Este trabalho foi apoiado pelo Israel Science Foundation [Grants 1721/12, 1368/12 e 1444/16] (para o AP). AP é afiliado com Brettler Center e David R. Bloom Center, Escola de Farmácia, Universidade Hebraica de Jerusalém.

1. ligando o gene de interesse no site reprimível da Vector <ol><li> Obter um vector indutível, como pcDNA5 / FRT / TO ou pcDNA4 / TO. </li><li> Analisar o gene de interesse para quaisquer locais de restrição potencialmente sensíveis existentes no meio do gene que também estão presentes no local de clonagem múltiplo do vector escolhido por ADN em silico software de análise 4. </li><li> Utilizando técnicas de PCR padrão de sobreposição 4, flanquear o gene de interesse com dois locais de reconhecimento de enzimas de restrição seleccionadas (que não são encontrados no gene de interesse), o primeiro inserido antes do codão de iniciação, e o segundo após o codão de paragem. </li><li> Digerir tanto o vector e inserir com enzimas de restrição (seleccionadas no passo 1.2), à temperatura de trabalho dos enzimas durante uma hora, seguida pela adição de uma unidade de fosfatase de intestino de vitela (CIP) para a reacção apenas com vector durante 30 minutos a fim de evitar a auto- ligadura. </li><li>Carregar o ADN digerido num gel de agarose a 1% e separar os segmentos clivados por electroforese 9. </li><li> Usando luz UV, cortados com uma lâmina de os pedaços de gel contendo os desejados segmentos de vector e inserção ser ligado. </li><li> Extrair os segmentos de DNA a partir dos pedaços de gel de agarose (utilizando kits de extração de DNA comerciais disponíveis) e medir a sua concentração final em espectrofotômetro a 260 nm. </li><li> Ligar o gene de interesse no vector indutível seleccionado usando a enzima ligase de T4, à temperatura ambiente durante 20 minutos. A fim de aumentar a probabilidade de o inserto ligando com o vector, utilizar uma proporção de 3: 1 molar da inserção: vector. Para o controle, preparar uma reacção de ligação que inclui apenas o vector. </li><li> Para a transformação bacteriana, adicione 10 ng de vector sozinho e vector + gene em 50 mL E. coli competente. Incubar o tubo em gelo durante 30 minutos, seguido por 45 segundos de incubação a 42 ° C. Imediatamente coloque de voltaem gelo durante dois minutos e transferir as bactérias transformadas em meio de 500 mL de LB. Incubar durante uma hora a 37 ° C sob agitação a 220 rpm. </li><li> Para a selecção de bactérias transformadas com sucesso, a placa 100 uL de cada reacção (tal como descrito no ponto 1.9) numa placa de agar LB preparado contendo o antibiótico apropriado (por exemplo, 100 ug / mL de ampicilina ao usar pcDNA4 / TR). </li><li> Deixa-se crescer durante a noite a 37 ° C. As placas podem ser armazenadas a 4 ° C durante até duas semanas por hermeticamente envolvendo-os em parafina filme plástico. </li><li> Elevador de colónias individuais usando uma ponta de 10 uL, e deixa-se crescer durante a noite em 3 mL de LB + meio antibiótico a 37 ° C sob agitação a 220 rpm. As bactérias com ADN de interesse podem ser congeladas (-20 ° C) durante o armazenamento a curto prazo, por centrifugação a LB e as bactérias a 11000 xg e o sobrenadante por aspiração para fora. O armazenamento a longo prazo, exige o congelamento das bactérias como estoques de glicerol a -80 ° C. </li><li> Extrair DNA through mini-prep e medir a concentração final em espectrofotômetro a 260 nm 5. </li><li> Confirmar inserção bem sucedida do gene de interesse por sequenciação da construção purificada 4. Alternativamente, a digestão de diagnóstico do construto por enzimas de restrição usando electroforese para separar os segmentos de corte e de avaliar a sua presença e comprimento também pode ser utilizado para este fim 4. </li></ol> 2. Linhas de Células que Expressam Cultivar TetR <ol><li> Obter uma linha de cultura de células albergando um plasmídeo do repressor Tet incorporado no seu ADN genómico. Aqui, o protocolo irá ser escrito usando células 293T de rim embrionário humano (HEK-293T) albergando o plasmídeo pcADN6 / TR, tal como um exemplo. </li><li> Semear as células em 100 milímetros placa de cultura de tecido com Dulbecco Modified Eagles Médium (DMEM) suplementado com 10% FBS, 1% de Penicilina-Estreptomicina, 2 mM de L-glutamina, e 25 mM de HEPES, pH 7,3 (aqui: DMEM completo) e incubar ó / N a 37 &amp;# 176; C e 5% de CO 2. Todo o trabalho com células deve ser feito em uma capa biológica sob condições estéreis. </li><li> A fim de manter a expressão do gene repressor Tet, Aspirar o meio e substitui-lo com DMEM completo suplementado com 5 ng / mL de blasticidina. Incubar as células a 37 ° C e 5% de CO 2. </li><li> Uma vez que as células atingem 80-90% de confluência, Aspirar o meio e suavemente lavar as células duas vezes com DPBS (sem cálcio e magnésio) aquecido a 37 ° C. </li><li> A fim de levantar suavemente as células sem causar danos mecânicos, incubar a cultura em DMEM contendo 0,05% de tripsina aquecida a 37 ° C durante 1,5 min. </li><li> Bloquear a acção da tripsina com um volume igual de DMEM completo. Pipeta suavemente para cima e para baixo, a fim de levantar as células e transferi-los para um tubo estéril. </li><li> Centrifugar as células a 200 xg durante 5 min. </li><li> Aspirar o sobrenadante e substituí-lo por 1 mL completa DMEM. Pipetar a solução com as células para cima e para baixo até que nenhumaglomerados de células pode ser visto. Contagem e calcular o número de células utilizando um hemocitómetro. </li><li> Semente 1-2 x 10 6 células em placa de cultura de tecidos de 100 mm contendo 12 ml de DMEM completo com 5 ug / ml de blasticidina. Dividir as células duas vezes por semana como se atingir 90% de confluência. </li></ol> 3. transfecção do plasmídeo de interesse em células <ol><li> Usando o mesmo método de divisão de células, tal como descrito acima, as células de transferência para poços de uma placa de 12 poços preparado com 0,9 mL completo DMEM, suficiente para fazer 50% confluentes (~ 200000 células) e incubar durante a noite a 37 ° C num CO 2 incubadora. </li><li> Prepara-se uma mistura de transfecção com pcDNA4 / A contendo o gene de interesse, um plasmídeo inerte para levar a quantidade total de ADN a 1 jig (se necessário), 3 uL de reagente de transfecção de lípidos e DMEM para perfazer o volume final de 100 uL. A quantidade óptima de DNA de plasmídeo a ser usado varia amplamente como proteínas diferentes expressar na eficiência diferente. para eleitosexperimentos rophysiological, incluem EGFP no plasmídeo de expressão de mamífero no cocktail de transfecção, a fim de visualizar as células que sofrem transfecção com êxito 4. </li><li> Incubar a mistura de transfecção à TA durante 30 min. </li><li> Transfectar células pipetando a mistura de transfecção gota a gota sobre as células plaqueadas na placa de 12 poços e agitar a placa vigorosamente para assegurar uma dispersão homogénea