This research was supported by the Agriculture and Food Research Initiative competitive grant 2015-67012-22773 from the USDA National Institute of Food and Agriculture to K.L.H.

1. Preparação de sobrenadante a ser testados à actividade <ol><li> Prepara-se uma solução de estoque de 0,5 mg / ml de mitomicina C por dissolução da quantidade apropriada em M estéril MgSO4 tampão de 0,1 (por exemplo, 1 mg de mitomicina C / 2 ml de tampão). estoque Armazenar a 4 ° C num recipiente protegido da luz (mitomicina C é sensível à luz). </li><li> Inocular uma única colónia de P. syringae em 3 ml de meio B de King (KB) de caldo 14. Incubar durante a noite com agitação (200 rpm) à temperatura ambiente (21-25 ° C). </li><li> Na manhã seguinte, dilui-se a cultura de caldo de 1/100 em 3 ml de caldo fresco KB. Incubar durante 3-4 horas com agitação à temperatura ambiente. Adicionar mitomicina C (0,5 ug / ml, concentração final). Incubar a cultura durante a noite com agitação à temperatura ambiente. NOTA: A mitomicina C provoca quebras de ADN de cadeia dupla, estimulando assim a resposta SOS da célula, levando à produção de ambos bacteriófago e bacteriocinas. </li><li> Pellet 1-2 ml de mitomicina C culturas induzidas por centrifugação a 20000 xg durante 5 minutos numa microcentrífuga de bancada. </li><li> Remover e esterilizar os sobrenadantes da cultura, quer por passagem do sobrenadante através de um filtro de tamanho de poro de 0,22 um, ou por tratamento do sobrenadante com clorofórmio (100 ul de clorofórmio por cada 1 ml de sobrenadante). <ol><li> Se usando clorofórmio, vortex a mistura durante 15 segundos e deixar incubar à temperatura ambiente durante 1 h. Após a incubação, centrifugar a mistura a 20000 xg durante 5 min. NOTA: Clorofórmio eficazmente mata células por solubilização de suas membranas. O benefício da utilização de clorofórmio, durante a esterilização de filtro é que é mais barato e mais fácil de dimensionar-se se o processamento de muitos (&gt; 20) amostras de cada vez. Pode haver uma possibilidade de que uma dada actividade de morte é perdido após o tratamento com clorofórmio como resultado da partição para a fase orgânica. </li><li> Remover a fase superior, aquosa, utilizando uma pipeta de 1 ml para um fresco, esterilizado de 1,5 ou 2,0 mltubo de microcentrífuga. Tenha cuidado para não transferir qualquer da camada de clorofórmio inferior (que é melhor para remover menos da fase aquosa para evitar carry-over). </li><li> Incubar o sobrenadante transferido destampei em um exaustor para permitir que o clorofórmio residual para evaporar (várias horas). sobrenadantes armazenar a 4 ° C. </li></ol></li></ol> 2. Separação e Concentração de Elevado Peso Molecular Os compostos bactericidas por polietilenoglicol (PEG) Precipitação <ol><li> Para o sobrenadante estéril, adicionar NaCl e PEG 8000 a concentrações finais de 1 H e 10%, respectivamente. Repetidamente inverter a amostra até que tanto o NaCl e PEG são completamente dissolvido. Incubar as amostras num banho de gelo durante 1 hora ou durante a noite a 4 ° C. </li><li> Centrifugar as amostras a 16.000 xg durante 30 min a 4 ° C. A pelete deve formar, na parte inferior do tubo de centrifugação. Decantar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em volume desejado (por exemplo, 1/10 ou 1/100 do volume original é sobrenadanteUME) de tampão (Tris 10 mM, MgSO4 10 mM, pH 7,0) por pipetagem repetida. </li><li> Remover