MT Holley é apoiado pelo programa Graduate Fellows da Louisiana Board of Regents, e C. Danielson é apoiado pelo Programa de Professores do Instituto Médico Howard Hughes. Este estudo é apoiado pelo NSF Grant No: 1530884.

Todos os procedimentos aqui descritos foram realizados utilizando um protocolo aprovado e de acordo com os regulamentos do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Notre Dame. 1. Semente e Cultura de Células <ol><li> Antes de iniciar, prepare os itens necessários: um pequeno funil, pipetas e meio de Eagle modificado Dulbecco morno (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de antibiótico penicilina (DMEM completo). </li><li> Tome frascos T-25 juntamente com o dispositivo funcionalizado (atuador biológico ou biorobot) dentro dele. Consulte a seção 4 da Parte 1 deste manuscrito em duas partes para obter detalhes sobre a preparação do dispositivo, a funcionalização e o armazenamento antes da semeadura celular. </li><li> Prepare um funil, que pode ser feito rolando uma pequena folha quadrada de plástico. Coloque-o sobre o atuador biológico ou biorobot dentro do frasco T-25. Ajuste o diâmetro da extremidade mais larga para ajustar o dispositivo inteiroE a altura de modo a que encaixe confortavelmente quando o topo do balão é apertado. <ol><li> Para os biorobôs, use um íman para manter o dispositivo no lugar no fundo do frasco durante todo o processo de semeadura. Nota: Aqui, um único ímã de disco de neodímio (1,26 &quot;de diâmetro) foi usado, mas qualquer ímã de tamanho e força semelhantes também pode ser usado para manter o biorobot com a base compósita magnética de níquel-PDMS. </li><li> UV esterilizar a folha de plástico por pelo menos 30 min antes da utilização. </li></ol></li><li> Certifique-se de que não haja um grande espaço entre a base do funil eo balão. </li><li> Ressuspender os cardiomiócitos em DMEM completo a uma densidade de 1,6 x 10 7 células / mL e deixar cair lentamente 400 μL de suspensão para o dispositivo através do funil. Use um hemocitômetro ou qualquer outro contador de células para determinar o número de células obtidas. </li><li> Lentamente mover o sistema de volta para a incubadora sem perturbar o dispositivo eo funil witHin. Cultura durante 24 h a 37 ° C. </li><li> Após o período de incubação, retire lentamente o funil, lave cuidadosamente a amostra com PBS, e reabasteça o balão com 10 mL de DMEM fresco completo. Nota: Para os biorobôs, remova o íman para que o dispositivo flutue. </li></ol> 2. Caracterização bioquímica <ol><li> Ensaio de fluxo de cálcio Nota: O ensaio de fluxo de cálcio é realizado para avaliar a interconectividade das células. O procedimento para carregar as células com o corante fluorescente, específico do ião cálcio, segue o processo descrito num protocolo previamente estabelecido 11 . <ol><li> Primeiro, prepare os materiais requeridos, éster de fluo-4-acetometil (AM) de cálcio, poliol surfactante não iónico (ver Tabela de Materiais ) e solução de sal de Tyrode. </li><li> Usando pinças longas, transferir suavemente o dispositivo do frasco de cultura para uma placa de Petri de 35 mm com 2 mL de solução salina de Tyrode<html> Ção. </li><li> Em um tubo de centrífuga separado, tomar 1 mL de solução de Tyrode quente (aquecida a 37 ° C) e adicionar 3-5 μL de corante de cálcio fluo-4 AM (concentração de trabalho: 3-5 μM) e uma parte igual de surfactante não iónico Poliol (concentração de trabalho: 0,2%). Substituir a solução da amostra por uma solução quente de Tyrode suplementada com o corante indicador de cálcio, fluo-4 e 0,2% de surfactante não iónico. Incubar durante 25 - 30 min a 37 ° C. </li><li> Remover a solução de corante e lavar cuidadosamente a amostra com a solução fresca de Tyrode. Re-incubar a amostra em 2 mL de DMEM fresco completo durante mais 30 min a 37 ° C antes da imagem. Nota: Os resultados deste ensaio e vídeo relacionados são fornecidos no trabalho publicado anteriormente 7 . </li></ol></li><li> Imunofluorescência Nota: A imunocoloração dupla de todas as amostras foi realizada seguindo o protocolo previamente estabelecido&gt; 12. <ol><li> Primeiro, preparar 10% de soro de cabra (GS) em solução salina tamponada com fosfato (PBS), paraformaldeído a 4% (PFA) em diH2O, 0,1% de detergente de lise celular (ver Tabela de Materiais ) em PBS, anticorpos primários Anticorpos monoclonais de murganho monoclonal cardíaco troponina I e anticorpos monoclonais anti-coelho conexinas 43), anticorpos secundários (conjugado Alexa 594 e conjugado de cabra anti-IgG de rato anti-IgG de rato (Alexa 488) e DAPI. Cuidado: Paraformaldeído é cancerígeno. </li><li> Remover a amostra de interesse do balão e lavá-la suavemente duas vezes com PBS. Consulte a seção 4 na Parte 1 deste manuscrito em duas partes para obter detalhes sobre a preparação da amostra e a sua funcionalização. </li><li> Adicione uma gotícula de PBS em uma pequena lamela (diâmetro: 12 mm ou 15 mm). Segure delicadamente a base do dispositivo com uma pinça e corte os braços PDMS finos (cantilever, Figura 1 ) usando tesouras da extremidade onde se conecta ao topo da baseE. Transfira os braços cantilever para a gotícula com o lado aderente à célula voltado para cima. A gota de PBS impedirá que as células seque. </li><li> Fixar as amostras com PFA a 4% e realizar a imunomarcação dupla das amostras, como descrito anteriormente 12 . </li><li> Após a imunocoloração, montar as amostras em uma lâmina de vidro limpo usando anti-fade montagem reagente e reservado, sem