de ADN e o reagente de transfecção. As células devem ser ~ 80% confluentes no momento da transfecção. </li><li> Incubar as células transfectadas O / N a 37 ° C e 5% de CO 2. </li><li> Confirmar que as células foram transfectadas com sucesso, observando o sinal de fluorescência de EGFP sob a lâmpada UV na manhã seguinte se realizar eletrofisiologia. </li></ol> 4. As células plaqueamento em Poli-D-lisina (PDL) Lamelas / Wells <ol><li> Esterilizar 12 mm lamelas por dousing com solução de etanol isopropílico a 70%. Seco e colocar um único coverslIP em cada poço de uma placa de 24 poços para o registo electrofisiológico. </li><li> Pipetar uma solução de 0,1-0,2 mg / ml solução em cada lamela PDL ou poço de uma câmara de imagem de cálcio. </li><li> Deixar assentar durante 30 min a 37 ° C numa incubadora de CO2 a 5%. </li><li> Lavar com grau de cultura de células de água bidestilada (DDW), três vezes, aspirando entre cada lavagem. Após a lavagem final, seque bem e deixe descansar em temperatura ambiente. </li><li> Para electrofisiologia, preencher cada uma das cavidades contendo uma lamela revestida PDL com 500 uL de DMEM completo aquecido a 37 ° C. </li><li> Realizar o mesmo método de separação das células transfectadas, tal como descrito acima. Após a ressuspensão das células após o tratamento com tripsina e de bloqueio, a transferência de 80 uL de células (ou aproximadamente 30000 células) para o centro de cada lamela revestida PDL para gravação electrofisiologia. Permitir que as células assentar durante pelo menos 1,5 hora ou a incubar durante a noite a 37 ° C numa incubadora de CO2 a 5%. </li><li> Para a transferência de imagem de cálcio e local 20 uL de células (cerca de 20000 células) para o centro de cada imagem de cálcio revestido PDL bem. Permitir que as células assentar durante pelo menos 30 min e adicionar 180 ul de DMEM completo a cada poço. </li></ol> 5. indução da expressão do gene <ol><li> Prepara-se uma solução estoque de doxiciclina de 1 mg / mL em DDW de acordo com as instruções do fabricante. Mantenha a solução estoque protegida da luz a 4 ° C durante até 3 semanas. Para armazenamento a longo prazo manter solução de doxiciclina a -20 ° C. </li><li> Prepara-se uma fresco 2 ug / mL (electrofisiologia) ou / mL (imagem de cálcio) doxiciclina solução 3 ug em DMEM completo e aquecê-la a 37 ° C. </li><li> Para registos electrofisiolicos, pipeta 500 uL de 2 ug / mL de doxiciclina solução a cada poço para fazer uma concentração final de 1 ug / mL de doxiciclina. Para imagem de cálcio, adicionar 100 uL de solução / mL de doxiciclina 3 ug a cada poço para tornar um Concentra definitivação de 1 ug / mL de doxiciclina. Anote a hora da indução. </li><li> Incubar durante o período de tempo desejado para a indução a 37 ° C e 5% de CO 2. </li></ol> 6. Calibração Timeline da expressão da proteína <ol><li> Calibrar a expressão da proteína através de Imagem de cálcio 5, 10 <ol><li> Preparar a solução de Ringer (NaCl 140 mM, KCl 2,5 mM, CaCl 2 1,8, 2 mM de MgSO4, 20 mM de HEPES, pH ajustado para 7,4 com NaOH) e aquecê-la a 37 ° C. </li><li> Prepare a concentrações saturantes de um agonista de canal em solução de Ringer. Uma vez que a quantidade de agonista é diluída quando adicionado às câmaras de imagem de cálcio, contendo as células e solução extracelular, o dobro da quantidade da concentração final desejada do agonista. Isto também faz com que a quantidade de solução de banho em cada poço crítico para controlar. </li><li> Prepara-se uma solução de n iico F-127 de 20% W / V em DMSO. Aquece-se a solução a 40 ° C até não iónico F-127 é dissolvido. Guardar a solução não iónico F-127 à TA e aquecê-la a 40 ° C antes da utilização. Não-iónico F-127 é utilizado para ajudar a dispersar os ésteres de acetoximetilo (AM) de indicadores de iões fluorescentes, tais como Fura-2 em soluções aquosas. </li><li> Aspirar o meio e substitui-la com uma solução de Fura-02:00 de carga (solução de Ringer suplementado com 2-3 | iM de Fura-02:00, 0,02 mg / mL não iónico F-127 e D-glicose 10 mM). </li><li> Incubar durante 60 min à temperatura ambiente no escuro. </li><li> Aspirar Fura-2AM solução e lavar as células com uma solução de D-glicose de Ringer + 10 mM para remover o corante extracelular. Repita esta etapa duas vezes. </li><li> Deixar a solução D-glucose de 200 uL da campainha + 10 mM em cada poço e incubar durante 30 min à temperatura ambiente no escuro. </li><li> Coloque câmara no palco acima da parte do nariz microscópio e prenda-o com o titular. </li><li> Acender a luz, câmera e microscópio e selecione filtro de Fura-2 para detectar emissão a 510 nm wavelength. </li><li> Ajustar para a ampliação desejada e se concentrar células no campo selecionado. </li><li> No escuro, subtrair a luz de fundo e definir o tempo de exposição. </li><li> Definir amostragem imagem na resposta da frequência e fluorescência registro desejado de Fura-2 células carregadas por eles emocionante a 340 e 380 comprimentos de onda nm. A proporção de 340/380 sinais é um indicador para a concentração intracelular de Ca2 + e assim também para a actividade de TRPV1. </li><li> Adicionar 2 uM capsaicina em solução de 200 ul da campainha por pipetagem para criar uma concentração de saturação final de 1 uM de capsaicina, a fim de avaliar o nível de expressão de TRPV1. </li><li> Analise resposta TRPV1 de acordo com o tempo de indução e determinar o protocolo para a proteína de interesse. </li></ol></li><li> Ajustando a expressão de proteínas heterólogas em sistemas utilizando a configuração de célula inteira da técnica de patch-clamp 4, 11. <ol><li> Prepare tele em banho de gelo de (mM) NaCl 140, KCl 2,3, MgSO4 2, 5 de HEPES, 5 e 2- (N-morfolino) etanossulfónico (MES), pH ajustado para 7,4 com NaOH. </li><li> Prepare a concentrações saturantes de um agonista de canal em solução extracelular. </li><li> Puxe eletrodos de vidro com um diâmetro interno (ID) de 1,10 mm e fogo-polonês para uma resistência de 2-4 mohms. </li><li> Prepara-se uma solução de pipeta (mM) 130 KCl, 4 NaCl, 2 MgSO4, 0,5 CaCl2, EGTA 1 e HEPES 10 ajustado para pH 7,2 com KOH. Filtra-se a solução da pipeta antes do uso. Antes de cada experiência, um único, pipeta de vidro polido ao fogo é preenchido por volta submergindo a ponta na solução da pipeta durante pelo menos um minuto, e, em seguida, preenchido usando ponta derretido e esticado com uma seringa cheia com a mesma solução de pipeta. </li><li> Suavemente levantar uma única lamela PDL revestido com as células plaqueadas do poço para uma placa de Petri de plástico 35 milímetros cheio com aproximadamente 2 mL de solução de banho à TA. Observar no âmbito de um epi-microscópio fluorescente. </li><li> Localizar uma célula positiva de EGFP, como visualizado com o microscópio de epifluorescência, sobre a lamela preparada e mover-se para o centro do campo visualizado. </li><li> Anexar a pipeta cheia ao