Apoio recebido dos Swiss National Science Foundation; o programa Sinergia suíço; os polonês-Swiss investigação programa (PSPB-094/2010); o NCCR em biologia química; e LipidX da iniciativa Suíça SystemsX.ch, avaliada pela Swiss National Science Foundation (a G.). O. M. foi apoiado por uma comunhão de longo prazo EMBO (ALTF-516-2012).

1. soluções e preparações Nota: todos os buffers e soluções devem ser preparadas em bidestilada (dd) H 2 O. Porque varia o estado de hidratação de sacarose, a concentração final de todas as soluções de sacarose deve ser determinada usando um refratômetro.
<ol><li>Preparar fosfato salino sem cátions divalentes (PBS-): 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1,5 mM KH 2 PO 4 e 6,5 mM Na 2 HPO 4. Ajuste o pH para 7,4. Esterilizar em autoclave (1 ciclo a 121 ° C por 15 min) e armazenar à temperatura ambiente.</li>
	<li>Prepare uma solução stock de imidazol 300mm: 0,204 g de imidazol em 10 mL de DDQ 2 O.Adjust o pH para 7,4 a 4 ° C, utilizando HCl. filtro-esterilizar usando um 0,22 μm filtro de tamanho de poros e armazene a 4 ° C.</li>
	Buffer de <li>preparar homogeneização (HB; preparar cerca de 100 mL): sacarose de 250 mM em imidazole de 3 mM. Ajuste o pH para 7,4 a 4 ° C, usando um medidor de pH. Filtro-esterilizar usando um filtro de tamanho de poros de 0,22 μm e armazene a 4 ° C. complemento a HB imediatamente antes da utilização, com um coquetel de inibidores de protease em concentrações finais correspondentes a leupeptin de 10 mM, 1 mM pepstatin A e 10 ng/mL aprotinina.</li>
	<li>Para os gradientes de flutuação de passo, prepare-se 62%, 39% e 35% de sacarose soluções em imidazole de 3 mM, pH 7,4, conforme descrito abaixo. Determinar precisamente a concentração final de todas as soluções de sacarose, usando um refratômetro.
	<ol><li>Preparar 100 mL de solução de sacarose de 62% no imidazole de 3 mM, pH 7,4. Dissolver agitando 80,4 g de sacarose em ddH 2 O pré aquecido a 35 ° C. adicionar 1 mL de solução estoque de imidazol 300mm e fill para 100 mL com DDQ 2 O. ajustar o pH para 7,4 em 4 ° C. Filter-esterilizar usando um 0,22 μm filtro de tamanho de poro e loja a 4 ° C.</li>
		<li>Preparar 100 mL de solução de sacarose de 35% no imidazole de 3 mM, pH 7,4. Dissolver agitando 40,6 g de sacarose em ddH 2 O. adicionar 1 mL de solução-mãe de imidazol 300mm e preencher a 100 mL com DDQ 2 O. ajustar o pH para 7,4 em 4 ° C. Filter-esterilizar usando um 0,22 μm filtro de tamanho de poros e armazene a 4 ° C.</li>
		<li>Preparar 50 mL de 39% de sacarose em imidazole de 3 mM, pH 7,4. Dilua a solução de sacarose de 62% com a solução de sacarose de 35%. Loja a 4 ° C.</li>
	</ol></li> <li>Dissolver 3 g de paraformaldeído (PFA) por agitação em 100 mL de PBS-pré-warmed a 60 ° C, enquanto a adição de 1 M de NaOH gota a gota; ajustar o pH final a 7,4 usando NaOH. Filtro-esterilizar usando um filtro de tamanho de poros de 0,22 μm e armazenar a -20 ° C. 
	Atenção: 3% PFA é um reagente tóxico.</li>
	<li>Solução preparar 1 M KCl. Dissolver 3,73 g de KCl por agitação em 50 mL de DDQ 2 O. Filter-esterilizar usando um filtro de tamanho de poros de 0,22 μm e armazenar à temperatura ambiente.</li>
	<li>Preparar 50 X concentrado de solução contendo 0,625 M Hepes pH 7.0 e 75 mm MgOAc 2 em ddH 2 O. alíquota e loja em -20 ° C.</li>
	<li>Preparar o meio de montagem. Misture mexendo 2,4 g de poly(vinyl alcohol) M w ~ 31.000 (PVA) com 6 g de glicerol. Adicionar 6 mL de DDQ 2 O e deixe pelo menos 2 h à temperatura ambiente. Adicionar 12 mL de 0.2 M Tris-Cl (pH 8,5) e calor para aproximadamente 53 ° C, com ocasionais, mexendo até dissolver o PVA.</li>
	<li>Esclarecer a solução por centrifugação a 5.000 x g por 20 min em temperatura ambiente. Recolher o sobrenadante e adicionar 2,5% (p/v) 1,4 - diazabiciclo-[2.2.2] octano (DABCO) para evitar o fotobranqueamento durante a detecção de fluorescência. Vórtice por cerca de 30 s para dissolver. Alíquota em tubos plásticos de 1,5 mL e loja em -20 ° C.</li>
</ol> 2. Cultura de células <ol><li>células HeLa cultura Dulbecco &#39; s Modified Eagle suplementado com soro fetal bezerro de 10%, 10% não aminoácidos essenciais, 10% L-glutamina e 1% penicilina-estreptomicina. Mantê-los a 37 ° C numa incubadora 5% CO 2.</li>
	<li>Transfect as células 24 h antes do experimento com GFP-RAB5 10, usando o reagente de transfeccao comercial de acordo com o fabricante &#39; instruções de s.</li>
	<li>Quando necessário, preparar CDDP fracções e citoplasma de células empobrecido de uma proteína de interesse (ou seja, usando o RNAi ou CRISPR/Cas9) e/ou superexpressão forma sua ou mutante da proteína de interesse.</li>
</ol> 3. Preparação de fração CDDP Nota: Este protocolo descreve a preparação simples de frações subcelulares contendo endossomos e outras membranas de luz. Se necessário, purificada endossomo frações também podem ser usados 11. Prepare 2 placas de Petri (10 cm diâmetro exterior; 57 cm 2) de confluentes expressando GFP-RAB5 como material de partida. O número total de células de HeLa confluentes em 2 pratos de Petri corresponde aproximadamente 2,5 x 10 7 células. Quando necessário, os endossomos pode também ser preparados de células empobrecidas de uma proteína de interesse (ou seja, usando o RNAi ou CRISPR/Cas9) e/ou superexpressão forma sua ou mutante da proteína de interesse, sempre expressando GFP-RAB5.