PEG residual por duas extracções sequenciais com um volume igual de clorofórmio. <ol><li> Combinar clorofórmio com o sedimento ressuspenso e vortex durante 10 a 15 segundos, em seguida, centrifuga-se a mistura a 20000 xg durante 5 min. Transferir a fase superior, aquosa para um tubo de microcentrífuga novo. Repetir esta extracção até branco sem interface entre a fase aquosa e orgânica é visível (normalmente 2 extracções no total). Permitir clorofórmio residual a evaporar-se a partir de sobrenadantes extraídos numa hotte. </li></ol></li></ol> 3. Preparação de sobreposição e Testes sobrenadantes para Atividade <ol><li> Inocular uma colónia isolada de uma estirpe de P. syringae a ser testada para a sensibilidade em 3 mL de KB, incubar durante a noite com agitação à temperatura ambiente. </li><li> Na manhã seguinte, de volta diluir a cultura 1/100 em KB fresco. Incubar 3-4 horas com agitação a temperatu quartoré. </li><li> Prepare agar água esterilizada por autoclavagem uma suspensão 0,35-0,7% de agar em água ultrapura (v / w). NOTA: Um estoque de agar água macia pode ser derretido em um forno de microondas e reutilizado várias vezes, sobreposição fresco não precisa estar preparado para cada experimento. Se agar água é reutilizada, é fundamental para garantir que ele é completamente derretido seguinte microondas. Se não, a sobreposição terá uma textura granulada mediante solidificação que vai fazer difícil interpretação. Se isto ocorrer, derreter o agar durante vários minutos mais longos do que no microondas feito anteriormente. </li><li> Manter o agar mole fundido num banho de água a 60 ° C antes de usar. Usando uma pipeta serológica estéril, transferência de 3 ml de agar mole para um tubo de cultura estéril. Devolver o tubo de cultura com banho de água para manter num estado fundido. </li><li> Para verter a superposição, primeiro permitir que o agar derretido para se refrescar (que deve sentir-se quente, mas não quente ao toque), mas não permita solidificar. </li><li> Numa hote estéril, inocular 100 ml dea cultura da estirpe de teste em agar mole e agitar com vortex para misturar. Gire a cultura com a mão por 10-15 segundos, em seguida, despeje em um agar de fundo (KB agar). Inclinar a placa em todas as direcções para garantir o agar mole cobre uniformemente o ágar de fundo. NOTA: O ágar de fundo pode ser qualquer (1,5% de agar) meio solidificado em que a estirpe de teste cresce vigorosamente. Para um diâmetro de 100 mm numa caixa de Petri padrão, utilizar ~ 20 ml de meio derretida. O ágar de fundo pode ser preparado de várias semanas antes do tempo (se mantida a 4 ° C sem secagem) ou podem ser preparadas no mesmo dia. Se preparou o mesmo dia em que realizar a sobreposição, é melhor fazê-lo antes do passo 3.4. </li><li> Cobrir a placa e permitir que ele 20-30 minutos para solidificar. Tenha cuidado para não perturbar o prato enquanto solidificando. </li><li> Uma vez solidificado, spot 2-5 jul de sobrenadante (gerado nas secções 1 e 2, acima) sobre a sobreposição. Permitir que as placas a incubar durante a noite à temperatura ambiente. Observe e resultados recordes na manhã seguinte. Anotepode ser útil para realizar e identificar a partir de uma diluição em série do sobrenadante. Isso permitirá que os pesquisadores a distinguir entre bacteriófagos e da atividade de compensação bacteriocina. Neste caso, recomenda-se realizar a 1: 5 ou 1:10 diluições. </li></ol>