titular da pipeta da micromanipulador, e injectar uma pequena quantidade de pressão positiva no sistema para evitar a contaminação da solução da pipeta intracelular. Abaixá-lo para um pouco acima da GFP - celular positiva, verificando a resistência adequada. </li><li> À medida que a pipeta toca a célula, aplicar uma pequena quantidade de pressão negativa, de modo a criar uma vedação entre o GÊ pipeta de vidro e a membrana celular. </li><li> Com um pulso curto, afiado de sucção, quebrar a membrana celular, permitindo que a pipeta para entrar em contacto com o conteúdo intracelular da célula. </li><li> Mude o modo de amplificador para células inteiras, e diminuir o ganho de filtro e saída de Bessel, 1 - 5 kHz e 0.5α, respectivamente. </li><li> Grave a resposta atual para o saturanteconcentrações de agonista dos canais usando rampas de tensão ou protocolo de livre lacuna. </li><li> Porque a eficiência de expressão alternar entre diferentes proteínas, repita as gravações usando diferentes tempos de comprimento indução. </li></ol></li><li> Determinar tempo de indução ideal para gravações de canal único 4. <ol><li> Prepara-se uma solução de (mM) 150 de Na-gluconato, 15 de NaCl, 5 EGTA, HEPES e 10, ajustado para pH 7,4 com NaOH, como uma solução pipeta. Para a solução do banho, usar a solução a partir do passo 6.2.1. </li><li> Repita o procedimento de células inteiras usando ID 0,86 mm pipetas de vidro fogo-polido para uma resistência de 10-12 mohms e definir potencial de realização de -40 mV. </li><li> Criar um selo sobre a membrana, tal como descrito anteriormente e a ruptura da membrana. </li><li> Usando o micromanipulador, levantar a pipeta com o remendo de membrana afastada, a partir da célula. </li><li> Posicione o sistema de perfusão ao lado da pipeta contendo o remendo de membrana. </li><li> Lower tele Bessel ganho de filtro e saída para 2-5 kHz e 10α, respectivamente. </li><li> Perfundir concentrações saturantes de um agonista para o remendo de membrana, avaliando se o adesivo contém um ou mais canais de acordo com a resposta. </li><li> Analisar o número de manchas único canal gravados com sucesso contra o tempo de indução aplicada às células. Ajustar o tempo de indução de acordo com os resultados desejados. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Ooi, A., Wong, A., Esau, L., Lemtiri-Chlieh, F., Gehring, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Guide+to+Transient+Expression+of+Membrane+Proteins+in+HEK-293+Cells+for+Functional+Characterization.">A Guide to Transient Expression of Membrane Proteins in HEK-293 Cells for Functional Characterization.</a> Frontiers in Physiology. 7, 300 (2016).</li><li>Thomas, P., Smart, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HEK293+cell+line:+A+vehicle+for+the+expression+of+recombinant+proteins.">HEK293 cell line: A vehicle for the expression of recombinant proteins.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 51 (3), 187-200 (2005).</li><li>Xu, X., Nagarajan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genomic+sequence+of+the+Chinese+hamster+ovary+(CHO)-K1+cell+line.">The genomic sequence of the Chinese hamster ovary (CHO)-K1 cell line.</a> Nature Biotechnology. 29 (8), 735-741 (2011).</li><li>Hazan, A., Kumar, R., Matzner, H., Priel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pain+receptor+TRPV1+displays+agonist-dependent+activation+stoichiometry.">The pain receptor TRPV1 displays agonist-dependent activation stoichiometry.</a> Scientific reports. 5, 12278 (2015).</li><li>Kumar, R., Hazan, A., Basu, A., Zalcman, N., Matzner, H., Priel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tyrosine+Residue+in+the+TRPV1+Vanilloid+Binding+Pocket+Regulates+Deactivation+Kinetics.">Tyrosine Residue in the TRPV1 Vanilloid Binding Pocket Regulates Deactivation Kinetics.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (26), 13855-13863 (2016).</li><li>Kim, T. K., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+cell+transfection:+the+present+and+the+future.">Mammalian cell transfection: the present and the future.</a> Analytical and bioanalytical chemistry. 397 (8), 3173-3178 (2010).</li><li>Preuss, A. K., Connor, J. A., Vogel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+transfection+induces+different+intracellular+calcium+signaling+in+CHO+K1+versus+HEK+293+cells.">Transient transfection induces different intracellular calcium signaling in CHO K1 versus HEK 293 cells.</a> Cytotechnology. 33 (1-3), 139-145 (2000).</li><li>Dalton, A. C., Barton, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Over-expression+of+secreted+proteins+from+mammalian+cell+lines.">Over-expression of secreted proteins from mammalian cell lines.</a> Protein Science. 23 (5), 517-525 (2014).</li><li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. -. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments.">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> J Vis Exp. (62), e3923 (2012).</li><li>Bohlen, C. J., Priel, A., Zhou, S., King, D., Siemens, J., Julius, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bivalent+tarantula+toxin+activates+the+capsaicin+receptor,+TRPV1,+by+targeting+the+outer+pore+domain.">A bivalent tarantula toxin activates the capsaicin receptor, TRPV1, by targeting the outer pore domain.</a> Cell. 141 (5), 834-845 (2010).</li><li>Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+patch-clamp+techniques+for+high-resolution+current+recording+from+cells+and+cell-free+membrane+patches.">Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches.</a> Pflu&#776;gers Archiv European journal of physiology. 391 (2), 85-100 (1981).</li><li>Jones, J., Nivitchanyong, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+tetracycline-responsive+recombinant+protein+production+and+effect+on+cell+growth+and+ER+stress+in+mammalian+cells.">Optimization of tetracycline-responsive recombinant protein production and effect on cell growth and ER stress in mammalian cells.</a> Biotechnology and Bioengineering. 91 (6), 722-732 (2005).</li><li>Raphemot, R., Weaver, C. D., Denton, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+for+small-molecule+modulators+of+inward+rectifier+potassium+channels.">High-throughput screening for small-molecule modulators of inward rectifier potassium channels.</a> J Vis Exp. (71), e4209 (2013).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Transfecção é um protocolo amplamente utilizado para a expressão da proteína e da pesquisa, com muitas variações diferentes para melhorar a consistência e a estabilidade de expressão. reagentes de transfecção transitória oferecer um método simples, fácil de usar o protocolo em que a célula e a proteína de interesse pode ser analisado dentro de horas ou durante a noite a partir do momento da transfecção. Infelizmente, esta abordagem pode ser imprevisível quando o modo de análise requer um nível consi...

