensembles of principal neurons (PNs; also referred to as projection neurons)2,3. The AL output is subsequently processed by Kenyon cells (KCs) in the downstream mushroom body (MB), a structure associated with olfactory memory and learning4,5. Here, we present electrophysiological recording techniques to monitor odor-evoked neural responses in these olfactory circuits.
First, we present a single sensillum recording method to study odor-evoked responses at the level of populations of ORNs6,7. We discuss the use of saline filled sharpened glass pipettes as electrodes to extracellularly monitor ORN responses. Next, we present a method to extracellularly monitor PN responses using a commercial 16-channel electrode3. A similar approach using a custom-made 8-channel twisted wire tetrode is demonstrated for Kenyon cell recordings8. We provide details of our experimental setup and present representative recording traces for each of these techniques.

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust Schistocerca Americana Olfactory Circuits

We demonstrate variations of the extracellular multi-unit recording technique to characterize odor-evoked responses in the first three stages of the invertebrate olfactory pathway. These techniques can easily be adapted to examine ensemble activity in other neural systems as well.

Multi-unidade Métodos de gravação para caracterizar a atividade neural no Locust (<em&gt; Schistocerca Americana</em&gt;) Circuitos olfatórias

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival  of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar ...

Preparing Developing Peripheral Olfactory Tissue for Molecular and Immunohistochemical Analysis in Drosophila

The olfactory system of Drosophila is a widely used system in developmental neurobiology, systems neuroscience, as well as neurophysiology, behavior, and behavioral evolution. Drosophila olfactory tissues house the olfactory receptor neurons (ORNs) that detect volatile chemical cues in addition to hydro- and thermo-sensory neurons. In this protocol, we describe the dissection of developing peripheral olfactory tissue of the adult Drosophila species. We first describe how to stage and age Drosophila larvae, followed by the dissection of the antennal disc from early pupal stages, followed by the dissection of the antennae from mid-pupal stages and adults. We also show methods where preparations can be utilized in molecular techniques, such as the RNA extraction for qRT-PCR, RNAseq, or immunohistochemistry. These methods can also be applied to other Drosophila species after species-specific pupal development times are determined, and respective stages are calculated for appropriate aging.

Preparing Developing Peripheral Olfactory Tissue for Molecular and Immunohistochemical Analysis in Drosophila

Here, we present a protocol to stage and dissect developing olfactory tissue from Drosophila species. The dissected tissue can later be used for molecular analyses, such as quantitative RT-PCR (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction) or RNA sequencing (RNAseq), as well as in vivo analyses such as immunohistochemistry or in situ hybridization.

Preparando a desenvolver tecido olfativo periférico para Molecular e análise imuno-histoquímica em Drosophila

The olfactory system of Drosophila is a widely used system in developmental neurobiology, systems neuroscience, as well as neurophysiology, behavior, and ...

Biologia do Desenvolvimento

Using Insect Electroantennogram Sensors on Autonomous Robots for Olfactory Searches

Robots designed to track chemical leaks in hazardous industrial facilities1 or explosive traces in landmine fields2 face the same problem as insects foraging for food or searching for mates3: the olfactory search is constrained by the physics of turbulent transport4. The concentration landscape of wind borne odors is discontinuous and consists of sporadically located patches. A pre-requisite to olfactory search is that intermittent odor patches are detected. Because of its high speed and sensitivity5-6, the olfactory organ of insects provides a unique opportunity for detection. Insect antennae have been used in the past to detect not only sex pheromones7 but also chemicals that are relevant to humans, e.g., volatile compounds emanating from cancer cells8 or toxic and illicit substances9-11. We describe here a protocol for using insect antennae on autonomous robots and present a proof of concept for tracking odor plumes to their source. The global response of olfactory neurons is recorded in situ in the form of electroantennograms (EAGs). Our experimental design, based on a whole insect preparation, allows stable recordings within a working day. In comparison, EAGs on excised antennae have a lifetime of 2 hr. A custom hardware/software interface was developed between the EAG electrodes and a robot. The measurement system resolves individual odor patches up to 10 Hz, which exceeds the time scale of artificial chemical sensors12. The efficiency of EAG sensors for olfactory searches is further demonstrated in driving the robot toward a source of pheromone. By using identical olfactory stimuli and sensors as in real animals, our robotic platform provides a direct means for testing biological hypotheses about olfactory coding and search strategies13. It may also prove beneficial for detecting other odorants of interests by combining EAGs from different insect species in a bioelectronic nose configuration14 or using nanostructured gas sensors that mimic insect antennae15.

We describe a protocol for using insect antennae in the form of electroantennograms (EAGs) on autonomous robots. Our experimental design allows stable recordings within a day and resolves individual odor patches up to 10 Hz. The efficiency of EAG sensors for olfactory searches is demonstrated in driving a robot toward an odor source.

Usando insetos eletroantenogramas Sensores em robôs autônomos para Pesquisas olfativas

Robots designed to track chemical leaks in hazardous industrial facilities1 or explosive traces in landmine fields2 face the same problem as insects ...