 atenção: todas as etapas do protocolo de fracionamento devem ser executadas no gelo
<ol><li>Coloque os pratos de Petri em uma placa de metal molhado em um balde de gelo plano e lave imediatamente as células duas vezes com 5 mL de PBS gelado....</li>
	<li>Retire todos os PBS - a última lavagem e adicionar 3 mL de PBS gelado-por prato. Células não devem secar durante a manipulação: se necessário, coloque o balde de gelo sobre uma plataforma oscilante para cobrir adequadamente as células com fluido.</li>
	<li>Remover mecanicamente as células em PBS desde os pratos de Petri usando um policial de borracha flexível (ou seja, raspador de celular caseiro). Raspe as células fora os pratos primeiro em um rápido movimento circular do lado de fora do prato, seguido de um movimento para baixo no meio do prato. Raspe suavemente para obter &#34; folhas &#34; de células anexadas. Delicadamente, transferir as células usando uma pipeta Pasteur plástica com uma grande abertura para um tubo polipropileno cônico de 15 mL no gelo</li>
	<li>Centrifugue por 5 min a x 175 g e 4 ° C.</li>
	<li>Gentilmente remover o sobrenadante (SN) e adicionar 1-3 mL de HB ao pellet. Usando uma pipeta Pasteur plástica com uma abertura larga, suavemente Pipetar acima e para baixo uma vez para Ressuspender as células.</li>
	<li>Centrífuga para 7-10 min a 1.355 x g e 4 ° C. delicadamente remova o SN.</li>
	<li>Executar homogeneização célula. 
	Nota: Condições devem ser suaves para que as membranas de plasma das células estão quebradas mas os endossomos permanecem intactos.
	<ol><li>Adicionar um volume conhecido de HB com inibidores de protease para cada centrifugado (aproximadamente 100 μL por centrifugado). Suavemente utilizando uma micropipeta de 1.000 µ l, pipete acima e para baixo até que as células são resuspended. Não introduzir bolhas de ar.</li>
		<li>Preparar uma seringa de tuberculina 1 mL com agulha 22g previamente enxaguada com HB e livre de ar ou bolhas.</li>
		<li>Encha a seringa com a suspensão de células relativamente lentamente (para evitar a criação de bolhas de ar), coloque a ponta chanfrada da agulha contra a parede do tubo e expulsar a suspensão de células rapidamente ao cisalhamento fora das membranas de plasma das células anexadas.</li>
		<li>Tomar uma pequena alíquota do homogeneizado (aproximadamente 3 µ l) e diluir em 50 µ l de HB sobre uma lâmina de vidro. Mix e cobrir com uma lamela de vidro. Inspecionar o homogenate sob um microscópio de contraste de fase, equipado com um X de 20 ou 40 objetivo X. 
		Nota: Sob condições ideais, a maioria das células são quebradas, mas não são núcleos que aparecem como cinza escuro e redonda estruturas, ( Figura 1).</li>
		Repita o passo 3.7.3 e 3.7.4 até a maioria das células de <li>está quebrados; geralmente, 3-6 traços ascendentes e descendentes através da agulha são necessários. Manter uma pequena alíquota (10-30 µ l) do homogeneizado para determinação de proteína.</li>
	</ol></li> <li>Centrífuga homogeneizado por 7 min em 1.355 x g e 4 ° C. 
	Nota: após a centrifugação, a pelota (definida como a pelota nuclear; NP) contém os núcleos e o sobrenadante (definido como o sobrenadante pós-nucleares; PNS) contém o citoplasma e as organelas, liberadas após homogeneização e em suspensão livre.</li>
	<li>Recolher cuidadosamente o PNS. Manter pequenas alíquotas (10-30 µ l) do PNS e NP para determinação de proteína e descartar o NP.</li>
	<li>Ajustar o PNS para 40,6% de sacarose, diluindo a solução de sacarose de 62% com PNS usando uma relação de 1:1.1 de PNS:62% de sacarose. Misture delicadamente mas completamente, sem criar bolhas de ar. Verificar a concentração de sacarose usando o refratômetro.</li>
	<li>Lugar o PNS em 40,6% sacarose no fundo de um tubo de ultracentrifugação. Cuidadosamente com 2,5 mL de solução de sacarose a 35% de sobreposição e encher o tubo de centrífuga com HB. 
	Nota: As soluções de sacarose devem ser em camadas para que interfaces são claramente visíveis.</li>
	<li>Se os gradientes por 1h no ̴165, 000 x g e 4 ° C.</li>
	<li>Remova com cuidado a camada branca de lipídios no topo do gradiente. Em seguida, recolher a interface contendo endossomos, entre o HB e 35% de sacarose, utilizando uma micropipeta 200 μL com uma ponta de corte. 
	Nota: As frações CDDP pode ser usadas diretamente no ensaio de polimerização de actina em vitro ou pode ser aliquotadas no gelo, congelado em nitrogênio líquido e armazenado a -80 ° C.</li>
	<li>Determinar a concentração de proteína das frações PNS e CDDP. 
	Nota: Esta concentração deve ser de pelo menos 100 µ g/mL. Aproximadamente 2,5 x 10 7 células cultivadas em 2 placas de Petri são necessárias para obter um PNS pelo menos 100 µ g/mL (ver observação acima).</li>
</ol> 4. Preparação do citosol Nota: preparar 2 placas de Petri (10 cm de diâmetro; 57 cm 2) de células de HeLa confluentes como material de partida. Quando necessário, o citosol também pode ser preparado de células empobrecidas de uma proteína de interesse (ou seja, usando o RNAi ou CRISPR/Cas9) e/ou superexpressão uma sua ou forma mutante da proteína de interesse. Quanto ao protocolo de fraccionamento do endossomo, todas as etapas devem ser executadas no gelo
<ol><li>Repita os passos 3.1-3.8.</li>
	<li>Colocar o PNS num tubo de centrífuga e se por 45 min em ̴250, 000 x g e 4 ° C.</li>