Sistemas de expressão heteróloga é uma das técnicas mais amplamente utilizado para estudar uma multiplicidade de funções celulares 1. Seu perfil baixo endógena de proteína, os requisitos mínimos de manutenção, o crescimento confiável e capacidade de assumir e expressar DNA estranho fizeram linhas celulares tais como embrionárias humanas de rim (HEK293) e ovário de hamster chinês (CHO) quase essencial para a pesquisa biológica 2, 3. Áreas de pesquisa usando sistemas heterólogos incluem proteínas de membrana, sinalização intracelular e atividade enzimática. A seguir à transfecção de ADN estranho na célula, muitas formas diferentes de análise pode ser realizada, incluindo a electrofisiologia, imagem de cálcio raciométrica, western blot, etc 4, 5. Devido à grande variedade de aplicações potenciais para sistemas de expressão heterólogos, muitos difereReagentes e produtos nt foram desenvolvidos para utilizar estas células e as suas qualidades 6. sistemas de entrega de DNA que transitoriamente ou permanentemente integrar DNA estranho em células para estudar proteína exógena tornou-se uma das ferramentas mais populares e úteis para a pesquisa biológica. Mais especificamente, a transfecção transiente de ADN para uma célula é amplamente usado como um processo para a frente simples, linear que requer relativamente pouco tempo e materiais. Além disso, a taxa de sucesso de células que sofrem transfecção é alta 7. Esta técnica é muito fiável quando combinado com um gene marcador tal como a proteína fluorescente verde (GFP), e pode ser usado para muitas técnicas diferentes, como a imagiologia de cálcio e electrofisiologia 5. Infelizmente, no entanto, que expressam transitoriamente o DNA em células hospedeiras vem com alguns dos principais armadilhas, não menos que o nível de expressão por célula não é fiável. O número de cópias do DNA de plasmídeo feita up por célula é incontrolável, assim, a expressão entre experiências individuais podem variar muito 2. Esta questão torna-se significativo quando quer tentar replicar condições fisiológicas, ou a realização de técnicas precisas de coleta de dados. Como uma solução para as complicações acima mencionadas, os protocolos de transfecção estável foram concebidos em que um gene de interesse pode ser inserido no genoma de uma célula sob o controlo apertado de um promotor indutível, tal como um sistema de tetraciclina repressor expressão, assegurando uma única cópia do plasmídeo se integra no genoma de cada célula e só é expressa após a indução do mecanismo de transcrição, por exemplo, na presença de doxiciclina. Enquanto isso resolve os obstáculos de níveis de expressão de proteína inconsistentes, este método perde a conveniência de protocolo rápido e relativamente simples de transfecções transitórias. O estabelecimento de uma linha de células estável leva pelo menos algumas semanas em which uma necessário calibrar uma curva de morte definido por antibióticos específicos para manter a expressão da proteína e assegurar a integração do vector e habilmente seleccionar e fazer crescer colónias de células. No geral, isto leva muito mais tempo e esforço com uma menor taxa de sucesso 8. Aqui, apresentamos um protocolo intermediário que tem por base os pontos fortes de ambas as opções de transfecção populares para fornecer uma maneira simples e eficaz para controlar os níveis de expressão em qualquer linha de células inducible. Enquanto se mantém as células com um sistema tet indutível, que transientemente transfectar nosso gene de interesse, transiente do receptor potencial canal de catião membro da subfamília V 1 (TRPV1), ligado a um vector que pode homologamente combinar com o sistema de repressor. Deste modo, o gene pode ser introduzido nas células sem começando a expressar. Apenas com a adição de doxiciclina não o gene começam a expressar, o que nos permite calibrar os níveis de proteína exprESSÃO de acordo com a técnica ou níveis observados em condições fisiológicas. Nosso protocolo também evita complicações associadas à geração de longas uma linha celular que expressa de forma estável. Começamos mostrando alteração dos níveis de ativação de TRPV1 na imagem de cálcio a partir de-un induzida através de quatro horas de indução e como o aumento dos níveis de cálcio intracelular está correlacionado. Em seguida, duplicar o protocolo em toda a configuração da célula da técnica de patch-clamp, mostrando o aumento da corrente com o tempo de indução a aumentar. Por fim, apresentamos exemplos de gravações de eletrofisiologia único canal, e mostrar que esta técnica é especialmente útil para a expressão controlada quando se olha para a coleta de dados precisos com base em unidades individuais da proteína. Através do nosso protocolo, que oferecem um modo conveniente de controlar a expressão de proteínas em sistemas heterólogos, evitando longas complicações de cultura de células, proporcionando assim uma maneira de controlar as condições de entre experiências e fornecer MOre resultados replicáveis.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="655">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">pcDNA&#8482;4/TO Mammalian Expression Vector</td>
			<td style="width:153px;">ThermoScientific Fisher</td>
			<td style="width:119px;">V102020</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">pcDNA&#8482;5/TO Mammalian Expression Vector</td>
			<td style="width:153px;">ThermoScientific Fisher</td>
			<td style="width:119px;">V103320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">PureLink Quick PCR Purification Kit</td>
			<td style="width:153px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">K310001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Swift&#8482;&#160;MaxPro Thermal Cycler</td>
			<td style="width:153px;">Esco&#160;</td>
			<td style="width:119px;">n.a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Restriction Enzymes</td>
			<td style="width:153px;">ThermoScientific Fisher</td>
			<td style="width:119px;">ER0501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Agarose&#160;</td>
			<td style="width:153px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">50004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">PureLink Quick Gel Extraction Kit</td>
			<td style="width:153px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">K210012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">NanoDrop 2000c</td>
			<td style="width:153px;">ThermoScientific Fisher</td>
			<td>ND-2000C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">T4 DNA Ligase</td>
			<td style="width:153px;">ThermoScientific Fisher</td>
			<td style="width:119px;">EL0011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">One Shot&#174; TOP10 Chemically Competent E. coli</td>
			<td style="width:153px;">ThermoScientific Fisher</td>
			<td style="width:119px;">C404006&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ampicillin (Sodium), USP Grade</td>
			<td style="width:153px;">Gold Bio</td>
			<td style="width:119px;">A-301-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tryptone for microbiology</td>
			<td style="width:153px;">Merck</td>
			<td align="right" style="width:119px;">6.19305E+13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Yeast Extract</td>
			<td style="width:153px;">BD worldwide</td>
			<td align="right" style="width:119px;">212750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">&#160;SIF6000R Incubated Shaker</td>
			<td style="width:153px;">LAB COMPANION</td>
			<td style="width:119px;">45H118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;width:216px;"> 