ser perturbado, no escuro por 24 h. </li><li> Repita o procedimento para todas as amostras. Nota: Os resultados deste ensaio e as imagens relacionadas são discutidos em profundidade no trabalho previamente publicado 7 . </li></ol></li></ol> 3. Imagens <ol><li> Colocar o frasco T-25 ereto numa incubadora de CO 2 e preparar o sistema de imagem dentro da incubadora. Grave o dispositivo usando uma câmera (consulte a Tabela de Materiais ) com uma lente de zoom (consulte a Tabela de Materiais ). Para uma fonte de luz,Use uma faixa de luzes LED. Nota: Uma tira de LEDs de luz branca foi usada aqui, mas qualquer LED normal também funcionará. </li><li> Conecte a câmera a um sistema operacional e abra o software específico da câmera (consulte a Tabela de Materiais ). Clique na imagem da câmera embaixo da guia &quot;Arquivo&quot;, no painel superior, para abrir todas as opções da câmera e escolha a câmera correta. </li><li> Escolha &quot;live&quot; na lista de guias no painel superior dentro do software. </li><li> Coloque manualmente a imagem em foco, ajustando o mostrador da lente. Selecione &quot;Cortar para a região de interesse (ROI)&quot; no painel superior. Em seguida, desenhe manualmente um retângulo na moldura de vídeo, encerrando o dispositivo de atuador biológico e os braços em consola, para marcar o ROI. Nota: Escolher um ROI adequado minimiza o tamanho dos ficheiros de imagem. <ol><li> No caso de biorobots, capturar toda a tela, a fim de gravar o movimento de natação do dispositivo. NOTA: Não há necessidade de desenhar um ROI para os biorobôs </li></ol></li><li> Antes de iniciar a gravação, selecione &quot;Configurações da câmera&quot; em uma das guias no painel superior da tela. Defina a taxa de quadros ajustando a relação de exposição e pixel da imagem ao vivo, deslizando a barra para cada um ou inserindo manualmente os valores. Defina as taxas de quadros para cerca de 30 ± 2 fps. Nota: Alterar a relação de exposição e pixel altera o brilho eo contraste da imagem ao vivo. </li><li> Clique no botão &quot;Gravar&quot; do painel superior do software para começar a gravar os vídeos dos atuadores com resolução de 1.000 x 1.000 pixels para precisamente 30 s. Repita o processo para todas as amostras. </li></ol> 4. Análise de imagem dos atuadores biológicos em uma base estacionária <ol><li> Analise as imagens usando um software de programação ( por exemplo, Matlab) executando o script personalizado. Veja a Tabela de Materiais </stRong&gt; eo Arquivo Suplementar para mais detalhes. Nota: O script exibe cada quadro dos vídeos gravados, recebe a entrada do mouse do usuário para registrar a coordenação dos pontos do cantilever nas imagens, calcula o diâmetro e o centro do círculo que passa os pontos introduzidos por meio do encaixe pelo menos quadrado e Exporta todos os dados introduzidos e calculados para utilização posterior. <ol><li> Abra o software de programação clicando no ícone. Clique em &quot;Arquivo&quot; -&gt; &quot;Abrir&quot; na barra de menu na parte superior e selecione o arquivo de script .m para análise de imagem. Verifique se as imagens TIFF gravadas estão na mesma pasta que o arquivo .m. Clique em &quot;Executar&quot; para executar o script. Nota: Uma tela interativa aparecerá para alterar. </li><li> Pressione &quot;play&quot; para iniciar o programa real. Clique no botão &quot;abrir&quot; e localize o arquivo TIFF que vai ser analisado. </li><li> Clique no botão &quot;base &amp; #34; Botão e, em seguida, clique no ponto onde o cantilever atribui à base no topo; Pressione Enter. Isto irá colocar um marcador quadrado na imagem para cada quadro para denotar a localização da base cantilever. </li><li> Clique no botão &quot;Escala&quot; e, em seguida, clique manualmente em uma borda do grânulo de vidro. Traga o ponteiro do mouse para o lado oposto da conta de vidro e pressione &quot;Enter&quot;. Nota: Isto deve traçar uma linha que mede o diâmetro do cordão de vidro. Uma vez que o rebordo de vidro tem 3 mm de diâmetro, isto irá relacionar 3 mm com os pixels apresentados. </li><li> Clique no botão &quot;Analisar&quot;. Clique ao longo do cantilever a uma curta distância do primeiro marcador quadrado que representa a base cantilever. </li><li> Clique no botão &quot;Analisar&quot;. Em seguida, clique ao longo do cantilever a uma curta distância do primeiro marcador quadrado que representa a base cantilever. Continue a clicar ao longo do cantilever, incluindo a ponta, e pressione enter quandofeito. Isto colocará um &quot;x&quot; em cada ponto clicado no cantilever. Nota: Com base na coordenação do marcador quadrado e nos marcadores x, o centro e o diâmetro de um círculo serão calculados usando uma função de encaixe pelo menos quadrada (consulte o arquivo suplementar anexado para o script utilizado). O círculo, que passa os marcadores x eo criador de quadrados, será sobreposto automaticamente à imagem. </li><li> Verifique se o círculo sobreposto traça corretamente o perfil do cantilever. Nota: Quando o cantilever é muito plano, é difícil julgar se o perfil do cantilever é traçado corretamente. Consulte a Figura 3 . </li><li> Clique no botão &quot;próximo quadro&quot;. Isto irá mudar para o próximo quadro no ficheiro TIFF. A base ea escala já estão definidas a partir da etapa anterior. </li><li> Repita as etapas 4.1.5 até 4.1.7 até que todos os quadros no arquivo TIFF tenham sido concluídos. Uma vez que todos os quadros foram proceSsed, clique no botão &quot;Exportar&quot;. Nota: Isso fará um