	<li>Cuidadosamente remover a camada branca por cima e coletar o SN (fração do citosol) sem perturbar o sedimento do microsome. Manter uma alíquota da fração citosol para determinação de proteína. 
	Nota: O citosol pode ser usado diretamente no ensaio de polimerização de actina em vitro ou pode ser aliquotadas no gelo, congelado em nitrogênio líquido e armazenado a -80 ° C.</li>
	<li>Determinar a concentração de proteínas do citosol. 
	Nota: Deve ser pelo menos de 3 mg/mL.</li>
</ol> 5. Ensaio de medição de polimerização de actina endossomo-dependente In Vitro Nota: polimerização de actina endossomo-dependente pode ser realizada usando duas abordagens alternativas. Na primeira abordagem, os materiais são misturados em um tubo de ensaio, fixo e transferidos para uma lamela e analisados. Na segunda abordagem, descrita aqui, o ensaio pode ser realizado diretamente na câmara de imagem e pode ser fixo e analisado sem perturbação mecânica ( Figura 2). Nesta segunda abordagem, a mistura de ensaio não é transferida de um tubo de ensaio para uma lamela e assim permanece imperturbável, diminuindo o perigo das redes de F-Actina fisicamente ser perturbado durante a transferência. Além disso, esta segunda abordagem é compatível com uma análise de lapso de tempo de polimerização de F-Actina. Note-se que não há diferença na análise da polimerização de F-Actina foi observada com qualquer abordagem. 
Nota: Uso corte dicas em todo o protocolo.
<ol><li>Em um tubo de ensaio <ol><li>delicadamente mistura gelada purificada GFP-RAB5 endossomos (etapa 3) com o citosol (passo 4) em uma proporção de 01:10 (concentração de proteína) em um tubo de ensaio cónico 1,5 mL gelado. 
		Nota: Um experimento típico é realizado com aproximadamente 40-50 µ l.</li>
		<li>Ajustar a mistura de reação gelada para concentrações finais de KCl (usando a solução KCl 1 M) de 125 mM, 12,5 mM Hepes e 1,5 mM MgOAc 2 (usando o 50 x solução estoque). Em seguida, ajuste a mistura com inibidores de protease para concentrações finais de 10 mM leupeptin, pepstatin de 1 mM A e 10 ng/mL aprotinina. Misture suavemente todos os componentes.</li>
		<li>Coloque o tubo de ensaio contendo a mistura de reação a 37 ° C, sem agitação e incubar durante o tempo desejado. 
		Nota: Normalmente, vai demorar cerca de 3 min para detectar a polimerização de actina no endossomos e 30 min. para a formação de uma extensa rede.</li>
		<li>Ao tempo desejado (i.e., 3 min ou 30 min), parar a reação, colocando o tubo de ensaio no gelo e adicione 1/10 (vol: Vol) da solução pré-resfriada 3% PFA.</li>
		<li>Adicionar 0.3:10 (vol: Vol) de 200 unidades/mL (~6.6 μM) faloidina conjugada com corante vermelho-alaranjado para manchar a actina polimerizada.</li>
		<li>Lugar 12 μL da mistura para 12 μL de meio de montagem de PVA em um slide de vidro micro. Colocar um tampo de coverslipon de vidro 18 x 18 mm 2.</li>
		<li>Analisar a amostra com microscopia confocal.</li>
	</ol></li> <li>Na câmara de imagens <ol><li>para fazer câmaras de imagens microscópicas, utilize plasma limpa por 1 min para limpar uma lamela rodada 18-mm de diâmetro e um diâmetro de 35mm redondo equipado com um fundo de vidro de 20 mm placa de Petri (0.16-0,19 mm).</li>
		<li>Incubar as superfícies limpas com 1% de β-caseína por 20 min minimizar o emperramento da proteína para o vidro. Lave duas vezes com imidazol de 3 mM.</li>
		<li>Add endossomo e citoplasma, no mesmo ensaio mistura como em etapas 5.1.1 e 5.1.2, para um tubo de ensaio pré-resfriado 1,5 mL e complementar a mistura de ensaio com 0,1 μg/μL rodamina-actin.</li>
		<li>Ajustar o índice de refração final da mistura para 1.375 (26,5% de sacarose) usando a solução de sacarose de 39%. 
		Nota: Normalmente, o mesmo volume é adicionado; no entanto, isso tem que ser re-ajustada empiricamente dependendo da concentração de sacarose da fração coletada, determinada usando um refractomer, uma vez que a concentração de sacarose pode alterar um pouco de experimento para experimento.</li>
		<li>Coloque a mistura sobre o prato de 35mm pré-tratamento (etapa 5.2.1) e cubra-o com a lamela de 18mm pré-tratamento (etapa 5.2.1).</li>
		<li>Coloque a câmara a 37 ° C, sem agitação.</li>
		<li>Analisar a amostra usando microscopia de fluorescência confocal.</li>
	</ol></li></ol> 6. Imagem Acquisition e análise de redes de actina <ol><li>aquisição de imagem <ol><li>adquirir as imagens em um microscópio confocal invertido. 
		Nota: Definições de aquisição de imagem foram otimizadas para um invertido microscópio confocal com um objectivo de óleo at 63 X 1,25. Ajustar a potência do laser (geralmente em torno de 50%) para alcançar uma boa relação sinal-ruído.</li>
	</ol></li> <li>Quantificação da rede actina <ol><li>analisar as micrografias fluorescentes. Use o software opensource CellProfiler (2.1.1) 12 para medir a quantidade de actina por endossomo (alternativa de software pode ser usada).
		<ol><li>Em primeiro lugar, identificar endossomos como objeto primário usando o sinal de GFP-RAB5. Em seguida, quantificar a F-Actina associada com endossomos individuais usando a propagação do sinal de actina (corante vermelho-laranja conjugados faloidina) como um objeto secundário.</li>
			<li>Média e normalizar o número de material associado para cada objeto à condição controle.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.