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(Chapter 4), 45-92 (2007).</li><li>Kawai, Y., Saito, T., Uemura, J., Itoh, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Detection+Method+for+Bacteriocin+and+Distribution+of+Bacteriocin-producing+Strains+in+Lactobacillus+acidophilusGroup+Lactic+Acid+Bacteria+Isolated+from+Human+Feces.">Rapid Detection Method for Bacteriocin and Distribution of Bacteriocin-producing Strains in Lactobacillus acidophilusGroup Lactic Acid Bacteria Isolated from Human Feces.</a> Biosci Biotechnol Biochem. 61 (1), 179-182 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

A técnica de sobreposição-ágar mole descrita aqui tem sido amplamente aplicada por muitas décadas por pesquisadores interessados ​​em bacteriófagos ou bacteriocinas. Os principais benefícios desta abordagem é que ela é simples, barato e relativamente fácil de interpretar. Ao combinar a sobreposição soft-agar com precipitação com PEG e diluição em série, os agentes antimicrobianos podem ser separados em elevado vs agentes de baixo peso molecular, e replicativas versus não-replicativo agentes (isto é, contra bacteriófagos tailocin, respectivamente). Finalmente, a incorporação de manipulação genética alvo (supressão e complementação) de bacteriocina putativo ou loci profago firmemente pode determinar a identidade de um dado composto antagonista. Nós temos usado recentemente este método para descrever um novo bacteriófago derivado bacteriocina prevalente entre Pseudomonas syringae estirpes 9. Os meios de crescimento e condições indicadas neste trabalho protocolo bem para Pseudomonas syringae e provavelmente suficiente para outras bactérias gram-negativas que crescem vigorosamente sob estas condições. No entanto, os investigadores usam este método vai quer para optimizar o tempo, o meio de cultura, o método de indução, temperatura de incubação e para o seu sistema. Os parâmetros críticos incluem induzir a produção de cultura, enquanto na fase logarítmica de crescimento, bem como a sobreposição semeando soft-agar com cultura em fase logarítmica suficiente para assegurar uma distribuição uniforme bacteriana, mas não excessiva da cultura, o que irá obscurecer zonas de compensação potenciais. Existem muitas bacteriocinas que não são induzidos como parte da resposta SOS, mas sim são induzidos através de sistemas de sensor de quorum baseados em péptidos (particularmente bacteriocinas Gram-positivas 15), assim, um investigador pode querer rastrear vários métodos diferentes de indução (tais como a modificação do conteúdo de nutrientes de induzir médio, ou permitindo a incubação prolongada da estirpe produtora). quando se utilizaNesta técnica, a sobreposição soft-agar deve ser completamente derretida e mantida a 55-60 ° C antes da adição da estirpe semeadura. Tivemos várias experiências em que o agar mole não foi completamente derretido (embora visualmente parecia ser) e resultou em uma sobreposição com um aspecto granulado. Os resultados de um granulado de sobreposição pode ainda ser geralmente interpretável, no entanto, esta é dependente da força de inibição (inibição mais fraca será mais difícil de observar). Um, variável de confusão final a considerar quando se utiliza esta técnica é que a temperatura do fundido de ágar é permitido tempo suficiente para arrefecer antes da inoculação com a estirpe de sementeira, de modo a evitar a morte da estirpe de semeadura. Para evitar esse problema, podemos garantir a-agar macio é quente, mas não quente, ao toque. Ao longo destas linhas, também observamos que se dar tempo inadequado para uma cultura de semeadura para se aclimatar ao agar fundido, antes de despejar a sobreposição, recuperamos geralmente pobres g bacterianaRESCIMENTO, o que torna a interpretação de inibição específica difícil ou impossível de interpretar. É por isso que permitem 10-15 segundos adicionais de incubação entre vórtex e despejando a sobreposição. O trade-off entre a manutenção do agar em um estado completamente fundido (mais quente é melhor), mas não letal para a estirpe semeadura (mais quente não é melhor) é aquele que provavelmente terá de ser determinada por um investigador através de tentativa e erro. Se um passo de precipitação de PEG é utilizada, seria benéfico incluir um controlo negativo, onde um meio de caldo estéril é processado identicamente ao sobrenadante da cultura. Isto irá assegurar que matar actividade não é o resultado de PEG residual ou clorofórmio dentro do sobrenadante da amostra. Como ambos os bacteriófagos e bacteriocinas tendem a ser altamente específico, não é incomum encontrar nenhuma actividade de morte aparente, com uma dada combinação de estirpes. Isto pode resultar de uma variedade de re-específica estirpemecanismos sistência, sendo um deles de que a tensão testador quer faltas ou tem uma versão não reconhecida do receptor necessário para a segmentação por um determinado bacteriocina ou bacteriófago. Um método alternativo, o método de rastreio de bacteriocina foi descrito por Kawai et al. , Mas sofre de desvantagens e não foi amplamente adotado 16. Especificamente, esta técnica requer observando amostras de caldo a intervalos de tempo que pode ser pesada, e não permite a discriminação entre as actividades de matança de bacteriófagos derivada e derivada bacteriocina. As principais limitações desta técnica é que ele não é bem adequado para os organismos que não crescem de forma robusta (e, assim, faltará zonas de compensação facilmente discerníveis), ou que prophages porto ou bacteriocinas que não são robustamente produzidos sob condições de laboratório. Adaptação desta técnica para detectar bacteriocinas produzidas em amostras ambientais que tanto expandir o utilitáriodesta técnica e facilitar um maior conhecimento sobre o papel das bacteriocinas dentro de ambientes naturais.