arquivo de planilha com o nome do arquivo TIFF para o cantilever que acabou de ser analisado. Edite o nome do arquivo para incluir qual lado (esquerdo ou direito) do cantilever foi analisado. </li></ol></li><li> Calculando o estresse na planilha. <ol><li> Calcule a tensão superficial &quot;σ&quot; no cantilever usando a seguinte equação: <img alt="Equação 1" src="/files/ftp_upload/55643/55643eq1.jpg" /> Onde E, R, v e h são o módulo de Young, o raio de curvatura, a razão de Poisson ea espessura em consola, respectivamente. Nota: A espessura do cantilever pode ser alterada para alterar a sensibilidade. Neste estudo, os valores foram os seguintes: E = 750 kPa, v = 0,49 e h = 25 μm 13 , 14 . </li><li> Calcular a tensão superficial utilizando a equação do passo 4.2.1. Abra o .Xls arquivo de planilha. Observe que a saída tem várias colunas mostrando primeiro as coordenadas x e y de base e círculo e, em seguida, o raio de curvatura. Calcule as coordenadas xey de cada ponto clicado com base nestes. Nota: A representação gráfica das tensões sobre os quadros de imagem de intervalo de tempo mostra mudanças na força exercida sobre o cantilever ao longo do tempo. As depressões mostram o estresse sobre o cantilever durante o relaxamento dos cardiomiócitos ou a tensão estática exercida sobre o cantilever devido às forças de tração celular. Os picos mostram o estresse dinâmico no cantilever, que foi exercido pelo batimento dos cardiomiócitos. Este valor corresponde à quantidade máxima de força gerada pela contracção dos cardiomiócitos. </li></ol></li></ol> 5. Análise de Natação Biorobots <ol><li> Registre a posição do biorobot usando o software de análise de imagens. Nota: Consulte a lista de Materiais para o softwareÉ seção. <ol><li> Abra o software de análise de imagem ( por exemplo, ImageJ). Pressione &quot;Arquivo&quot; e &quot;Abrir&quot; e selecione o arquivo de vídeo biorobot natação. Clique em &quot;OK&quot; e deixe o programa carregar o arquivo. Abra o software da folha de cálculo. </li><li> No vídeo biorobot carregado, encontre uma referência de dimensões conhecidas ( por exemplo, o rebordo de vidro de 3 mm de diâmetro que foi incorporado no atuador biológico). Nota: Qualquer objeto com dimensão conhecida funcionará. Isso determinará as proporções de pixel para comprimento em cada vídeo. </li><li> Use a ferramenta &quot;Straight&quot; para desenhar uma linha em toda a pérola de vidro. Clique em &quot;Analisar&quot; e selecione &quot;Definir escala&quot;. Defina o campo &quot;Distância conhecida&quot; para &quot;3.000 μm&quot; e clique em &quot;Ok&quot;. Nota: Isto irá definir as coordenadas x e y para micrômetros. </li><li> Escolha um ponto no dispositivo que não oscila entre quadros para agir como um marcador. Nota:Recomenda-se escolher um canto da base. </li><li> Aponte para o ponto selecionado em 5.1.4 no primeiro quadro. Registre as coordenadas x e y na planilha. </li><li> Volte para a janela do software de análise de imagem e pressione a tecla de seta para a direita para mudar para a próxima moldura. Aponte novamente para o marcador (a partir do passo 5.1.4) e registre as coordenadas x e y na planilha. </li><li> Repita o passo 5.1.6 para todos os quadros. </li></ol></li><li> Calcule os parâmetros de natação do biorobot usando a planilha de coordenadas 7 . <ol><li> Calcule o período entre quadros a partir da taxa de quadros conhecida de cada vídeo. </li><li> Calcule a mudança nas coordenadas x e y entre quadros para encontrar a distância movida, incluindo a distância total. </li><li> Calcule a amplitude de contração da mudança máxima ao longo do eixo y. Determine a frequência de batimento para cada biorobot do inverso do período entre duas contrações. </li><li> CCalcular a velocidade de natação de cada dispositivo a partir do tempo total e da distância movida na direção x. </li><li> Repita o passo 5.2 para cada vídeo biorobot que foi analisado. </li><li> Normalize cada parâmetro medido. Nota: Normalize todos os valores para melhor visualizar as diferenças. Este protocolo demonstra normalização com relação a um biorobot de modo horizontal com contrações de baixa frequência (LF horizontal) ( Figura 4 ) 7 . </li></ol></li></ol> 6. Análise da Expressão de Proteína Nota: As amostras montadas preparadas nos passos 2.2.4 e 2.2.5 foram visualizadas utilizando um microscópio confocal. As imagens foram adquiridas em amplificação 20X, 40X e 60X sequencialmente em três canais simultaneamente: 460 nm, 488 nm e 594 nm. Um conjunto de 5 imagens foram capturadas a uma ampliação de 40X, a partir de posições diferentes para cada amostra, e cada canal foi guardado como um indivíduo.Arquivo. O ajuste de exposição foi determinado pela ampliação do objectivo utilizado e foi fixado constante para todas as capturas nessa ampliação. <ol><li> Abra o software de análise de imagem e selecione &quot;Arquivo&quot; -&gt; &quot;Abrir&quot; para carregar as imagens. </li><li> Desenhe um polígono retangular na moldura da imagem para marcar o ROI. Selecione &quot;Analisar&quot; -&gt; &quot;Medir&quot; para medir a intensidade fluorescente média. </li><li> Repita o passo 6.2 para coletar medições de intensidade de todas as amostras e calcular a respectiva intensidade média para cada condição. Nota: Aqui, uma condição diferente refere-se a diferentes pontos de tempo, como em, dia 1, dia 2 e até dia 6. </li><li> Exporte os resultados em uma planilha para análise estatística adicional e para a produção de gráficos de dados. </li></ol>