Actina desempenha um papel crucial na endossomo membrana dinâmica4,14. Informamos anteriormente que a polimerização e a nucleação de actina ocorrem em endossomos iniciais, formando pequenas manchas de F-Actina ou redes. Estas redes de F-Actina são absolutamente necessários para o transporte de membrana além endossomos iniciais ao longo da via de degradação. Interferir em qualquer etapa deste processo de nucleação e polimerização impede endossomo mat...

Em células eucarióticas superiores, proteínas e lipídios são internalizados em endossomos iniciais onde ocorre a classificação. Algumas proteínas e lipídios, que são destinados a ser reaproveitado, são incorporados em regiões tubulares dos endossomos iniciais e então transportados para a membrana plasmática ou para o trans-Golgi network (TGN)1,2. Em contraste, outras proteínas e lipídios são seletivamente empacotados em regiões dos endossomos iniciais que exibem uma aparência multivesiculares. Estas regiões expandir e, após descolamento de membranas de CDDP cedo, eventualmente maduro em vesículas de transportadora CDDP livre ou corpos multivesiculares (ECV/MVBs), que são responsáveis para o transporte de carga para tarde endossomos1, 2.
Actina desempenha um papel crucial no processo de remodelação de membrana associado com capacidade de classificação CDDP e biogênese endossomo. Proteína ao longo dos caminhos de reciclagem para a membrana plasmática ou para o TGN depende o retromer complexo e as proteínas associadas. Esta classificação máquinas parecem ser atrelado à formação de reciclagem túbulos através de interações do complexo, o retromer com a vespa e cicatriz homólogo (lavagem) ramificado e complexo actina3,4,5 . Em contraste, as moléculas destinados a degradação, particularmente ativado receptores de sinalização, são classificadas em vesículas intraluminal (ILVs) pelo CDDP classificação complexos necessários para transporte (ESCRT)2,6, 7. Enquanto o possível papel de actina no processo de classificação de ESCRT-dependente não é conhecido, F-Actina desempenha um papel importante na biogênese de ECV/MVBs e no transporte, além de endossomos iniciais. Em particular, encontramos que anexina A2 vincula colesterol enriquecido regiões do endossomo precoce e juntamente com spire1, nucleates polimerização F-Actina. A formação da rede ramificada actina observada no endossomos requer a atividade de ramificação da proteína actina-relacionados (ARP) 2/3 complexo, bem como a moesin de proteína ERM e o emperramento do actínio proteína ciclina8,9.
Aqui, descrevemos um ensaio baseado em microscopia em vitro que reconstitui a nucleação e polimerização de F-Actina nas membranas de CDDP precoce em tubos de ensaio. Este ensaio tem sido usado anteriormente para investigar o papel da anexina A2 na nucleação de F-Actina e da moesin e ciclina na formação da CDDP actina redes8,9. Com este protocolo em vitro , a complexa série de reações que ocorrem na endossomos durante a polimerização de actina tornam-se receptivos à análise bioquímica e molecular das etapas sequenciais do processo, incluindo a nucleação de actina, linear polimerização, ramificação e reticulação.