Electroantennography-based Bio-hybrid Odor-detecting Drone using Silkmoth Antennae for Odor Source Localization

Small drones with chemical or biosensor devices that can detect airborne odorant molecules have attracted considerable attention owing to their applicability in environmental and security monitoring and search-and-rescue operations. Small drones with commercial metal-oxide-semiconductor (MOX) gas sensors have been developed for odor source localization; however, their real-time-odor-detection performance has proven inadequate. However, biosensing technologies based on insect olfactory systems exhibit relatively high sensitivity, selectivity, and real-time response with respect to odorant molecules compared to commercial MOX gas sensors. In such devices, excised insect antennae function as portable odorant biosensor elements and have been found to deliver excellent sensing performance. This study presents experimental protocols for odorant-molecule detection in the air using a small autonomous bio-hybrid drone based on a mountable electroantennography (EAG) device incorporating silkmoth antennae.
We developed a mountable EAG device including sensing/processing parts with a Wi-Fi module. The device was equipped with a simple sensor enclosure to enhance the sensor directivity. Thus, odor source localization was conducted using the spiral-surge algorithm, which does not assume an upwind direction. The experimental bio-hybrid odor-detecting drone identified real-time odorant-concentration differences in a pseudo-open environment (outside a wind tunnel) and localized the source. The developed drone and associated system can serve as an efficient odorant molecule-detection tool and a suitable flight platform for developing odor source localization algorithms owing to its high programmability.

This study introduces experimental protocols for a bio-hybrid odor-detecting drone based on silkmoth antennae. The operation of an experimental electroantennogram device with silkmoth antennae is presented, in addition to the structure of a bio-hybrid drone designed for odor source localization using the spiral-surge algorithm.

Drone bio-híbrido de detecção de odor baseado em eletroantennografia usando antenas de seda para localização de fonte de odor

Small drones with chemical or biosensor devices that can detect airborne odorant molecules have attracted considerable attention owing to their ...

Engenharia

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

mRNAs are frequently localized to vertebrate axons and their local translation is required for axon pathfinding or branching during development and for maintenance, repair or neurodegeneration in postdevelopmental periods. High throughput analyses have recently revealed that axons have a more dynamic and complex transcriptome than previously expected. These analysis, however have been mostly done in cultured neurons where axons can be isolated from the somato-dendritic compartments. It is virtually impossible to achieve such isolation in whole tissues in vivo. Thus, in order to verify the recruitment of mRNAs and their functional relevance in a whole animal, transcriptome analyses should ideally be combined with techniques that allow the visualization of mRNAs in situ. Recently, novel ISH technologies that detect RNAs at a single-molecule level have been developed. This is especially important when analyzing the subcellular localization of mRNA, since localized RNAs are typically found at low levels. Here we describe two protocols for the detection of axonally-localized mRNAs using a novel ultrasensitive RNA ISH technology. We have combined RNAscope ISH with axonal counterstain using fluorescence immunohistochemistry or histological dyes to verify the recruitment of Atf4 mRNA to axons in vivo in the mature mouse and human brains.

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

RNA in situ hybridization (ISH) enables the visualization of RNAs in cells and tissues. Here we show how combination of RNAscope ISH with immunohistochemistry or histological dyes can be successfully used to detect mRNAs localized to axons in sections of mouse and human brains.

Detecção de Axonally localizada mRNAs em seções do cérebro Usando de alta resolução<em&gt; In Situ</em&gt; Hibridização

mRNAs are frequently localized to vertebrate axons and their local translation is required for axon pathfinding or branching during development and for ...

Using Single Sensillum Recording to Detect Olfactory Neuron Responses of Bed Bugs to Semiochemicals

The insect olfactory system plays an important role in detecting semiochemicals in the environment. In particular, the antennal sensilla which house single or multiple neurons inside, are considered to make the major contribution in responding to the chemical stimuli. By directly recording action potential in the olfactory sensillum after exposure to stimuli, single sensillum recording (SSR) technique provides a powerful approach for investigating the neural responses of insects to chemical stimuli. For the bed bug, which is a notorious human parasite, multiple types of olfactory sensillum have been characterized. In this study, we demonstrated neural responses of bed bug olfactory sensilla to two chemical stimuli and the dose-dependent responses to one of them using the SSR method. This approach enables researchers to conduct early screening for individual chemical stimuli on the bed bug olfactory sensilla, which would provide valuable information for the development of new bed bug attractants or repellents and benefits the bed bug control efforts.

Bed bugs rely on olfactory receptor neurons housed in their antennal olfactory sensilla to detect semiochemicals in the environment. Utilizing single sensillum recording, we demonstrate a method to evaluate bed bug response to semiochemicals and explore the coding process involved.

Usando Individual Sensillum Gravação para detectar respostas Olfativo Neurônio de percevejos para Semioquímicos

The insect olfactory system plays an important role in detecting semiochemicals in the environment. In particular, the antennal sensilla which house ...