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Os autores não têm nada a revelar.

O procedimento descrito aqui descreve um método de sementeira bem sucedido para actuadores e biorobots baseados em PDMS, o que facilita a ligação de cardiomiócitos. Além disso, foi descrito o processo de aquisição de imagem e a subsequente análise que caracteriza o comportamento das células eo desempenho dos dispositivos. Observamos a contração espontânea de células nos braços cantilever após 24 h; A intensidade das contrações continuou a aumentar de forma constante ao longo...

Biorobots são dispositivos baseados em células vivas que são incorporados dentro de um backbone mecânico que é geralmente composto de materiais macios, elásticos, como PDMS ou hidrogéis 1 . As células sofrem contrações rítmicas, espontaneamente ou em resposta a estímulos, e assim funcionam como um atuador. A energia gerada a partir da célula de contração drives vários biorobots. As células do coração de mamíferos (cardiomiócitos) e as células do músculo esquelético são frequentemente utilizadas para a actuação biorobot devido às suas propriedades contrácteis. Além de cardiomiócitos e células musculares esqueléticas, foram utilizados outros tipos de células, tais como tecidos musculares de insectos 2 e tecidos musculares explantados 3 . Os tecidos musculares de insetos permitem a operação de atuadores biológicos à temperatura ambiente. A função eo desempenho de um biorobot são determinados principalmente pela força e consistência do atuador biológico ( ie. Células musculares), enquanto que a estrutura principal mecânica determina os mecanismos de locomoção, estabilidade e potência. Uma vez que estes dispositivos são exclusivamente movidos por forças geradas por células, não existem poluentes químicos ou ruídos operacionais. Portanto, eles formam uma alternativa de energia eficiente para outros robôs convencionais. Várias fontes da literatura discutiram os diferentes métodos para integrar células vivas e tecidos em biorobots 1 , 4 , 5 . Os avanços na microfabricação e técnicas de engenharia de tecidos permitiram o desenvolvimento de biorobôs que podem andar, segurar, nadar ou bombear 5 , 6 . Em geral, as células são cultivadas directamente sobre o esqueleto mecânico (polimérico) como uma folha de células confluentes ou são moldadas em estruturas de actuação tridimensionais dentro de andaimes tais como anéis e tiras. Na maioria das vezes, biorobots sãoFabricadas utilizando folhas de cardiomiócitos 6 , 7 , uma vez que estas células têm uma capacidade inata para exibir uma contracção espontânea sem estímulos externos. Por outro lado, os relatos sobre as folhas de células do músculo esquelético são limitados devido à sua necessidade de estímulos para iniciar as contrações in vitro , a fim de iniciar a despolarização da membrana 8 . Este protocolo descreve, em primeiro lugar, como semear cardiomiócitos num actuador biológico funcionalizado feito de um cantilever PDMS fino. Em seguida, descreve em detalhes a semeadura e análise dos perfis de natação. O cantilever é funcionalizado com uma proteína adesiva celular tal como a fibronectina e é semeado confluentemente com cardiomiócitos. À medida que as células semeadas no dispositivo se contraem, elas fazem com que o cantilever se dobre e assim actue como um actuador. Ao longo do tempo, à medida que as células se amadurecem, rastreamos as mudanças no estresse superficial no dispositivo, analisando vídeosDobra em cantilever. O actuador biológico desenvolvido aqui pode ser utilizado para determinar as propriedades contrácteis de qualquer tipo de célula, tal como os fibroblastos ou células de caules pluripotentes induzidas, à medida que sofrem diferenciação. Grande parte da pesquisa anterior sobre biorobôs foi focada no desenvolvimento de atuadores biológicos, enquanto a otimização da arquitetura biorobot e capacidades funcionais foram largamente negligenciadas. Recentemente, alguns estudos têm demonstrado a implementação de modos de natação em biorobôs que são inspirados pela natureza. Por exemplo, os biorobots de natação com movimento baseado em flagelos 6 , propulsão de água-viva 9 e raios bio-híbridos 4 foram projetados. Ao contrário de outros trabalhos na literatura, aqui nos concentramos em variar as propriedades da espinha dorsal mecânica para criar uma estrutura de auto-estabilização. O biorobot desenvolvido neste estudo é capaz de manter um passo constante, roll, e imMersion como ele nada. Estes parâmetros podem ser modificados variando a espessura de cada composto de base. Os passos de fabricação envolvidos no desenvolvimento do atuador PDMS, o biorobot submergível e a funcionalização do dispositivo são descritos detalhadamente na Parte 1 deste artigo em duas partes, bem como em nosso recente trabalho 7. A técnica desenvolvida aqui pode pavimentar o Para o desenvolvimento de novos, altamente eficientes biorobots para várias aplicações, tais como entrega de carga. O processo de isolamento seguido neste estudo é semelhante ao processo descrito em um trabalho anterior 10 , bem como em trabalhos recentemente publicados 7 . Os métodos de microfabricação utilizados para fabricar os actuadores PDMS e os dispositivos biorobot são descritos em pormenor na Parte 1 deste manuscrito de duas partes. A seção de protocolo deste manuscrito descreve os passos envolvidos na semeadura de cardiomiócitos no PDMS fabricado aE o biorobot após a sua funcionalização com proteínas adesivas celulares.