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71380</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Acros Organics</td><td>196770010</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>AppliChem</td><td>A1042</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Acros Organics</td><td>424370025</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>AppliChem</td><td>A3724</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiun acetate tetrahydrate</td><td>Fluka</td><td>63047</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>AppliChem</td><td>A2948</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10125</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fluka</td><td>71690</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Merck Millipore</td><td>107687</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptin</td><td>Roche</td><td>11017101001</td><td></td></tr><tr><td>Pepstatin</td><td>Roche</td><td>10253286001</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>Roche</td><td>10236624001</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehide</td><td>Polysciences. Inc</td><td>380</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 phalloidin</td><td>Molecular Probes</td><td>A34055</td><td></td></tr><tr><td>Actin rhodamine</td><td>Cytoskeleton. Inc</td><td>APHR-A</td><td></td></tr><tr><td>Mowiol 4-88</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>81381</td><td>poly(vinyl alcohol), Mw ~31 000</td></tr><tr><td>DABCO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-2522</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>AppliChem</td><td>A1086</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-casein</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6905</td><td></td></tr><tr><td>Filter 0.22 &amp;mu;m</td><td>Millex</td><td>SL6V033RS</td><td></td></tr><tr><td>Round 10 cm dishes for cell culture</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>150350</td><td></td></tr><tr><td>Plastic Pasteur pipette</td><td>Assistent</td><td>569/3 40569003</td><td></td></tr><tr><td>15-mL polypropylen tube</td><td>TPP</td><td>91015</td><td></td></tr><tr><td>Hypodermic Needle 22G Black 30mm</td><td>BD Microlance</td><td>300900</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Luer-slip 1mL Syringes without needle</td><td>BD Plastipak</td><td>300013</td><td></td></tr><tr><td>Micro glass slides</td><td>Assistent</td><td>2406</td><td></td></tr><tr><td>18 x 18-mm glass coverslip</td><td>Assistent</td><td>1000/1818</td><td></td></tr><tr><td>SW60 centrifuge tube</td><td>Beckman coulter</td><td>344062</td><td></td></tr><tr><td>TLS-55 centrifuge tube</td><td>Beckman coulter</td><td>343778</td><td></td></tr><tr><td>200-&amp;mu;L yellow tip</td><td>Starlab</td><td>S1111-0706</td><td></td></tr><tr><td>1,000-&amp;mu;L Blue Graduated Tip</td><td>Starlab</td><td>S1111-6801</td><td></td></tr><tr><td>1.5-mL test tube</td><td>Axygen</td><td>MCT-175-C 311-04-051</td><td></td></tr><tr><td>18-mm diameter round coverslip</td><td>Assistent</td><td>1001/18</td><td></td></tr><tr><td>35-mm diameter round dish with a 20-mm glass bottom (0.16 - 0.19 mm)</td><td>In vitro Scientific</td><td>D35-20-1.5-N</td><td></td></tr><tr><td>Refractometer</td><td>Carl Zeiss</td><td>79729</td><td></td></tr><tr><td>Plasma cleaner</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-32G</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall WX80 Ultracentrifuge</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>46900</td><td></td></tr><tr><td>Tabletop ultracentrifuge</td><td>Beckman coulter</td><td>TL-100</td><td></td></tr><tr><td>SW60 rotor</td><td>Beckman coulter</td><td>335649</td><td></td></tr><tr><td>TLS-55 rotor</td><td>Beckman coulter</td><td>346936</td><td></td></tr><tr><td>Confocal microscopy</td><td>Carl Zeiss</td><td>LSM-780</td><td></td></tr><tr><td>Fugene HD transfection reagent</td><td>Promega</td><td>E2311</td><td></td></tr><tr><td>Protein assay reagent A</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0113</td><td></td></tr><tr><td>Protein assay reagent B</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0114</td><td></td></tr><tr><td>Protein assay reagent S</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0115</td><td></td></tr><tr><td>Cell scraper</td><td>Homemade</td><td></td><td>Silicone rubber piece of about 2 cm, cut at a very sharp angle and attached to a metal bar or held with forceps</td></tr><tr><td>Refractometer</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Minimum Essential Medium Eagle (MEM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0643</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>pH Meter 691</td><td>Metrohm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ software</td><td></td><td></td><td>NIH, Bethesda MD</td></tr></tbody></table>

in vitro polymerization of f-actin on early endosomes

Muitas funções endossomo precoce, particularmente carga proteína classificação e membrana deformação, dependem de patches de curto F-Actina filamentos nucleated na membrana da CDDP. Nós estabelecemos um ensaio baseado em microscopia em vitro que reconstitui a nucleação e polimerização de F-Actina nas membranas de CDDP precoce em tubos de ensaio, tornando assim esta complexa série de reações passíveis de genética e bioquímica manipulações. CDDP frações são preparadas pela flutuação em gradientes de sacarose de celulas que expressam a início CDDP proteína GFP-RAB5. Citosólica frações são preparadas a partir de lotes separados das células. Tanto CDDP e citosólica frações podem ser armazenadas congelados em nitrogênio líquido, se necessário. No ensaio, o CDDP e frações citosólica são misturadas, e a mistura é incubada a 37 ° C, sob condições adequadas (por exemplo, força iônica, reduzindo o ambiente). No momento desejado, a mistura de reação é fixo, e a F-Actina é revelado com faloidina. Polimerização e nucleação de actina são então analisados por microscopia de fluorescência. Aqui, nós relatamos que este ensaio pode ser usado para investigar o papel dos fatores que estão envolvidos na nucleação de actina na membrana, ou no subsequente alongamento, ramificação ou reticulação de filamentos de actina-F.

Para obter insights sobre a formação de manchas de F-Actina nas membranas de endossomo precoce, seguimos o protocolo descrito na Figura 2. Resumidamente, as células foram transfectadas com GFP-RAB5 e então endossomos iniciais foram preparados pelo fraccionamento subcelular. Estes purificada endossomos iniciais foram incubados com o citosol a fim de proporcionar a actina, em si, bem como outros fatores possivelmente envolvidos na reação. No final do per?...

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In Vitro Polymerization of F-actin on Early Endosomes

Funções de endossomo precoce dependem de polimerização de F-Actina. Aqui, descrevemos um ensaio baseado em microscopia em vitro que reconstitui a nucleação e polimerização de F-Actina nas membranas de CDDP precoce em tubos de ensaio, tornando assim esta complexa série de reações passíveis de bioquímicos e genéticos manipulações.

In Vitro Polimerização de F-Actina no início endossomos

Many early endosome functions, particularly cargo protein sorting and membrane deformation, depend on patches of short F-actin filaments nucleated onto ...

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In Vitro Polymerization of F-actin on Early Endosomes

Unit 1

The Cytoskeleton I: Actin and Microfilaments

SCIENTISTS IN ACTION

9.0K visualizações.  University of Geneva. Funções de endossomo precoce dependem de polimerização de F-Actina. Aqui, descrevemos um ensaio baseado em microscopia em vitro que reconstitui a nucleação e polimerização de F-Actina nas membranas de CDDP precoce em tubos de ensaio, tornando assim esta complexa série de reações passíveis de bioquímicos e genéticos manipulações.