Recentemente, tem havido um interesse significativo em aprofundar a compreensão da ecologia microbiana (particularmente os microbiomas de vários ambientes), bem como novos compostos anti-bacterianos para uso no combate a agentes patogénicos resistentes aos antibióticos 1,2. Um tema de interligação entre estes interesses é compreender as interacções antagonistas entre estirpes de bactérias em seu ambiente natural. Há inúmeras maneiras em que as bactérias antagonizam concorrentes 3. Bacteriocinas, um grupo diversificado de compostos proteicos, antibacterianos, têm sido estudados para determinar seu papel na mediação antagonismo interbacterial, com duas das espécies mais estudadas sendo Pseudomonas aeruginosa 4,5 e Escherichia coli 6, importantes patógenos humanos. Além de bacteriocinas, profagos induzidas também podem agir como agentes anticompetitor, permitindo uma estirpe para invadir um nicho que já é colonizada 7. Pseudomonas syringae é um agente patogénico de plantas conhecido por produzir uma variedade de agentes antimicrobianos, incluindo bacteriocinas única proteína 8, bacteriocinas derivado de cauda de bacterióf agos (9 tailocins denominados), bem como metabolitos secundários não proteináceos 10. Recentemente, tem havido interesse em compreender como estes antimicrobianos influenciar a ecologia deste organismo, bem como a forma como eles podem ser aproveitados para controlar doenças de plantas 11. Um método amplamente utilizado para estudar ambos bacteriocinas e bacteriófago é a técnica de sobreposição de soft-agar. Este método foi descrito pela primeira vez por Gratia em 1936 para a ajuda ao enumerar bacteriófago 12,13. Aqui descreve-se a aplicação do método da sobrecamada de ágar mole, em combinação com a manipulação genética direccionada e polietileno glicol precipitação (PEG), para distinguir entre os três agentes antimicrobianos diferentes (um bacteriófago, um elevado peso molecular Bacteriocin, e um baixo peso molecular bacteriocina) produzido por uma única estirpe bacteriana. A vantagem dessa abordagem é que é relativamente simples e barato, que é por isso que, apesar de ser decididamente &#39;low-tech&#39;, ainda é amplamente utilizado.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="717">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Mitomycin C</td>
			<td style="width:179px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:140px;">sc-3514</td>
			<td style="width:167px;">Carcinogenic. use appropriate PPE (i.e. gloves, eye protection, and face mask), particularly when preparing the stock solution.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chloroform</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34854</td>
			<td>Acutely toxic, respiratory hazard. Use appropriate PPE (glove and eye shield), handle open containers within a chemical fume hood.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polyethylene Glycol (PEG)</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0159</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bacteriological grade agar</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>20-274</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of the soft-agar overlay technique to screen for bacterially produced inhibitory compounds

A técnica de sobreposição-ágar mole foi originalmente desenvolvido mais de 70 anos atrás e tem sido amplamente utilizada em várias áreas de investigação microbiológica, incluindo o trabalho com bacteriófagos e bacteriocinas, agentes antibacterianos proteicas. Esta abordagem é relativamente barata, com o mínimo de requisitos de recursos. Esta técnica consiste em detectar sobrenadante a partir de uma estirpe dadora (potencialmente tóxico que alberga um composto (s)) sobre uma camada de agar macio solidificada que é semeado com uma estirpe bacteriana de ensaio (potencialmente sensíveis ao composto tóxico (s)). Nós utilizamos esta técnica para rastrear uma biblioteca de Pseudomonas syringae estirpes de morte intra-específica. Ao combinar esta abordagem com um passo de precipitação e deleções de genes-alvo, vários compostos tóxicos produzidos pela mesma estirpe podem ser diferenciadas. Os dois agentes antagônicos comumente recuperados usando esta técnica são bacteriófagos e bacteriocinas. Estes dois agentes podem ser diferenciadas usandodois testes adicionais simples. A realização de uma diluição em série de um sobrenadante contendo o bacteriófago resultará em placas individuais se tornando menos em número com uma maior diluição, enquanto que a diluição em série de um sobrenadante contendo bacteriocina resultará uma zona de compensação, que se torna mais uniformemente turvo com uma maior diluição. Além disso, um bacteriófago vai produzir uma zona de compensação, quando visto numa camada de agar macio fresco semeada com a mesma estirpe, ao passo que uma bacteriocina não vai produzir uma zona de compensação, quando transferidos para um relvado agar mole fresco, devido à diluição da bacteriocina.