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Chemicals and reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cardiomyocytes (primary cardiac cells)</td><td>Charles River</td><td>NA</td><td>Isolated from 2-day old neonatal Sprague Dawley rats</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s modified eagle&amp;rsquo;s media (DMEM)</td><td>Hyclone Laboratories</td><td>16750-074</td><td>with 4500 mg/L glucose, 4.0 mM L-glutamine, and 110 mg/L sodium pyruvate</td></tr><tr><td>Fetalclone III serum</td><td>Hyclone industries, GE</td><td>16777-240</td><td>Fetal bovin serum (FBS)</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s phosphate buffer (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1408-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-G sodium salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3032</td><td></td></tr><tr><td>Goat serum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>4,6-diamidino-2-phenylindole dihydrocholride powder (DAPI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin from bovine plasma</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1141</td><td>Solution (1 mg/ml)</td></tr><tr><td>Calcein-AM and ethidium homodimer-1 kit (Live/Dead Assay)</td><td>Molecular Probes</td><td>L3224</td><td></td></tr><tr><td>Calcium Fluo-4, AM</td><td>Molecular Probes</td><td>F14217</td><td>calcium indicator dye</td></tr><tr><td>Tyrodes salt solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T2397</td><td>buffer solution</td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Molecular Probes</td><td>P3000MP</td><td>nonionic surfactant-20 % solution in Dimethylsiloxane (DMSO)</td></tr><tr><td>16% Parafomaldehyde</td><td>Electron microscopy</td><td>15710</td><td>Caution: Irritant and combustible</td></tr><tr><td>Triton x-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X-100 100 mL</td><td>cell lyses detergent, (4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol, t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether)</td></tr><tr><td>ProLong gold antifade reagent</td><td>Molecular Probes</td><td>P10144</td><td>Mounting agent</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Phalloidin</td><td>Molecular Probes</td><td>A12381</td><td>Actin filament marker</td></tr><tr><td>Goat anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 594 conjugate</td><td>Molecular Probes</td><td>A-11012</td><td></td></tr><tr><td>pha</td><td>Molecular Probes</td><td>A-11001</td><td></td></tr><tr><td>Anti-connexin 43 antibody</td><td>Abcam</td><td>ab11370</td><td>Gap junction marker</td></tr><tr><td>Anti-cardiac troponin I antibody</td><td>Abcam</td><td>ab10231</td><td>Contractile protein</td></tr><tr><td>16% EM grade paraformaldehyde solution</td><td>Electron microscopy</td><td>100503-916</td><td></td></tr><tr><td>Polydimethylsiloxane (PDMS)</td><td>Elsevier</td><td></td><td>Sylgard 184</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Materials and Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Camera</td><td>Thor Labs</td><td>DCC1545M</td><td></td></tr><tr><td>LED light strip</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Any white LED without spectrum emission</td></tr><tr><td>Confocal microscope</td><td>Nikkon C2</td><td>NA</td><td>Confocal microscope with three filter set.</td></tr><tr><td>Zooming lens</td><td>Infinity</td><td>Model# 252120</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Software&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matlab</td><td>Mathworks</td><td>NA</td><td>Used in Section 4) for biological actuator analysis.</td></tr><tr><td>Image J</td><td>National Institute of Health</td><td>NA</td><td>Java-based image processing software. Used in Section 5) for biorobot analysis.&lt;br/&gt; Free Image Processing and Analysis software in java. (https://imagej.nih.gov/ij/)</td></tr><tr><td>Thor Cam</td><td>Thor Labs</td><td>NA</td><td>Camera operating software</td></tr></tbody></table>

cardiac muscle cell-based actuator and self-stabilizing biorobot - part 2

Nos últimos anos, foram desenvolvidos dispositivos híbridos que consistem numa célula viva ou componente de tecido integrado com uma espinha dorsal mecânica sintética. Estes dispositivos, chamados biorobots, são alimentados apenas pela força gerada a partir da atividade contrátil do componente vivo e, devido às suas muitas vantagens inerentes, poderia ser uma alternativa aos robôs convencionais totalmente artificiais. Aqui, descrevemos os métodos para semear e caracterizar um atuador biológico e um biorobot que foi projetado, fabricado e funcionalizado na primeira parte deste artigo em duas partes. O actuador biológico fabricado e os dispositivos biorobot compostos por uma base de polidimetilsiloxano (PDMS) e um cantilever de película fina foram funcionalizados para ligação de células com fibronectina. Após a funcionalização, os cardiomiócitos de ratos neonatais foram semeados no braço cantilever PDMS a uma densidade elevada, resultando numa folha de células confluentes. Os dispositivos foram visualizados todos os dias eo movimento do cantiBraços de alavanca foi analisada. No segundo dia após a semeadura, observamos a flexão dos braços em consola devido às forças exercidas pelas células durante as contrações espontâneas. Após análise quantitativa da dobra em cantilever, observou-se um aumento gradual no stress superficial exercido pelas células à medida que amadureciam ao longo do tempo. Da mesma forma, observamos o movimento do biorobot devido à atuação do braço cantilever PDMS, que atuou como uma aleta. Após a quantificação dos perfis de natação dos dispositivos, foram observados vários modos de propulsão, que foram influenciados pelo ângulo de repouso da barbatana. A direção do movimento e a freqüência de batimento também foram determinadas pelo ângulo de repouso da barbatana, e observou-se uma velocidade máxima de natação de 142 μm / s. Neste artigo, descrevemos o procedimento para preencher os dispositivos fabricados com cardiomiócitos, bem como para a avaliação do atuador biológico e atividade biorobot.