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Monitoring Actin Disassembly with Time-lapse Microscopy

Okay, so what I'd like to do today is to show you how to construct a flow chamber, a fusion chamber for imaging on an upright microscope. What then I then do is I create two spaces using film. So what I do is I take the para film, I cut it into small strips.Next I'm going to, this will basically form the channels for the, the walls, and I dry them with a tilted air. I put the cover slip on top of the para, And here's the finished. Then I heat it on a heat block to melt the param and basically create a seal.So what this is, is the, the cover glass here, and then on top of the cover glass is two layers of phim as you see right here. And then on top of this, again, there's a, it's a 22 by two two mil meter cover slip. This one right here, which I pressed against the param to fall the seal.Okay, so the liquid goes in in one direction here and I can suck it out with a filter paper here in this direction. And I'll show you how to do that in a bit. So what I like to do is I like to put it in a humidified chamber, which is very simple.Take two kind of elevated strips and have a filter of paper underneath. And to keep it noisy as I, I put the cover, cover slip on the flow chamber on. Now the way you introduce a solution to the chamber is that you just put the pipet tip at the entrance of the chamber and you just split.Now what I do is I incubate the chamber with the lid closed for 10 minutes. What I usually do to suck the liquid out from the other side is to use it, get a filter paper and cut it into thin strips like this. And I take one of these thin strips and I simultaneously apply the solution into the entrance while putting the filter paper at the exit to suck the exchange, the solution.So you'll see the liquid flowing through the solution. And then I wait for five minutes for the mid close. Now what I'm ready to do is to actually put that the actin it and the actin, I actually have to polymerize, I polymerize inside the flow chamber and it's just the same procedures before.So because like this, and then now that the action is polymerized, I wash out all the un excess un polymerized action using a large volume of just buffer. So here I have about a hundred microliters and it's a few reaction chamber volumes worth of buffer. Just, you know, when the filter paper becomes saturated, I have to change the direction.Okay?And so I'm ready to do imaging with this. So perfusion chamber with actin attached to it. Now I take the slide, mount it under the microscope, and since I'm imaging with an oil objective, I'm gonna put some immersion oil on the top surface of the cover, grass touch, such so assess solution or protein or anything on acting inside.So what I do is I can actually exchange the solution side while I'm doing the time lapse imaging. As such.

Monitoramento Actina Desmontagem com a Time-lapse Microscopia

Biologia

Labeling F-actin Barbed Ends with Rhodamine-actin in Permeabilized Neuronal Growth Cones

The motile tips of growing axons are called growth cones. Growth cones lead navigating axons through developing tissues by interacting with locally expressed molecular guidance cues that bind growth cone receptors and regulate the dynamics and organization of the growth cone cytoskeleton3-6. The main target of these navigational signals is the actin filament meshwork that fills the growth cone periphery and that drives growth cone motility through continual actin polymerization and dynamic remodeling7. Positive or attractive guidance cues induce growth cone turning by stimulating actin filament (F-actin) polymerization in the region of the growth cone periphery that is nearer the source of the attractant cue. This actin polymerization drives local growth cone protrusion, adhesion of the leading margin and axonal elongation toward the attractant.
Actin filament polymerization depends on the availability of sufficient actin monomer and on polymerization nuclei or actin filament barbed ends for the addition of monomer. Actin monomer is abundantly available in chick retinal and dorsal root ganglion (DRG) growth cones. Consequently, polymerization increases rapidly when free F-actin barbed ends become available for monomer addition. This occurs in chick DRG and retinal growth cones via the local activation of the F-actin severing protein actin depolymerizing factor (ADF/cofilin) in the growth cone region closer to an attractant8-10. This heightened ADF/cofilin activity severs actin filaments to create new F-actin barbed ends for polymerization. The following method demonstrates this mechanism. Total content of F-actin is visualized by staining with fluorescent phalloidin. F-actin barbed ends are visualized by the incorporation of rhodamine-actin within growth cones that are permeabilized with the procedure described in the following, which is adapted from previous studies of other motile cells11, 12. When rhodamine-actin is added at a concentration above the critical concentration for actin monomer addition to barbed ends, rhodamine-actin assembles onto free barbed ends. If the attractive cue is presented in a gradient, such as being released from a micropipette positioned to one side of a growth cone, the incorporation of rhodamine-actin onto F-actin barbed ends will be greater in the growth cone side toward the micropipette10.
Growth cones are small and delicate cell structures. The procedures of permeabilization, rhodamine-actin incorporation, fixation and fluorescence visualization are all carefully done and can be conducted on the stage of an inverted microscope. These methods can be applied to studying local actin polymerization in migrating neurons, other primary tissue cells or cell lines.

A method to visualize and quantify F-actin barbed ends in neuronal growth cones is described. After culturing neurons on glass coverslips, cells are permeabilized with a saponin-containing solution. Then, a short incubation with the saponin buffer containing rhodamine-actin incorporates fluorescent actin onto free actin barbed ends.

Rotulagem F-actina Termina farpado com Rodamina-actina em permeabilizadas Cones de Crescimento Neuronal

The motile tips of growing axons are called growth cones. Growth cones lead navigating axons through developing tissues by interacting with locally ...

Neurociência

Using Microfluidics and Fluorescence Microscopy to Study the Assembly Dynamics of Single Actin Filaments and Bundles

In order to decipher the complex molecular mechanisms that regulate the assembly and disassembly of actin filaments, it is a great asset to monitor individual reactions live in well-controlled conditions. To do so, live single-filament experiments have emerged over the past 20 years, mostly using total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy, and have provided a trove of key results. In 2011, in order to further expand the possibilities of these experiments and to avoid recurring problematic artifacts, we introduced simple microfluidics in these assays. This study details our basic protocol, where individual actin filaments are anchored by one end to the passivated coverslip surface, align with the flow, and can be successively exposed to different protein solutions. We also present the protocols for specific applications and explain how controlled mechanical forces can be applied, thanks to the viscous drag of the flowing solution. We highlight the technical caveats of these experiments and briefly present possible developments based on this technique. These protocols and explanations, along with today&#39;s availability of easy-to-use microfluidics equipment, should allow non-specialists to implement this assay in their labs.

We present protocols for simple actin filament microfluidic assays, in combination with fluorescence microscopy, that allow one to accurately monitor individual actin filaments in real-time while sequentially exposing them to different protein solutions.

Usando Microfluidos e Microscopia de Fluorescência para Estudar a Dinâmica de Montagem de Filamentos e Pacotes de Actin Único

In order to decipher the complex molecular mechanisms that regulate the assembly and disassembly of actin filaments, it is a great asset to monitor ...