A combinação da camada de agar macio e precipitação com PEG pode ser utilizado para identificar e caracterizar diferentes agentes antimicrobianos produzidos pela mesma estirpe. A Figura 1 mostra duas estirpes de P. syringae (A e B) que são inibidas por uma terceira estirpe da mesma espécie. As duas estirpes, no entanto, são inibidos por diferentes bacteriocinas. A zona de clareira na estirpe A exibe uma borda afiada, enquanto que a zona de clareira na estirpe B é maior, e exibe uma borda não afiada. manipulações genéticas dentro da estirpe produtora que, especificamente inactivar ou o tailocin (tailocin deficiente) ou baixo peso molecular bacteriocina confirm (bacteriocina deficiente) que estirpes A e B são sensíveis às bacteriocinas distintas. A Figura 2 mostra que a morte mediada por de bacteriófago podem ser distinguidos de outros agentes antimicrobianos não-replicativas comparando uma série de diluição. Porque ambas as bacteriocinas eprofago pode ser induzida por tratamento mitomicina C, as actividades destes dois agentes podem se assemelham uns aos outros (em particular se o fago activado é abundante). No caso de compensação mediada por bacteriófagos, a diluição do sobrenadante vai resolver em placas individuais de compensação (zonas) enquanto compensação bacteriocina mediada não resolver em tais placas. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/55064/55064fig1.jpg" /> Figura 1: diferenciação fenotípica de vários agentes anti-microbianos produzidos pela mesma estirpe. A estirpe A é sensível a uma bacteriocina de elevado peso molecular (tailocin), mas não um peso molecular baixo alternativa bacteriocina, tal como evidenciado pela falta de compensação na estirpe deficiente tailocin, mas não a bacteriocina estirpe deficiente. Por outro lado, a estirpe B é insensível à tailocin, mas é sensível à bacteriocina baixo peso molecular. O tailocin é efficiently recuperado após precipitação com PEG, enquanto bacteriocinas de baixo peso molecular não são. WT = tipo selvagem. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55064/55064fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55064/55064fig2.jpg" /> Figura 2: A distinção entre antimicrobianos não-replicativas e bacteriófagos. (A) A diluição de um alto título de bacteriófagos resultados em placas individuais que se tornam menos numerosas (topo de título elevado, baixo título inferior). (B) Diluição de bacteriocinas resultado em uniformemente menos compensação que não se resolve em placas individuais. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55064/55064fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Use of the Soft-agar Overlay Technique to Screen for Bacterially Produced Inhibitory Compounds

We describe a simple method for screening bacterial cultures for the production of compounds inhibitory towards other bacteria.

Uso da técnica de sobreposição de Soft-agar para triagem de compostos inibidores produzida por bactérias

The soft-agar overlay technique was originally developed over 70 years ago and has been widely used in several areas of microbiological research, ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

32.0K visualizações.  University of Arizona. We describe a simple method for screening bacterial cultures for the production of compounds inhibitory towards other bacteria. 

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Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

Legionella pneumophila, the causative agent of a severe pneumonia named Legionnaires&#39; disease, is an important human pathogen that infects and replicates within alveolar macrophages. Its virulence depends on the Dot/Icm type IV secretion system (T4SS), which is essential to establish a replication permissive vacuole known as the Legionella containing vacuole (LCV). L. pneumophila infection can be modeled in mice however most mouse strains are not permissive, leading to the search for novel infection models. We have recently shown that the larvae of the wax moth Galleria mellonella are suitable for investigation of L. pneumophila infection. G. mellonella is increasingly used as an infection model for human pathogens and a good correlation exists between virulence of several bacterial species in the insect and in mammalian models. A key component of the larvae&#39;s immune defenses are hemocytes, professional phagocytes, which take up and destroy invaders. L. pneumophila is able to infect, form a LCV and replicate within these cells. Here we demonstrate protocols for analyzing L. pneumophila virulence in the G. mellonella model, including how to grow infectious L. pneumophila, pretreat the larvae with inhibitors, infect the larvae and how to extract infected cells for quantification and immunofluorescence microscopy. We also describe how to quantify bacterial replication and fitness in competition assays. These approaches allow for the rapid screening of mutants to determine factors important in L. pneumophila virulence, describing a new tool to aid our understanding of this complex pathogen.

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

The larva of the wax moth Galleria mellonella was recently established as an in vivo model to study Legionella pneumophila infection. Here, we demonstrate fundamental techniques to characterize the pathogenesis of Legionella in the larvae, including inoculation, measurement of bacterial virulence and replication as well as extraction and analysis of infected hemocytes.

Utilização de<em&gt; Galleria mellonella</em&gt; Como um organismo modelo para estudar<em&gt; Legionella pneumophila</em&gt; Infecção

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Imunologia e Infecção

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote its motility and dissemination. New work has shown that proteins involved in actin-based motility are also linked to autophagy, an intracellular degradation process crucial for cell autonomous immunity. Strikingly, host cells may prevent actin-based motility of S. flexneri by compartmentalizing bacteria inside &#8216;septin cages&#8217; and targeting them to autophagy. These observations indicate that a more complete understanding of septins, a family of filamentous GTP-binding proteins, will provide new insights into the process of autophagy. This report describes protocols to monitor autophagy-cytoskeleton interactions caused by S. flexneri in vitro using tissue culture cells and in vivo using zebrafish larvae. These protocols enable investigation of intracellular mechanisms that control bacterial dissemination at the molecular, cellular, and whole organism level.