O atuador biológico feito de um cantilever PDMS fino (25 μm de espessura) e cardiomiócitos constitui o núcleo do biorobot de natação, conforme mostrado na esquemática e captura de tela dos dispositivos na Figura 1 . As células começam a apresentar contracções após 24 h em cultura e a flexão dos braços em consola foi observada até ao dia 2. O perfil lateral do dispositivo foi registado todos os dias e o stress superficial foi quantificado a partir da dobra ...

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Cardiac Muscle Cell-based Actuator and Self-stabilizing Biorobot - Part 2

Neste estudo, um atuador biológico e um biorobot de natação auto-estabilizante com braços elastoméricos em cantilever funcionalizados são semeados com cardiomiócitos, cultivados e caracterizados por suas propriedades bioquímicas e biomecânicas ao longo do tempo.

Atuador baseado em células musculares cardíacas e auto-estabilizante Biorobot - Parte 2

In recent years, hybrid devices that consist of a living cell or tissue component integrated with a synthetic mechanical backbone have been developed. ...

cardiac-muscle-cell-based-actuator-self-stabilizing-biorobot-part

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Bioengineering

8.7K visualizações.  University of Notre Dame.  Neste estudo, um atuador biológico e um biorobot de natação auto-estabilizante com braços elastoméricos em cantilever funcionalizados são semeados com cardiomiócitos, cultivados e caracterizados por suas propriedades bioquímicas e biomecânicas ao longo do tempo. 

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Fabrication of Myogenic Engineered Tissue Constructs

Despite the fact that electronic pacemakers are life-saving medical devices, their long-term performance in pediatric patients can be problematic owing to the restrictions imposed by a child's small size and their inevitable growth. Consequently, there is a genuine need for innovative therapies designed specifically for pediatric patients with cardiac rhythm disorders. We propose that a conductive biological alternative consisting of a collagen-based matrix containing autologously-derived cells could better adapt to growth, reduce the need for recurrent surgeries, and greatly improve the quality of life for these patients. In the present study, we describe a procedure for incorporating primary skeletal myoblast cell cultures within a hydrogel matrix to fashion a surgically-implantable tissue construct that will serve as an electrical conduit between the upper and lower chambers of the heart. Ultimately, we anticipate using this type of engineered tissue to restore atrioventricular electrical conduction in children with complete heart block. In view of that, we isolate myoblasts from the skeletal muscles of neonatal Lewis rats and plate them onto laminin-coated tissue culture dishes using a modified version of established protocols[2, 3]. After one to two days, cultured cells are collected and mixed with antibiotics, type 1 collagen, Matrigel&trade;, and NaHCO3. The result is a viscous, uniform solution that can be cast into a mold of nearly any shape and size[1, 4, 5]. For our tissue constructs, we employ type 1 collagen isolated from fetal lamb skin using standard procedures[6]. Once the tissue has solidified at 37&deg;C, culture media is carefully added to the plate until the construct is submerged. The engineered tissue is then allowed to further condense through dehydration for 2 more days, at which point it is ready for in vitro assessment or surgical-implantation.

Here, we demonstrate fabrication of collagen-based, tissue constructs containing skeletal myoblasts. These 3-D engineered constructs may be used to replace or repair tissues in vivo. For our purposes, we have designed these as an atrioventricular electrical conduit for the repair of complete heart block[1].

Fabricação de Miogênica Constrói engenharia de tecidos

Despite the fact that electronic pacemakers are life-saving medical devices, their long-term performance in pediatric patients can be problematic owing to ...

Biologia

Design and Fabrication of an Elastomeric Unit for Soft Modular Robots in Minimally Invasive Surgery

In recent years, soft robotics technologies have aroused increasing interest in the medical field due to their intrinsically safe interaction in unstructured environments. At the same time, new procedures and techniques have been developed to reduce the invasiveness of surgical operations. Minimally Invasive Surgery (MIS) has been successfully employed for abdominal interventions, however standard MIS procedures are mainly based on rigid or semi-rigid tools that limit the dexterity of the clinician. This paper presents a soft and high dexterous manipulator for MIS. The manipulator was inspired by the biological capabilities of the octopus arm, and is designed with a modular approach. Each module presents the same functional characteristics, thus achieving high dexterity and versatility when more modules are integrated. The paper details the design, fabrication process and the materials necessary for the development of a single unit, which is fabricated by casting silicone inside specific molds. The result consists in an elastomeric cylinder including three flexible pneumatic actuators that enable elongation and omni-directional bending of the unit. An external braided sheath improves the motion of the module. In the center of each module a granular jamming-based mechanism varies the stiffness of the structure during the tasks. Tests demonstrate that the module is able to bend up to 120&#176; and to elongate up to 66% of the initial length. The module generates a maximum force of 47 N, and its stiffness can increase up to 36%.