			NucleoSpin&#174;plasmid</td>
			<td style="width:153px;">Macherey Nagel</td>
			<td align="right" style="width:119px;">740588.25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MS 300V Power Supply</td>
			<td style="width:153px;">Major Science</td>
			<td style="width:119px;">MP-300V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Owl&#8482; EasyCast&#8482; B1A Mini Gel Electrophoresis System</td>
			<td style="width:153px;">ThermoScientific Fisher</td>
			<td style="width:119px;">B1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">T-REx&#8482;-293 cell line</td>
			<td style="width:153px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">R710-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:216px;">DMEM (1X), liquid (high glucose)</td>
			<td style="width:153px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">41965-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HindIII-HF&#174;</td>
			<td style="width:153px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">R3104S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ApaI</td>
			<td style="width:153px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">R0114S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CutSmart&#174; Buffer</td>
			<td style="width:153px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">B7204S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">pcDNA&#8482;6/TR&#160; Mammalian Expression Vector</td>
			<td style="width:153px;">ThermoScientific Fisher</td>
			<td style="width:119px;">V102520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Fetal Bovine Serum, qualified, E.U.-approved, South America origin</td>
			<td style="width:153px;">Gibco</td>
			<td align="right" style="width:119px;">10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HEPES Buffer Solution (1 M)</td>
			<td style="width:153px;">Biological Industries</td>
			<td style="width:119px;">03-025-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Penicillin-Streptomycin Solution</td>
			<td style="width:153px;">Biological Industries</td>
			<td style="width:119px;">03-031-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">L-Alanyl-L-Glutamine (Stable Glutamine) (200 mM)</td>
			<td style="width:153px;">Biological Industries</td>
			<td style="width:119px;">03-022-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Heracell&#8482; 150i CO2 Incubator</td>
			<td style="width:153px;">ThermoScientific Fisher</td>
			<td align="right" style="width:119px;">51026406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">MSC-Advantage&#8482; Class II Biological Safety Cabinet</td>
			<td style="width:153px;">ThermoScientific Fisher</td>
			<td align="right" style="width:119px;">51025411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Blasticidine S hydrochloride</td>
			<td style="width:153px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">15205-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline Modified, without calcium chloride and magnesium chloride</td>
			<td style="width:153px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D8537-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td style="width:153px;">Gibco</td>
			<td align="right" style="width:119px;">25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">DOUBLE NEUBAUER RULED METALLIZED HEMACYTOMETER</td>
			<td style="width:153px;">Hausser Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">31000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td style="width:153px;">Gibco</td>
			<td align="right" style="width:119px;">31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TransIT&#174;-LT1 Transfection Reagent</td>
			<td style="width:153px;">Mirus</td>
			<td style="width:119px;">MIR 2300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">glass coverslips, #1 thickness, 12mm diameter round</td>
			<td style="width:153px;">Knittel Glass</td>
			<td style="width:119px;">GG-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">BioCoat&#8482; Poly-D-Lysine</td>
			<td style="width:153px;">Corning</td>
			<td align="right" style="width:119px;">354210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Water, Cell Culture Grade</td>
			<td style="width:153px;">Biological Industries</td>
			<td style="width:119px;">03-055-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Doxycycline hyclate</td>
			<td style="width:153px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D9891-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fura-2, AM ester</td>
			<td style="width:153px;">Biotium</td>
			<td style="width:119px;">BTM-50034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pluronic&#174; F-127</td>
			<td style="width:153px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P2443-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">&#181;-Slide 8 Well</td>
			<td style="width:153px;">ibidi</td>
			<td align="right" style="width:119px;">80826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">(E)-Capsaicin</td>
			<td style="width:153px;">Tocris</td>
			<td align="right" style="width:119px;">462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Olympus IX70 Fluorescence Microscope</td>
			<td style="width:153px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">n.a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Lambda DG-4 Wavelength Switcher</td>
			<td style="width:153px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:119px;">n.a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">EXi Blue Fluorescence Microscopy Camera</td>
			<td style="width:153px;">QImaging</td>
			<td style="width:119px;">n.a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">MetaFluor Fluorescence Ratio Imaging Software</td>
			<td style="width:153px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;">n.a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Thin Walled Borosilicate Tubing</td>
			<td style="width:153px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:119px;">B150-110-7.5HP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Standard Walled Borosilicate Tubing</td>
			<td style="width:153px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:119px;">B150-86-7.5HP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dimethyl sulfoxide anhydrous</td>
			<td style="width:153px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">276855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">P1000 micropipette puller</td>
			<td style="width:153px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:119px;">P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MF-900 Microforge</td>
			<td style="width:153px;">NARISHIGE</td>
			<td style="width:119px;">n.a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ValveBank perfusion sysytem</td>
			<td style="width:153px;">AutoMate Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Digidata&#174; 1440A Low-noise Data Acquisition System</td>
			<td style="width:153px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;">n.a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Axopatch 200B Amplifier</td>
			<td style="width:153px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;">n.a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">pCLAMP 10.6 Software</td>
			<td style="width:153px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;">n.a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">micromanipulator</td>
			<td style="width:153px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:119px;">MP-225</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