Bioquímica

Visualizing Actin and Microtubule Coupling Dynamics In Vitro by Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy

Traditionally, the actin and microtubule cytoskeletons have been studied as separate entities, restricted to specific cellular regions or processes, and regulated by different suites of binding proteins unique for each polymer. Many studies now demonstrate that the dynamics of both cytoskeletal polymers are intertwined and that this crosstalk is required for most cellular behaviors. A number of proteins involved in actin-microtubule interactions have already been identified (i.e., Tau, MACF, GAS, formins, and more) and are well characterized with regard to either actin or microtubules alone. However, relatively few studies showed assays of actin-microtubule coordination with dynamic versions of both polymers. This may occlude emergent linking mechanisms between actin and microtubules. Here, a total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy-based in vitro reconstitution technique permits the visualization of both actin and microtubule dynamics from the one biochemical reaction. This technique preserves the polymerization dynamics of either actin filament or microtubules individually or in the presence of the other polymer. Commercially available Tau protein is used to demonstrate how actin-microtubule behaviors change in the presence of a classic cytoskeletal crosslinking protein. This method can provide reliable functional and mechanistic insights into how individual regulatory proteins coordinate actin-microtubule dynamics at a resolution of single filaments or higher-order complexes.

Visualizing Actin and Microtubule Coupling Dynamics In Vitro by Total Internal Reflection Fluorescence TIRF Microscopy

This protocol is a guide for visualizing dynamic actin and microtubules using an in vitro total internal fluorescence (TIRF) microscopy assay.

Visualizando a dinâmica de acoplamento de actina e microtúbula in vitro por microscopia de fluorescência interna total (TIRF)

Traditionally, the actin and microtubule cytoskeletons have been studied as separate entities, restricted to specific cellular regions or processes, and ...

In Vitro Reconstitution of the Actin Cytoskeleton Inside Giant Unilamellar Vesicles

The actin cytoskeleton, the principal mechanical machinery in the cell, mediates numerous essential physical cellular activities, including cell deformation, division, migration, and adhesion. However, studying the dynamics and structure of the actin network in vivo is complicated by the biochemical and genetic regulation within live cells. To build a minimal model devoid of intracellular biochemical regulation, actin is encapsulated inside giant unilamellar vesicles (GUVs, also called liposomes). The biomimetic liposomes are cell-sized and facilitate a quantitative insight into the mechanical and dynamical properties of the cytoskeleton network, opening a viable route for bottom-up synthetic biology. To generate liposomes for encapsulation, the inverted emulsion method (also referred to as the emulsion transfer method) is utilized, which is one of the most successful techniques for encapsulating complex solutions into liposomes to prepare various cell-mimicking systems. With this method, a mixture of proteins of interest is added to the inner buffer, which is later emulsified in a phospholipid-containing mineral oil solution to form monolayer lipid droplets. The desired liposomes are generated from monolayer lipid droplets crossing a lipid/oil-water interface. This method enables the encapsulation of concentrated actin polymers into the liposomes with desired lipid components, paving the way for in vitro reconstitution of a biomimicking cytoskeleton network.

In Vitro Reconstitution of the Actin Cytoskeleton Inside Giant Unilamellar Vesicles

In this manuscript, we demonstrate the experimental techniques to encapsulate the F-actin cytoskeleton into giant unilamellar lipid vesicles (also called liposomes), and the method to form a cortex-biomimicking F-actin layer at the inner leaflet of the liposome membrane.

In vitro Reconstituição do Actin Cytoskeleton Dentro de Vesículos Gigantes Unilamellar

The actin cytoskeleton, the principal mechanical machinery in the cell, mediates numerous essential physical cellular activities, including cell ...

Bioengenharia

Reconstitution of Actin-Based Motility with Commercially Available Proteins

Many cell movements and shape changes and certain types of intracellular bacterial and organelle motility are driven by the biopolymer actin that forms a dynamic network at the surface of the cell, organelle, or bacterium. The biochemical and mechanical basis of force production during this process can be studied by reproducing actin-based movement in an acellular manner on inert surfaces such as beads that are functionalized and incubated with a controlled set of components. Under the appropriate conditions, an elastic actin network assembles at the bead surface and breaks open due to the stress generated by network growth, forming an "actin comet" that propels the bead forward. However, such experiments require the purification of a host of different actin-binding proteins, often putting them beyond the reach of non-specialists. This article details a protocol for reproducibly obtaining actin comets and motility of beads using commercially available reagents. Bead coating, bead size, and motility mixture can be altered to observe the effect on bead speed, trajectories, and other parameters. This assay can be used for testing the biochemical activities of different actin-binding proteins, and for performing quantitative physical measurements that shed light on active matter properties of actin networks. This will be a useful tool for the community, enabling the study of in vitro actin-based motility without expert knowledge in actin-binding protein purification.

This protocol describes how to produce actin comets on the surfaces of beads using commercially available protein ingredients. Such systems mimic the protrusive structures found in cells, and can be used to examine physiological mechanisms of force production in a simplified way.

Reconstituição da Motilidade à Base de Actina com Proteínas Comercialmente Disponíveis

Many cell movements and shape changes and certain types of intracellular bacterial and organelle motility are driven by the biopolymer actin that forms a ...

A Time-Efficient Fluorescence Spectroscopy-Based Assay for Evaluating Actin Polymerization Status in Rodent and Human Brain Tissues

Actin, the major component of cytoskeleton, plays a critical role in the maintenance of neuronal structure and function. Under physiological states, actin occurs in equilibrium in its two forms: monomeric globular (G-actin) and polymerized filamentous (F- actin). At the synaptic terminals, actin cytoskeleton forms the basis for critical pre- and post-synaptic functions. Moreover, dynamic changes in the actin polymerization status (interconversion between globular and filamentous forms of actin) are closely linked to plasticity-related alterations in synaptic structure and function. We report here a modified fluorescence-based methodology to assess polymerization status of actin in ex vivo conditions. The assay employs fluorescently labelled phalloidin, a phallotoxin that specifically binds to actin filaments (F-actin), providing a direct measure of polymerized filamentous actin. As a proof of principle, we provide evidence for the suitability of the assay both in rodent and post-mortem human brain tissue homogenates. Using latrunculin A (a drug that depolymerizes actin filaments), we confirm the utility of the assay in monitoring alterations in F-actin levels. Further, we extend the assay to biochemical fractions of isolated synaptic terminals wherein we confirm increased actin polymerization upon stimulation by depolarization with high extracellular K+.