This paper describes the design and fabrication of a soft unit for surgical manipulators. The base module includes three flexible fluidic actuators to achieve omnidirectional bending and elongation, and a granular jamming-based mechanism to enable stiffness control. A complete mechanical characterization is also reported.

Projeto e fabricação de uma Unidade de elastômero para robôs modulares moles em Cirurgia Minimamente Invasiva

In recent years, soft robotics technologies have aroused increasing interest in the medical field due to their intrinsically safe interaction in ...

Bioengenharia

Construction of Defined Human Engineered Cardiac Tissues to Study Mechanisms of Cardiac Cell Therapy

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that replicate the biofidelity of three-dimensional native human myocardium, while also enabling a controlled level of biological complexity, and allowing non-destructive longitudinal monitoring of tissue contractile function. Initially, human engineered cardiac tissues (hECT) were created using the entire cell population obtained from directed differentiation of human pluripotent stem cells, which typically yielded less than 50% cardiomyocytes. However, to create reliable predictive models of human myocardium, and to elucidate mechanisms of heterocellular interaction, it is essential to accurately control the biological composition in engineered tissues. 
To address this limitation, we utilize live cell sorting for the cardiac surface marker SIRP&#945; and the fibroblast marker CD90 to create tissues containing a 3:1 ratio of these cell types, respectively, that are then mixed together and added to a collagen-based matrix solution. Resulting hECTs are, thus, completely defined in both their cellular and extracellular matrix composition.
Here we describe the construction of defined hECTs as a model system to understand mechanisms of cell-cell interactions in cell therapies, using an example of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells (hMSC) that are currently being used in human clinical trials. The defined tissue composition is imperative to understand how the hMSCs may be interacting with the endogenous cardiac cell types to enhance tissue function. A bioreactor system is also described that simultaneously cultures six hECTs in parallel, permitting more efficient use of the cells after sorting.

This manuscript describes the creation of defined engineered cardiac tissues using surface marker expression and cell sorting. The defined tissues can then be used in a multi-tissue bioreactor to investigate mechanisms of cardiac cell therapy in order to provide a functional, yet controlled, model system of the human heart.

Construção de Engineered Definido cardíaca humana Tecidos para estudar os mecanismos da terapia celular cardíaca

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that ...

Fabrication of Carbon-Based Ionic Electromechanically Active Soft Actuators

Ionic electromechanically active capacitive laminates are a type of smart material that move in response to electrical stimulation. Due to the soft, compliant and biomimetic nature of this deformation, actuators made of the laminate have received increasing interest in soft robotics and (bio)medical applications. However, methods to easily fabricate the active material in large (even industrial) quantities and with a high batch-to-batch and within-batch repeatability are needed to transfer the knowledge from laboratory to industry. This protocol describes a simple, industrially scalable and reproducible method for the fabrication of ionic carbon-based electromechanically active capacitive laminates and the preparation of actuators made thereof. The inclusion of a passive and chemically inert (insoluble) middle layer (e.g., a textile-reinforced polymer network or microporous Teflon) distinguishes the method from others. The protocol is divided into five steps: membrane preparation, electrode preparation, current collector attachment, cutting and shaping, and actuation. Following the protocol results in an active material that can, for example, compliantly grasp and hold a randomly shaped object as demonstrated in the article.

This article describes a fast and simple manufacturing process of ionic electromechanically active composite materials for actuators in biomedical, biomimetic and soft robotics applications. The key fabrication steps, their importance for the actuators&#39; final properties, and some of the main characterization techniques are described in detail.

Fabricação de atuadores macios eletromecanicamente ativos à base de carbono

Ionic electromechanically active capacitive laminates are a type of smart material that move in response to electrical stimulation. Due to the soft, ...

Engenharia

Manufacturing, Control, and Performance Evaluation of a Gecko-Inspired Soft Robot

This protocol presents a method for manufacturing, control, and evaluation of the performance of a soft robot that can climb inclined flat surfaces with slopes of up to 84&#176;. The manufacturing method is valid for the fast pneunet bending actuators in general and might, therefore, be interesting for newcomers to the field of actuator manufacturing. The control of the robot is achieved by means of a pneumatic control box that can provide arbitrary pressures and can be built by only using purchased components, a laser cutter, and a soldering iron. For the walking performance of the robot, the pressure-angle calibration plays a crucial role. Therefore, a semi-automated method for the pressure-angle calibration is presented. At high inclines (&#62; 70&#176;), the robot can no longer reliably fix itself to the walking plane. Therefore, the gait pattern is modified to ensure that the feet can be fixed on the walking plane.

This protocol provides a detailed list of steps to be performed for the manufacturing, control and evaluation of the climbing performance of a gecko-inspired soft robot.

Avaliação de fabricação, controle e desempenho de um robô macio inspirado em gecko

This protocol presents a method for manufacturing, control, and evaluation of the performance of a soft robot that can climb inclined flat surfaces with ...