controllable ion channel expression through inducible transient transfection

A transfecção, a entrega de ácidos nucleicos estranhos numa célula, é uma ferramenta poderosa na pesquisa de proteínas. Através deste método, os canais iónicos pode ser investigada através de análise electrofisiológica, caracterização bioquímica, estudos mutacionais, e os seus efeitos sobre os processos celulares. As transfecções transientes oferecer um protocolo simples, em que a proteína se torna disponível para análise em poucas horas ou dias. Embora este método apresenta um protocolo de tempo relativamente simples e eficiente, um dos componentes críticos é calibrar a expressão do gene de interesse a níveis fisiológicos relevantes ou níveis que são adequados para análise. Para este fim, muitas abordagens diferentes, que oferecem a capacidade de controlar a expressão do gene de interesse têm surgido. Vários protocolos de transfecção de células estáveis ​​fornecem uma maneira de introduzir de forma permanente um gene de interesse no genoma celular sob a regulação de um transcrip controlado por tetraciclinaactivação cional. Embora essa técnica produz níveis de expressão de confiança, cada gene de interesse requer algumas semanas de trabalho qualificado, nomeadamente calibração de uma curva de morte, seleção de colônias de células e, em geral mais recursos. Aqui apresenta-se um protocolo que utiliza a transfecção transitória do canal de catiões Potencial membro da subfamília V um gene transiente do receptor (TRPV1) num sistema indutível de uma maneira eficiente para expressar uma proteína de uma forma controlada que é essencial na análise de canal iónico. Nós demonstramos que usando esta técnica, somos capazes de realizar imagem de cálcio, células inteiras, e análise único canal com os níveis dos canais controlados necessários para cada tipo de coleta de dados com uma única transfecção. No geral, esta técnica fornece uma replicáveis ​​que podem ser usadas para estudar a estrutura e função de canais iónicos.

Para criar rapidamente um modelo de expressão indutível, que feita utilização de células HEK293 que expressam a proteína Tetraciclina repressor (TR) (por exemplo, T-REX-293) e vectores que contêm sequências do operador de tetraciclina (TetO) entre o promotor CMV e o local de clonagem múltipla (por exemplo, pcDNA4 / A). Quando transfectado em células TRex-293, a expressão do gene de interesse em pcDNA4 / A é reprimida, tal como a TR liga TetO. A adição de d...

Watch this Scientific Journal Video about Controllable Ion Channel Expression through Inducible Transient Transfection at JoVE.com

Controllable Ion Channel Expression through Inducible Transient Transfection

Estudar canais iônicos através de um sistema heterólogo expressar tornou-se uma técnica nuclear em pesquisa biomédica. Neste texto, apresentamos um método eficiente tempo para conseguir uma expressão de canal iónico com força controlada através da realização de transfecção transiente, sob o controlo de um promotor indutível.

Controlável Expressão Ion Canal através de transfecção transiente Induzível

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be ...

controllable-ion-channel-expression-through-inducible-transient

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Genetics

9.3K visualizações.  The Hebrew University of Jerusalem (HUJI).  Estudar canais iônicos através de um sistema heterólogo expressar tornou-se uma técnica nuclear em pesquisa biomédica. Neste texto, apresentamos um método eficiente tempo para conseguir uma expressão de canal iónico com força controlada através da realização de transfecção transiente, sob o controlo de um promotor indutível. 

Vídeo: Controllable Ion Channel Expression through Inducible Transient Transfection

siRNA Transfection and EMSA Analyses on Freshly Isolated Human Villous Cytotrophoblasts

Human primary villous cytotrophoblasts are a very useful source of primary cells to study placental functions and regulatory mechanisms, and to comprehend diseases related to pregnancy. In this protocol, human primary villous cytotrophoblasts freshly isolated from placentas through a standard DNase/trypsin protocol are microporated with small interfering RNA (siRNA). This approach provided greater efficiency for siRNA transfection when compared to a lipofection-based method. Transfected cells can subsequently be analyzed by standard Western blot within a time frame of 3-4 days post-transfection. In addition, using cultured primary villous cytotrophoblasts, Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) analysis was optimized and performed on extracts from days 1 to 4. The use of these cultured primary cells and the protocol described allow for an evaluation of the implication of specific genes and transcription factors in the process of villous cytotrophoblast differentiation into a syncytiotrophoblast-like cell layer. However, the limited time span allowable in culture precludes the use of methods requiring more time, such as generation of a stable cell population. Therefore testing of this cell population requires highly optimized gene transfer protocols.

This protocol describes a method for efficiently transfecting siRNA in freshly isolated human villous cytotrophoblasts using microporation and identifying DNA-protein complexes in these cells. Transfected cells can be monitored by Western blot and EMSA analyses during the 4-day culture time.

As análises siRNA transfecção e EMSA sobre recentemente isolados das vilosidades citotrofoblastos Humanos

Human primary villous cytotrophoblasts are a very useful source of primary cells to study placental functions and regulatory mechanisms, and to comprehend ...

Genética

The Terroir Concept Interpreted through Grape Berry Metabolomics and Transcriptomics

Terroir refers to the combination of environmental factors that affect the characteristics of crops such as grapevine (Vitis vinifera) according to particular habitats and management practices. This article shows how certain terroir signatures can be detected in the berry metabolome and transcriptome of the grapevine cultivar Corvina using multivariate statistical analysis. The method first requires an appropriate sampling plan. In this case study, a specific clone of the Corvina cultivar was selected to minimize genetic differences, and samples were collected from seven vineyards representing three different macro-zones during three different growing seasons. An untargeted LC-MS metabolomics approach is recommended due to its high sensitivity, accompanied by efficient data processing using MZmine software and a metabolite identification strategy based on fragmentation tree analysis. Comprehensive transcriptome analysis can be achieved using microarrays containing probes covering ~99% of all predicted grapevine genes, allowing the simultaneous analysis of all differentially expressed genes in the context of different terroirs. Finally, multivariate data analysis based on projection methods can be used to overcome the strong vintage-specific effect, allowing the metabolomics and transcriptomics data to be integrated and analyzed in detail to identify informative correlations.