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

To counteract pathogen dissemination, host cells reorganize their cytoskeleton to compartmentalize bacteria and induce autophagy. Using Shigella infection of tissue culture cells, host and pathogen determinants underlying this process are identified and characterized. Using zebrafish models of Shigella infection, the role of discovered molecules and mechanisms are investigated in vivo.

Utilização de<em&gt; Shigella flexneri</em&gt; Para estudar interações Autophagy-Cytoskeleton

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote ...

Analysis of the Epithelial Damage Produced by Entamoeba histolytica Infection

Entamoeba histolytica is the causative agent of human amoebiasis, a major cause of diarrhea and hepatic abscess in tropical countries. Infection is initiated by interaction of the pathogen with intestinal epithelial cells. This interaction leads to disruption of intercellular structures such as tight junctions (TJ). TJ ensure sealing of the epithelial layer to separate host tissue from gut lumen. Recent studies provide evidence that disruption of TJ by the parasitic protein EhCPADH112 is a prerequisite for E. histolytica invasion that is accompanied by epithelial barrier dysfunction. Thus, the analysis of molecular mechanisms involved in TJ disassembly during E. histolytica invasion is of paramount importance to improve our understanding of amoebiasis pathogenesis. This article presents an easy model that allows the assessment of initial host-pathogen interactions and the parasite invasion potential. Parameters to be analyzed include transepithelial electrical resistance, interaction of EhCPADH112 with epithelial surface receptors, changes in expression and localization of epithelial junctional markers and localization of parasite molecules within epithelial cells.

Analysis of the Epithelial Damage Produced by Entamoeba histolytica Infection

Human infection by Entamoeba histolytica leads to amoebiasis, a major cause of diarrhea in tropical countries. Infection is initiated by pathogen interactions with intestinal epithelial cells, provoking the opening of cell-cell contacts and consequently diarrhea, sometimes followed by liver infection. This article provides a model to assess the early host-pathogen interactions to improve our understanding of amoebiasis pathogenesis.

Análise do dano epitelial Produzido pela<em&gt; Entamoeba histolytica</em&gt; Infecção

Entamoeba histolytica is the causative agent of human amoebiasis, a major cause of diarrhea and hepatic abscess in tropical countries. Infection is ...

Using the Overlay Assay to Qualitatively Measure Bacterial Production of and Sensitivity to Pneumococcal Bacteriocins

Streptococcus pneumoniae colonizes the highly diverse polymicrobial community of the nasopharynx where it must compete with resident organisms. We have shown that bacterially produced antimicrobial peptides (bacteriocins) dictate the outcome of these competitive interactions. All fully-sequenced pneumococcal strains harbor a bacteriocin-like peptide (blp) locus. The blp locus encodes for a range of diverse bacteriocins and all of the highly conserved components needed for their regulation, processing, and secretion. The diversity of the bacteriocins found in the bacteriocin immunity region (BIR) of the locus is a major contributor of pneumococcal competition. Along with the bacteriocins, immunity genes are found in the BIR and are needed to protect the producer cell from the effects of its own bacteriocin. The overlay assay is a quick method for examining a large number of strains for competitive interactions mediated by bacteriocins. The overlay assay also allows for the characterization of bacteriocin-specific immunity, and detection of secreted quorum sensing peptides. The assay is performed by pre-inoculating an agar plate with a strain to be tested for bacteriocin production followed by application of a soft agar overlay containing a strain to be tested for bacteriocin sensitivity. A zone of clearance surrounding the stab indicates that the overlay strain is sensitive to the bacteriocins produced by the pre-inoculated strain. If no zone of clearance is observed, either the overlay strain is immune to the bacteriocins being produced or the pre-inoculated strain does not produce bacteriocins. To determine if the blp locus is functional in a given strain, the overlay assay can be adapted to evaluate for peptide pheromone secretion by the pre-inoculated strain. In this case, a series of four lacZ-reporter strains with different pheromone specificity are used in the overlay.