Cardiac Muscle-cell Based Actuator and Self-stabilizing Biorobot - PART 1

Biological machines often referred to as biorobots, are living cell- or tissue-based devices that are powered solely by the contractile activity of living components. Due to their inherent advantages, biorobots are gaining interest as alternatives to traditional fully artificial robots. Various studies have focused on harnessing the power of biological actuators, but only recently studies have quantitatively characterized the performance of biorobots and studied their geometry to enhance functionality and efficiency. Here, we demonstrate the development of a self-stabilizing swimming biorobot that can maintain its pitch, depth, and roll without external intervention. The design and fabrication of the PDMS scaffold for the biological actuator and biorobot followed by the functionalization with fibronectin is described in this first part. In the second part of this two-part article, we detail the incorporation of cardiomyocytes and characterize the biological actuator and biorobot function. Both incorporate a base and tail (cantilever) which produce fin-based propulsion. The tail is constructed with soft lithography techniques using PDMS and laser engraving. After incorporating the tail with the device base, it is functionalized with a cell adhesive protein and seeded confluently with cardiomyocytes. The base of the biological actuator consists of a solid PDMS block with a central glass bead (acts as a weight). The base of the biorobot consists of two composite PDMS materials, Ni-PDMS and microballoon-PDMS (MB-PDMS). The nickel powder (in Ni-PDMS) allows magnetic control of the biorobot during cells seeding and stability during locomotion. Microballoons (in MB-PDMS) decrease the density of MB-PDMS, and enable the biorobot to float and swim steadily. The use of these two materials with different mass densities, enabled precise control over the weight distribution to ensure a positive restoration force at any angle of the biorobot. This technique produces a magnetically controlled self-stabilizing swimming biorobot.

In this two-part study, a biological actuator was developed using highly flexible polydimethylsiloxane (PDMS) cantilevers and living muscle cells (cardiomyocytes), and characterized. The biological actuator was incorporated with a base made of modified PDMS materials to build a self-stabilizing, swimming biorobot.

Atuador baseado em células musculares cardíacas e Biorobot auto estabilizante - PARTE 1

Biological machines often referred to as biorobots, are living cell- or tissue-based devices that are powered solely by the contractile activity of living ...

Revolucionando a reabilitação do AVC com maior preensão e recuperação dos dedos

A Flexible Wearable Supernumerary Robotic Limb for Chronic Stroke Patients

In this study, we present a flexible wearable supernumerary robotic limb that helps chronic stroke patients with finger rehabilitation and grasping movements. The design of this innovative limb draws inspiration from bending pneumatic muscles and the unique characteristics of an elephant's trunk tip. It places a strong emphasis on crucial factors such as lightweight construction, safety, compliance, waterproofing, and achieving a high output-to-weight/pressure ratio. The proposed structure enables the robotic limb to perform both envelope and fingertip grasping. Human-robot interaction is facilitated through a flexible bending sensor, detecting the wearer's finger movements and connecting them to motion control via a threshold segmentation method. Additionally, the system is portable for versatile daily use. To validate the effectiveness of this innovation, real-world experiments involving six chronic stroke patients and three healthy volunteers were conducted. The feedback received through questionnaires indicates that the designed mechanism holds immense promise in assisting chronic stroke patients with their daily grasping activities, potentially improving their quality of life and rehabilitation outcomes.

Autor em destaque: Aprimorando as habilidades de preensão para pacientes hemiplégicos com membros robóticos flexíveis 

This protocol introduces a flexible wearable supernumerary robotic limb tailored to assist in finger rehabilitation for stroke patients. The design incorporates a bending sensor to facilitate seamless human-robot interaction. Validation through experiments involving both healthy volunteers and stroke patients underscores the efficacy and dependability of the proposed study.

Um membro robótico supernumerário vestível flexível para pacientes com AVC crônico

In this study, we present a flexible wearable supernumerary robotic limb that helps chronic stroke patients with finger rehabilitation and grasping ...

Simultaneous Electrical and Mechanical Stimulation to Enhance Cells' Cardiomyogenic Potential

Cardiovascular diseases are the leading cause of death in developed countries. Consequently, the demand for effective cardiac cell therapies has motivated researchers in the stem cell and bioengineering fields to develop in vitro high-fidelity human myocardium for both basic research and clinical applications. However, the immature phenotype of cardiac cells is a limitation on obtaining tissues that functionally mimic the adult myocardium, which is mainly characterized by mechanical and electrical signals. Thus, the purpose of this protocol is to prepare and mature the target cell population through electromechanical stimulation, recapitulating physiological parameters. Cardiac tissue engineering is evolving toward more biological approaches, and strategies based on biophysical stimuli, thus, are gaining momentum. The device developed for this purpose is unique and allows individual or simultaneous electrical and mechanical stimulation, carefully characterized and validated. In addition, although the methodology has been optimized for this stimulator and a specific cell population, it can easily be adapted to other devices and cell lines. The results here offer evidence of the increased cardiac commitment of the cell population after electromechanical stimulation. Electromechanically stimulated cells show an increased expression of main cardiac markers, including early, structural, and calcium-regulating genes. This cell conditioning could be useful for further regenerative cell therapy, disease modeling, and high-throughput drug screening.

Here we present a protocol for training a cell population using electrical and mechanical stimuli emulating cardiac physiology. This electromechanical stimulation enhances the cardiomyogenic potential of the treated cells and is a promising strategy for further cell therapy, disease modeling, and drug screening.

Estimulação simultânea de elétrica e mecânica para aumentar o potencial de Cardiomyogenic das células

Cardiovascular diseases are the leading cause of death in developed countries. Consequently, the demand for effective cardiac cell therapies has motivated ...

Atuador baseado em células musculares cardíacas e auto-estabilizante Biorobot - Parte 2

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Um membro robótico supernumerário vestível flexível para pacientes com AVC crônico

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