Live-cell Measurement of Odorant Receptor Activation Using a Real-time cAMP Assay

The enormous sizes of the mammalian odorant receptor (OR) families present difficulties to find their cognate ligands among numerous volatile chemicals. To efficiently and accurately deorphanize ORs, we combine the use of a heterologous cell line to express mammalian ORs and a genetically modified biosensor plasmid to measure cAMP production downstream of OR activation in real time. This assay can be used to screen odorants against ORs and vice versa. Positive odorant-receptor interactions from the screens can be subsequently confirmed by testing against various odor concentrations, generating concentration-response curves. Here we used this method to perform a high-throughput screening of an odorous compound against a human OR library expressed in Hana3A cells and confirmed that the positively-responding receptor is the cognate receptor for the compound of interest. We found this high-throughput detection method to be efficient and reliable in assessing OR activation and our data provide an example of its potential use in OR functional studies.

Characterizing the function of odorant receptors serves an indispensable part in the deorphanization process. We describe a method to measure the activation of odorant receptors in real time using a cAMP assay.

Viver-pilha medição de odorante Receptor de ativação usando um ensaio de campo em tempo real

The enormous sizes of the mammalian odorant receptor (OR) families present difficulties to find their cognate ligands among numerous volatile chemicals. ...

Single Sensillum Recordings for Locust Palp Sensilla Basiconica

The palps of locust mouthparts are considered to be conventional gustatory organs that play an important role in a locust&#39;s food selection, especially for the detection of non-volatile chemical cues through sensilla chaetica (previously named terminal sensilla or crested sensilla). There is now increasing evidence that these palps also have an olfactory function. An odorant receptor (LmigOR2) and an odorant-binding protein (LmigOBP1) have been localized in the neurons and accessory cells, respectively, in the sensilla basiconica of the palps. Single sensillum recording (SSR) is used for recording the responses of odorant receptor neurons, which is an effective method for screening active ligands on specific odorant receptors. SSR is used in functional studies of odorant receptors in palp sensilla. The structure of the sensilla basiconica located on the dome of the palps differs somewhat from the structure of those on the antennae. Therefore, when performing an SSR elicited by odorants, some specific advice may be helpful for obtaining optimum results. In this paper, a detailed and highly effective protocol for an SSR from insect palp sensilla basiconica is introduced.

This paper describes a detailed and highly effective protocol for single sensillum recordings from the sensilla basiconica on the palps of insect mouthparts.

Único Sensillum gravações para Locust palpo sensilas Basiconica

The palps of locust mouthparts are considered to be conventional gustatory organs that play an important role in a locust&#39;s food selection, especially ...

Investigation of Activated Mouse Olfactory Sensory Neurons via Combined Immunostaining and in situ Hybridization

Animals rely on chemical communication to convey and perceive relevant environmental information, ranging from assessment of food quality to detection of available mating partners or threats. In mice, this task is executed primarily by the olfactory system and its underlying subsystems, including the main and accessory olfactory systems. Both have peripheral organs populated by sensory neurons expressing G-protein coupled receptors able to bind chemical cues that reach the nasal cavity. Even though the molecular characteristics of these receptors is well understood, little is known about their cognate specific ligands. The method described here combines in situ hybridization detection of olfactory or vomeronasal receptors with immunodetection of phosphorylated ribosomal protein S6 (pS6) - a marker of neuronal activation. This protocol was devised to identify neurons activated after a single event of exposure to purified or complex chemical stimuli detected by the olfactory organs. Importantly, this technique allows the investigation of neurons triggered in biologically relevant contexts. Ideally, this method should be used to probe the molecular biology of the olfactory system and to study olfactory behaviors.

Investigation of Activated Mouse Olfactory Sensory Neurons via Combined Immunostaining and in situ Hybridization

This protocol combines in situ hybridization with immunofluorescence to identify olfactory and vomeronasal receptor genes expressed in olfactory sensory neurons after activation by chemical stimuli in the mouse.

Animals rely on chemical communication to convey and perceive relevant environmental information, ranging from assessment of food quality to detection of ...

Localização de Genes de Receptor de Odorantes em Antenas de Locustídeo por RNA

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Único Recordings Sensillum na Insetos Drosophila melanogaster E Anopheles gambiae

Multi-unidade Métodos de gravação para caracterizar a atividade neural no Locust (

Preparando a desenvolver tecido olfativo periférico para Molecular e análise imuno-histoquímica em Drosophila

Usando insetos eletroantenogramas Sensores em robôs autônomos para Pesquisas olfativas

Drone bio-híbrido de detecção de odor baseado em eletroantennografia usando antenas de seda para localização de fonte de odor

Detecção de Axonally localizada mRNAs em seções do cérebro Usando de alta resolução

Usando Individual Sensillum Gravação para detectar respostas Olfativo Neurônio de percevejos para Semioquímicos

Viver-pilha medição de odorante Receptor de ativação usando um ensaio de campo em tempo real

Único Sensillum gravações para Locust palpo sensilas Basiconica

Investigation of Activated Mouse Olfactory Sensory Neurons via Combined Immunostaining and in situ Hybridization