Competition in Streptococcus pneumoniae is mediated by bacteriocins, small antimicrobial peptides with inhibitory activity towards pneumococcus and other related species.&#160; Here we describe an optimized bacterial overlay assay that allows for the characterization of bacteriocin activity and inhibitory spectrum, bacteriocin-specific immunity, and detection of secreted quorum sensing peptides.

Usando a sobreposição de ensaio para medir qualitativamente produção bacteriana e sensibilidade para pneumocócica Bacteriocinas

Streptococcus pneumoniae colonizes the highly diverse polymicrobial community of the nasopharynx where it must compete with resident organisms.  We have ...

Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems

Plaque assays remain one of the most accurate methods for the direct quantification of infectious virons and antiviral substances through the counting of discrete plaques (infectious units and cellular dead zones) in cell culture. Here we demonstrate how to perform a basic plaque assay, and how differing overlays and techniques can affect plaque formation and production. Typically solid or semisolid overlay substrates, such as agarose or carboxymethyl cellulose, have been used to restrict viral spread, preventing indiscriminate infection through the liquid growth medium. Immobilized overlays restrict cellular infection to the immediately surrounding monolayer, allowing the formation of discrete countable foci and subsequent plaque formation. To overcome the difficulties inherent in using traditional overlays, a novel liquid overlay utilizing microcrystalline cellulose and carboxymethyl cellulose sodium has been increasingly used as a replacement in the standard plaque assay. Liquid overlay plaque assays can be readily performed in either standard 6 or 12 well plate formats as per traditional techniques and require no special equipment. Due to its liquid state and subsequent ease of application and removal, microculture plate formats may alternatively be utilized as a rapid, accurate and high throughput alternative to larger scale viral titrations. Use of a non heated viscous liquid polymer offers the opportunity to streamline work, conserves reagents, incubator space, and increases operational safety when used in traditional or high containment labs as no reagent heating or glassware are required. Liquid overlays may also prove more sensitive than traditional&#160;overlays for certain heat labile viruses.

Plaque assays are the gold standard for viral quantification, utilizing entrapping overlays on host cellular monolayers to determine viral titers. While various semisolid overlays have traditionally been used, here we demonstrate plaque techniques comparing semisolid overlays to a novel liquid microcrystalline cellulose among several families of viruses.

Concentração Determinação Viral Através de placa Ensaios: Usando tradicionais e novos Sistemas de sobreposição

Plaque assays remain one of the most accurate methods for the direct quantification of infectious virons and antiviral substances through the counting of ...

Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds

Cell-based systems are useful for discovering antiviral agents. Dissecting the viral life cycle, particularly the early entry stages, allows a mechanistic approach to identify and evaluate antiviral agents that target specific steps of the viral entry. In this report, the methods of examining viral inactivation, viral attachment, and viral entry/fusion as antiviral assays for such purposes are described, using hepatitis C virus as a model. These assays should be useful for discovering novel antagonists/inhibitors to early viral entry and help expand the scope of candidate antiviral agents for further drug development.

Here, we present a protocol that examines specific steps of the viral entry to identify and evaluate novel antiviral agents.

No início virais Ensaios de entrada para a identificação e avaliação de compostos antivirais

Cell-based systems are useful for discovering antiviral agents. Dissecting the viral life cycle, particularly the early entry stages, allows a mechanistic ...

The Use of Flow Cytometry to Assess the State of Chromatin in T Cells

During a proper immune response, quiescent T cells become activated upon antigen presentation to their antigen-specific T cell receptor. This leads to clonal proliferation of only those T cells that bear a receptor that recognizes the antigen. Chromatin decondensation is a hallmark of T cell activation and is required for T cells to acquire the ability to proliferate after antigen engagement. This change in chromatin condensation can be detected using antibodies raised against histone proteins. These antibodies cannot bind to their epitopes in na&#239;ve T cells as well as they can in activated T cells. We describe how to simultaneously stain T cell-specific surface markers, track viability with a fixable dead cell stain, and measure chromatin status via intracellular staining of Histone H3 proteins. Stained cells are analyzed by flow cytometry and chromatin condensation status is measured as the mean fluorescence intensity (MFI) of the Histone H3 stain. Chromatin decondensation during T cell activation is demonstrated as an increase in the MFI

Flow cytometry can be utilized to assess the state of chromatin within T cells. This protocol allows scientists to interpret evidence of chromatin decondensation during T cell activation demonstrated by an increase in the mean florescence intensity (MFI) of fluorescent Histone H3 antibodies