We report a simple, time-efficient and high-throughput fluorescence spectroscopy-based assay for the quantification of actin filaments in ex vivo biological samples from brain tissues of rodents and human subjects.

Um ensaio baseado em espectroscopia de fluorescência com eficiência temporal para avaliar o status de polimerização de actina em roedores e tecidos cerebrais humanos

Actin, the major component of cytoskeleton, plays a critical role in the maintenance of neuronal structure and function. Under physiological states, actin ...

Reconstitution of Membrane-Tethered Minimal Actin Cortices on Supported Lipid Bilayers

The surface of a living cell provides a versatile active platform for numerous cellular processes, which arise from the interplay of the plasma membrane with the underlying actin cortex. In the past decades, reconstituted, minimal systems based on supported lipid bilayers in combination with actin filament networks have proven to be very instrumental in unraveling basic mechanisms and consequences of membrane-tethered actin networks, as well as in studying the functions of individual membrane-associated proteins. Here, we describe how to reconstitute such active composite systems in vitro that consist of fluid supported lipid bilayers coupled via membrane-associated actin-binding proteins to dynamic actin filaments and myosin motors that can be readily observed via total internal reflection fluorescence microscopy. An open-chamber design allows one to assemble the system in a step-by-step manner and to systematically control many parameters such as linker protein concentration, actin concentration, actin filament length, actin/myosin ratio, as well as ATP levels. Finally, we discuss how to control the quality of the system, how to detect and troubleshoot commonly occurring problems, and some limitations of this system in comparison with the living cell surface.

This protocol describes the formation of supported lipid bilayers and the addition of cytoskeletal filaments and motor proteins to study the dynamics of reconstituted, membrane-tethered cytoskeletal networks using fluorescence microscopy.

Reconstituição de Córtices de Actina Mínima Amarrados à Membrana em Bicamadas Lipídicas Suportadas

The surface of a living cell provides a versatile active platform for numerous cellular processes, which arise from the interplay of the plasma membrane ...

Reconstituting and Characterizing Actin-Microtubule Composites with Tunable Motor-Driven Dynamics and Mechanics

The composite cytoskeleton, comprising interacting networks of semiflexible actin filaments and rigid microtubules, restructures and generates forces using motor proteins such as myosin II and kinesin to drive key processes such as migration, cytokinesis, adhesion, and mechanosensing. While actin-microtubule interactions are key to the cytoskeleton's versatility and adaptability, an understanding of their interplay with myosin and kinesin activity is still nascent. This work describes how to engineer tunable three-dimensional composite networks of co-entangled actin filaments and microtubules that undergo active restructuring and ballistic motion, driven by myosin II and kinesin motors, and are tuned by the relative concentrations of actin, microtubules, motor proteins, and passive crosslinkers. Protocols for fluorescence labeling of the microtubules and actin filaments to most effectively visualize composite restructuring and motion using multi-spectral confocal imaging are also detailed. Finally, the results of data analysis methods that can be used to quantitatively characterize non-equilibrium structure, dynamics, and mechanics are presented. Recreating and investigating this tunable biomimetic platform provides valuable insight into how coupled motor activity, composite mechanics, and filament dynamics can lead to myriad cellular processes from mitosis to polarization to mechano-sensation.

This paper presents protocols for engineering and characterizing tunable three-dimensional composite networks of co-entangled actin filaments and microtubules. Composites undergo active restructuring and ballistic motion, driven by myosin II and kinesin motors, and are tuned by the relative concentrations of actin, microtubules, motor proteins, and passive crosslinkers.

Reconstituindo e caracterizando compósitos de actina-microtúbulo com dinâmica e mecânica sintonizáveis acionadas por motor

The composite cytoskeleton, comprising interacting networks of semiflexible actin filaments and rigid microtubules, restructures and generates forces ...

Actin Polymerization and Cell Motility

Actin is a family of globular proteins that are highly abundant in eukaryotic cells. It makes up approximately 1-5% of total cell protein concentration. Actin monomers polymerize to form a complex network of polarized filaments, the actin cytoskeleton, that plays a crucial role in many cellular processes, including cell motility, division, endocytosis, and metastasis of cancer cells.
Actin cytoskeleton dynamics can produce pushing, pulling, and resistance forces that help the cell to migrate. This is achieved by forming different types of membrane protrusions, depending on the cell type and the extracellular signals. Primarily, cells move by recurrent cycles of protrusion and attachment of the cell front to the substratum, followed by detachment and retraction at their rear end.
The human genome encodes six highly conserved actin proteins&#8212;ACTC1, ACTA1, ACTA2, ACTG1, ACTG2, and ACTB; all expressed in different cell types. Mutations in any of these six actin genes or the genes encoding actin-binding proteins can lead to disease. For example, mutations in the ACTA1 gene can lead to muscle weakness, especially in the respiratory muscles, which can cause breathing difficulties &#8212; a condition called Nemaline Myopathy. Similarly, mutations in the WAS gene, a key regulator of actin filament nucleation, which is important for cell adhesion, chemotaxis, and phagocytosis of immune cells, causes Wiskott Aldrich syndrome in humans.

Polimerização da Actina e Motilidade Celular

Actin is a family of globular proteins that are highly abundant in eukaryotic cells. It makes up approximately 1-5% of total cell protein concentration. ...