This article describes the application of untargeted metabolomics, transcriptomics and multivariate statistical analysis to grape berry transcripts and metabolites in order to gain insight into the terroir concept, i.e., the impact of the environment on berry quality traits.

O Conceito Terroir Interpretado através da baga da uva Metabolomics e transcriptómica

Terroir refers to the combination of environmental factors that affect the characteristics of crops such as grapevine (Vitis vinifera) according to ...

Inducible T7 RNA Polymerase-mediated Multigene Expression System, pMGX

Co-expression of multiple proteins is increasingly essential for synthetic biology, studying protein-protein complexes, and characterizing and harnessing biosynthetic pathways. In this manuscript, the use of a highly effective system for the construction of multigene synthetic operons under the control of an inducible T7 RNA polymerase is described. This system allows many genes to be expressed simultaneously from one plasmid. Here, a set of four related vectors, pMGX-A, pMGX-hisA, pMGX-K, and pMGX-hisK, with either the ampicillin or kanamycin resistance selectable marker (A and K) and either possessing or lacking an N-terminal hexahistidine tag (his) are disclosed. Detailed protocols for the construction of synthetic operons using this vector system are provided along with the corresponding data, showing that a pMGX-based system containing five genes can be readily constructed and used to produce all five encoded proteins in Escherichia coli. This system and protocol enables researchers to routinely express complex multi-component modules and pathways in E. coli.

This study describes methods for the T7-mediated co-expression of multiple genes from a single plasmid in Escherichia coli using the pMGX plasmid system.

Sistema Induzível de Expressão Multigênica mediada por polimerização T7 de T7, pMGX

Co-expression of multiple proteins is increasingly essential for synthetic biology, studying protein-protein complexes, and characterizing and harnessing ...

Studying Cell Cycle-regulated Gene Expression by Two Complementary Cell Synchronization Protocols

The gene expression program of the cell cycle represents a critical step for understanding cell cycle-dependent processes and their role in diseases such as cancer. Cell cycle-regulated gene expression analysis depends on cell synchronization into specific phases. Here we describe a method utilizing two complementary synchronization protocols that is commonly used for studying periodic variation of gene expression during the cell cycle. Both procedures are based on transiently blocking the cell cycle in one defined point. The synchronization protocol by hydroxyurea (HU) treatment leads to cellular arrest in late G1/early S phase, and release from HU-mediated arrest provides a cellular population uniformly progressing through S and G2/M. The synchronization protocol by thymidine and nocodazole (Thy-Noc) treatment blocks cells in early mitosis, and release from Thy-Noc mediated arrest provides a synchronized cellular population suitable for G1 phase and S phase-entry studies. Application of both procedures requires monitoring of the cell cycle distribution profiles, which is typically performed after propidium iodide (PI) staining of the cells and flow cytometry-mediated analysis of DNA content. We show that the combined use of two synchronization protocols is a robust approach to clearly determine the transcriptional profiles of genes that are differentially regulated in the cell cycle (i.e. E2F1 and E2F7), and consequently to have a better understanding of their role in cell cycle processes. Furthermore, we show that this approach is useful for the study of mechanisms underlying drug-based therapies (i.e. mitomycin C, an anticancer agent), because it allows to discriminate genes that are responsive to the genotoxic agent from those solely affected by cell cycle perturbations imposed by the agent.

We report two cell synchronization protocols that provide a context for studying events related to specific phases of the cell cycle. We show that this approach is useful for analyzing the regulation of specific genes in an unperturbed cell cycle or upon exposure to agents affecting the cell cycle.

Estudo da Expressão de Genes Reguladores do Ciclo Celular por dois Protocolos Complementares de Sincronização Celular

The gene expression program of the cell cycle represents a critical step for understanding cell cycle-dependent processes and their role in diseases such ...

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene function. Gene knockout has been used to study these gene functions in vivo. The clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated protein 9 (CRISPR/Cas9) system is a powerful tool used to edit genomic DNA sequences to alter gene function. While the traditional approach has been to introduce CRISPR/Cas9 mRNA into the single cell embryos through microinjection, this can be a slow and inefficient process in catfish. Here, a detailed protocol for microinjection of channel catfish embryos with CRISPR/Cas9 protein is described. Briefly, eggs and sperm were collected and then artificial fertilization performed. Fertilized eggs were transferred to a Petri dish containing Holtfreter's solution. Injection volume was calibrated and then guide RNAs/Cas9 targeting the toll/interleukin 1 receptor domain-containing adapter molecule (TICAM 1) gene and rhamnose binding lectin (RBL) gene were microinjected into the yolk of one-cell embryos. The gene knockout was successful as indels were confirmed by DNA sequencing. The predicted protein sequence alterations due to these mutations included frameshift and truncated protein due to premature stop codons.

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

A simple and efficient microinjection protocol for gene editing in channel catfish embryos using the CRISPR/Cas9 system is presented. In this protocol, guide RNAs and Cas9 protein were microinjected into the yolk of one-cell embryos. This protocol has been validated by knocking out two channel catfish immune-related genes.

Microinjeção de proteína CRISPR/Cas9 em bagre do canal, Ictalurus punctatus, embriões para Gene Editing

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene ...

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

In research models of liver cancer, regeneration, inflammation, and fibrosis, flexible systems for in vivo gene expression and silencing are highly useful. Hydrodynamic tail vein injection of transposon-based constructs is an efficient method for genetic manipulation of hepatocytes in adult mice. In addition to constitutive transgene expression, this system can be used for more advanced applications, such as shRNA-mediated gene knock-down, implication of the CRISPR/Cas9 system to induce gene mutations, or inducible systems. Here, the combination of constitutive CreER expression together with inducible expression of a transgene or miR-shRNA of choice is presented as an example of this technique. We cover the multi-step procedure starting from the preparation of sleeping beauty-transposon constructs, to the injection and treatment of mice, and the preparation of liver tissue for analysis by immunostaining. The system presented is a reliable and efficient approach to achieve complex genetic manipulations in hepatocytes. It is specifically useful in combination with Cre/loxP-based mouse strains and can be applied to a variety of models in the research of liver disease.

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

Hydrodynamic tail vein injection of transposon-based integration vectors enables stable transfection of murine hepatocytes in vivo. Here, we present a practical protocol for transfection systems that enables the long-term constitutive expression of a single transgene or combined constitutive and doxycycline-inducible expression of a transgene or miR-shRNA in the liver.