A citometria de fluxo para avaliar o estado de cromatina em células T

During a proper immune response, quiescent T cells become activated upon antigen presentation to their antigen-specific T cell receptor. This leads to ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple condensation reactions. DHDDS (dehydrodolichyl diphosphate synthase) is a eukaryotic long-chain cis-PT (forming cis double bonds from the condensation reaction) that catalyzes chain elongation of farnesyl diphosphate (FPP, an allylic diphosphate) via multiple condensations with isopentenyl diphosphate (IPP). DHDDS is of biomedical importance, as a non-conservative mutation (K42E) in the enzyme results in retinitis pigmentosa, ultimately leading to blindness. Therefore, the present protocol was developed in order to acquire large quantities of purified DHDDS, suitable for mechanistic studies. Here, the usage of protein fusion, optimized culture conditions and codon-optimization were used to allow the overexpression and purification of functionally active human DHDDS in E. coli. The described protocol is simple, cost-effective and time sparing. The homology of cis-PT among different species suggests that this protocol may be applied for other eukaryotic cis-PT as well, such as those involved in natural rubber synthesis.

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

A simple protocol for overexpression and purification of codon-optimized, human cis-prenyltransferase, under non-denaturing conditions, from Escherichia coli, is described, along with an enzymatic activity assay. This protocol can be generalized for production of other cis- prenyltransferase proteins in quantity and quality suitable for mechanistic studies.

Sobreexpressão e purificação do ser humano<em&gt; Cis</em&gt; -preniltransferase em<em&gt; Escherichia coli</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor microenvironment and the underlying mechanism is still largely unknown. The lack of a consistent and reliable source of NK cells limits the research progress of NK cell immunity. Here, we report an in vitro system that can provide high quality and quantity of bone marrow-derived murine NK cells under a feeder-free condition. More importantly, we also demonstrate that siRNA-mediated gene silencing successfully inhibits the E4bp4-dependent NK cell maturation by using this system. Thus, this novel in vitro NK cell differentiating system is a biomaterial solution for immunity research.

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Here, we present a protocol to mass-produce gene-silencing murine NK cells by using a feeder-free differentiation system for mechanistic study in vitro and in vivo.

Um novo sistema alimentador-livre para produção em massa de murino Natural Killer Cells In Vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...

Use of the Invertebrate Galleria mellonella as an Infection Model to Study the Mycobacterium tuberculosis Complex

Tuberculosis is the leading global cause of infectious disease mortality and roughly a quarter of the world&#8217;s population is believed to be infected with Mycobacterium tuberculosis. Despite decades of research, many of the mechanisms behind the success of M. tuberculosis as a pathogenic organism remain to be investigated, and the development of safer, more effective antimycobacterial drugs are urgently needed to tackle the rise and spread of drug resistant tuberculosis. However, the progression of tuberculosis research is bottlenecked by traditional mammalian infection models that are expensive, time consuming, and ethically challenging. Previously we established the larvae of the insect Galleria mellonella (greater wax moth) as a novel, reproducible, low cost, high-throughput and ethically acceptable infection model for members of the M. tuberculosis complex. Here we describe the maintenance, preparation, and infection of G. mellonella with bioluminescent Mycobacterium bovis BCG lux. Using this infection model, mycobacterial dose dependent virulence can be observed, and a rapid readout of in vivo mycobacterial burden using bioluminescence measurements is easily achievable and reproducible. Although limitations exist, such as the lack of a fully annotated genome for transcriptomic analysis, ontological analysis against genetically similar insects can be carried out. As a low cost, rapid, and ethically acceptable model for tuberculosis, G. mellonella can be used as a pre-screen to determine drug efficacy and toxicity, and to determine comparative mycobacterial virulence prior to the use of conventional mammalian models. The use of the G. mellonella-mycobacteria model will lead to a reduction in the substantial number of animals currently used in tuberculosis research.

Use of the Invertebrate Galleria mellonella as an Infection Model to Study the Mycobacterium tuberculosis Complex

Galleria mellonella was recently established as a reproducible, cheap, and ethically acceptable infection model for the Mycobacterium tuberculosis complex. Here we describe and demonstrate the steps taken to establish successful infection of G. mellonella with bioluminescent Mycobacterium bovis BCG lux.

Uso do invertebrado Galleria mellonella como modelo de infecção para estudo do complexo Mycobacterium tuberculosis

Tuberculosis is the leading global cause of infectious disease mortality and roughly a quarter of the world&#8217;s population is believed to be infected ...

Uso da técnica de sobreposição de Soft-agar para triagem de compostos inibidores produzida por bactérias

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