Constitutivos e Inducible sistemas para modificação genética In Vivo dos hepatócitos de rato usando injeção de veia de cauda hidrodinâmica

In research models of liver cancer, regeneration, inflammation, and fibrosis, flexible systems for in vivo gene expression and silencing are highly ...

Transient Expression of Foreign Genes in Insect Cells (sf9) for Protein Functional Assay

The transient gene expression system is one of the most important technologies for performing protein functional analysis in the baculovirus in vitro cell culture system. This system was developed to express foreign genes under the control of the baculoviral promoter in transient expression plasmids. Furthermore, this system can be applied to a functional assay of either the baculovirus itself or foreign proteins. The most widely and commercially available transient gene expression system is developed based on the immediate-early gene (IE) promoter of Orgyia pseudotsugata multicapsid nucleopolyhedrovirus (OpMNPV). However, a low expression level of foreign genes in insect cells was observed. Therefore, a transient gene expression system was constructed for improving protein expression. In this system, recombinant plasmids were constructed to contain the target sequence under the control of the Drosophila heat shock 70 (Dhsp70) promoter. This protocol presents the application of this heat shock-based pDHsp/V5-His (V5 epitope with 6 histidine)/Spodoptera frugiperda cell (sf9 cell) system; this system is available not only for gene expression but also for evaluating the anti-apoptotic activity of candidate proteins in insect cells. Furthermore, this system can be either transfected with one recombinant plasmid or co-transfected two potentially functionally antagonistic recombinant plasmids in insect cells. The protocol demonstrates the efficiency of this system and provides a practical case of this technique.

Transient Expression of Foreign Genes in Insect Cells sf9 for Protein Functional Assay

This protocol describes a heat shock-induced protein expression system (pDHsp/V5-His/sf9 cell system), which can be used for either expressing foreign proteins or evaluating the anti-apoptotic activity of potential foreign proteins and their truncated amino acids in insect cells.

Expressão transiente de estrangeiros Genes em células de inseto (sf9) para o ensaio funcional da proteína

The transient gene expression system is one of the most important technologies for performing protein functional analysis in the baculovirus in vitro cell ...

Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to abiotic stresses and diseases. As the plant microbiome can be highly complex, low-cost, high-throughput methods such as amplicon-based sequencing of the 16S rRNA gene are often preferred for characterizing its microbial composition and diversity. However, the selection of appropriate methodology when conducting such experiments is critical for reducing biases that can make analysis and comparisons between samples and studies difficult. This protocol describes in detail a standardized methodology for the collection and extraction of DNA from soil, rhizosphere, and root samples. Additionally, we highlight a well-established 16S rRNA amplicon sequencing pipeline that allows for the exploration of the composition of bacterial communities in these samples, and can easily be adapted for other marker genes. This pipeline has been validated for a variety of plant species, including sorghum, maize, wheat, strawberry, and agave, and can help overcome issues associated with the contamination from plant organelles.

Here, we describe a protocol to obtain amplicon sequence data of soil, rhizosphere, and root endosphere microbiomes. This information can be used to investigate the composition and diversity of plant-associated microbial communities, and is suitable for the use with a wide range of plant species.

Explorando o microbioma da raiz: extraindo dados da comunidade bacteriana do solo

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to ...

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

micro-RNAs (miRNAs) are single-stranded RNA transcripts that bind to messenger RNAs (mRNAs) and inhibit their translation or promote their degradation. To date, miRNAs have been implicated in a large number of biological and disease processes, which has signified the need for the reliable detection methods of miRNA transcripts. Here, we describe a detailed protocol for digoxigenin-labeled (DIG) Locked Nucleic Acid (LNA) probe-based miRNA detection, combined with protein immunostaining on mouse heart sections. First, we performed an in situ hybridization technique using the probe to identify miRNA-182 expression in heart sections from control and cardiac hypertrophy mice. Next, we performed immunostaining for cardiac Troponin T (cTnT) protein, on the same sections, to co-localize miRNA-182 with the cardiomyocyte cells. Using this protocol, we were able to detect miRNA-182 through an alkaline phosphatase based colorimetric assay, and cTnT through fluorescent staining. This protocol can be used to detect the expression of any miRNA of interest through DIG-labeled LNA probes, and relevant protein expression on mouse heart tissue sections.

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

micro-RNAs (miRNAs) are short and highly homologous RNA sequences, serving as post-transcriptional regulators of messenger RNAs (mRNAs). Current miRNA detection methods vary in sensitivity and specificity. We describe a protocol that combines in situ hybridization and immunostaining for concurrent detection of miRNA and protein molecules on mouse heart tissue sections.

Tecido-específica miRNA Expression Profiling Mouse coração seções usando em hibridação in Situ

micro-RNAs (miRNAs) are single-stranded RNA transcripts that bind to messenger RNAs (mRNAs) and inhibit their translation or promote their degradation. To ...

Inducible and Reversible Dominant-negative (DN) Protein Inhibition

Dominant-negative (DN) protein inhibition is a powerful method to manipulate protein function and offers several advantages over other genome-based approaches. For example, although chimeric and Cre-LoxP targeting strategies have been widely used, the intrinsic limitations of these strategies (i.e., leaky promoter activity, mosaic Cre expression, etc.) have significantly restricted their application. Moreover, a complete deletion of many endogenous genes is embryonically lethal, making it impossible to study gene function in postnatal life. To address these challenges, we have made significant changes to an early genetic engineering protocol and combined a short (transgenic) version of the Rb1 gene with a lysosomal protease procathepsin B (CB), to generate a DN mouse model of Rb1 (CBRb). Due to the presence of a lysosomal protease, the entire CB-RB1 fusion protein and its interacting complex are routed for proteasome-mediated degradation. Moreover, the presence of a tetracycline inducer (rtTA) element in the transgenic construct enables an inducible and reversible regulation of the RB1 protein. The presence of a ubiquitous ROSA-CAG promoter in the CBRb mouse model makes it a useful tool to carry out transient and reversible Rb1 gene ablation and provide researchers a resource for understanding its activity in virtually any cell type where RB1 is expressed.

Inducible and Reversible Dominant-negative DN Protein Inhibition

Here we present a protocol to develop a dominant-negative inducible system, in which any protein can be conditionally inactivated by reversibly overexpressing a dominant-negative mutant version of it.

Inibição de proteína inducible e reversível dominante-negativo (DN)

Dominant-negative (DN) protein inhibition is a powerful method to manipulate protein function and offers several advantages over other genome-based ...