Name: use of a monocyte monolayer assay to evaluate fcγ receptor-mediated phagocytosis
Uploaded: 2017-01-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 27 s
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The authors thank the Canadian Blood Services for a Graduate Fellowship Program Award to T.N.T. This research received financial support from the Canadian Blood Services' Centre for Innovation, funded by the federal government (Health Canada) and the provincial and territorial ministries of health. The views herein do not reflect the views of the federal, provincial, or territorial governments in Canada.

Obter a aprovação para o uso de amostras humanas pela diretoria / conselho de revisão institucional de ética em pesquisa, e obter o consentimento assinado por todos os doadores humanos. O MMA também pode ser realizada utilizando PBMCs de ratinho de uma forma semelhante como o ensaio de humano, após a aprovação uso de animais ética. A MMA utiliza técnicas de cultura de tecidos de assepsia. NOTA: Veja a figura 1. NOTA: Embora nós recomendamos o uso de um gabinete de isolamento biológico nível 2 durante o ensaio para manter uma técnica asséptica, como o método é apenas um &quot;curto prazo&quot; método de cultura, não há tempo realmente o suficiente para que as bactérias contaminam o ensaio. Portanto, se um armário biocontenção nível 2 não existe, em vez de apenas comprar um para este ensaio, o ensaio pode ser efectuado fora de um armário de isolamento biológico, num banco aberto. O uso de uma incubadora a 37 ° C com 5% de CO 2, no entanto, não é uma opção e deve ser utilizado paraos melhores resultados. 1. Sangue Periférico isolamento de células mononucleares <ol><li> Uma amostra de sangue total humano de um dador saudável ou de um paciente através de venipunctura usando VACUTAINERS contendo ácido-citrato-dextrose (ACD) anticoagulante (tubos amarelo-top). NOTA: O sangue total podem ser armazenados em ACD à temperatura ambiente (18-22 ° C) durante até 36 h antes de prosseguir para o próximo passo 11. Normalmente, 1-2 10 mL tubos vacutainer de sangue total são suficientes para o ensaio. </li><li> Dilui-se todo o sangue 1: 1 v / v em meio completo de RPMI morno (meio RPMI-1640 suplementado com 10% de soro fetal de bovino, HEPES 20 mM, e 0,01 mg / ml de gentamicina). </li><li> Isolar células mononucleares do sangue periférico (PBMC) a partir do sangue total diluído utilizando densidade de centrifugação em gradiente, como recomendado pelo fabricante (Veja Lista de Materiais). Camada de sangue diluída muito lentamente ao longo do gradiente de densidade (aquecida até à temperatura ambiente, 18-22 ° C). NOTA: Minimizar a quantidade de mixing ao interface para a separação óptima do sangue por camadas cuidadosamente a mistura do sangue de uma maneira gota a gota, ou usando uma pipeta. <ol><li> Permitir que a mistura de sangue para a camada lentamente ao longo do topo do gradiente de densidade colocando a ponta da pipeta perto do gradiente de densidade e ao permitir que a mistura de sangue a correr para o lado do tubo muito lentamente. </li><li> Dependendo da escala da experiência, a camada de 10 mL de mistura sangue em cima de 3 mL de gradiente de densidade (em um tubo de 15 ml) ou uma camada de 35 mL de mistura sangue no topo de 15 ml de gradiente de densidade (em uma de 50 mL tubo). Tipicamente, 10 ml de sangue total produz 10 milhões de PBMC, com alguma variação doador para doador. NOTA: É muito importante que não há mistura da mistura com o sangue por gradiente de densidade. A mistura de sangue deve camada sobre o gradiente de densidade e subir lentamente até que todo o sangue está no topo do gradiente de densidade. </li><li> Centrifugar a mistura em camadas a 700 g durante 30 min, sem freios. o centrmistura ifuged deve separar em 5 camadas (de cima para baixo): plasma, creme leucocitário (contendo PBMC), material de gradiente de densidade, granulócitos, e hemácias. </li><li> Remover e descartar a maior parte do plasma e recuperar o conteúdo cuidadosamente buffy coat (PBMC) para um novo tubo de 15 ml, utilizando uma pipeta de Pasteur e uma bomba de sucção. NOTA: A remoção da camada buffy coat é efectivamente feito através da aplicação de sucção na pipeta de Pasteur durante a execução de um movimento circular em torno do exterior da camada, com a ponta da pipeta contra o tubo. </li></ol></li><li> Lavam-se as PBMCs isoladas três vezes em solução salina tamponada a pH 7,3 com fosfato (PBS) por centrifugação a 350 xg durante 10 min (com freios completas) entre lavagens. Reconstituir o sedimento de PBMC em meio RPMI completo. Dependendo do tamanho do grânulo, 3-7 mL de meio é suficiente. </li><li> Contar o PBMC usando azul de tripano e um hemocitómetro. Contam apenas as células que não estão manchados pelo azul de tripano. Reconstitute as PBMC a 1.750.000 células / ml em meio RPMI completo. </li><li> Semente 400 ul (700000 células) em cada poço de uma corrediça 8 câmaras. Incubar a lâmina em uma temperatura de 37 ° C, totalmente humidificado incubador de cultura de tecido (suplementado com 5% de CO 2) durante 1 h para permitir que os monócitos / macrófagos a aderir. </li></ol> 2. Pré-tratamento da aderidos monócitos NOTA: Este passo só é necessário se à procura de formas de inibir ou aumentar a fagocitose. <ol><li> Pré-tratamento com monócitos aderidos qualquer droga (s) ou composto (s) de interesse. Reconstituir o fármaco (s) ou outro material de teste para a concentração desejada com meio RPMI completo. NOTA: Por exemplo, 200 ug / mL de IVIG é normalmente usado para produzir uma inibição de 95-100% de fagocitose quando utilizando monócitos humanos. </li><li> Aspirar e desprezar o sobrenadante contendo as células não aderentes a partir da corrediça de 8 câmaras após a incubação de 1 h (a seguir ao passo 1.6). Substitua-o por 400uL de uma droga ou outro tipo de tratamento e incubar durante 1 h a 37 ° C. <ol><li> Quando aspiração e substituindo soluções no slide 8-câmara, certifique-se de controlar o fluxo dos fluidos de modo que as células fracamente aderentes não decolar. Além disso, trabalhar com apenas 2-3 poços vazios de cada vez e evitar a secagem dos poços. NOTA: Tipicamente, cada tratamento é realizado em triplicado técnicas. </li></ol></li></ol> 3. Opsonização de R 2 R 2 Glóbulos vermelhos NOTA: O R 2 R 2 utilizadas aqui são obtidas a partir da Colecção Blood Center (Canadian Blood Services), mas que também estão comercialmente disponíveis. Opsonizado R 2 R 2 GVs são utilizados como um controlo positivo para a fagocitose mediada por FcyR. Naïve R 2 R 2 deve ser armazenado em solução de Alsever (para prolongar a vida de prateleira) a 4 ° C durante até 1 mês. A solução da Alsever é feito em casa e composta por 0,8% W / v de citrato de trissódio (di-hidratado), 1,9% w / v de dextrose, 0,42% w / v de cloreto de sódio, e 0,05% w / v de ácido cítrico (mono-hidrato). Se R 2 R 2 células não estão disponíveis, outras células Rh-fenotipados, tais como R 1 R 2, R 1 R 1, R 1 R, ou R2 R, pode ser utilizado. <ol><li> Lavar R2 R2 (CDE / CDE), células vermelhas do sangue em PBS um total de três vezes utilizando centrifugação a 350 xg durante 5 min cada. NOTA: A quantidade de glóbulos vermelhos necessários depende do tamanho experimental e pode ser re-calculado. Sempre lavar uma quantidade em excesso de glóbulos vermelhos, uma vez que os glóbulos vermelhos são perdidas durante cada lavagem devido à lise ou durante a remoção do sobrenadante. Por exemplo, numa experiência com 5 tratamentos e 2 os controlos, todos realizados em triplicado técnicos, há um total de 21 poços. 21 poços com 400 ul / cavidade de 1,25% indica que RBC mistura 105 ul de pré-embaladas, opsonizado RBC são necessários. 200 uL de RBC deve ser inicialmente lavado e 150 &amp; #181; L deve ser opsonizados para assegurar que existe uma quantidade adequada de glóbulos vermelhos para o passo de fagocitose. </li><li> Opsonizar o lavado R 2 R 2 pelete com 1: 1 de anticorpos v / v de anti-D policlonais a partir de soro humano e incubar durante 1 h a 37 ° C, com agitação intermitente. NOTA: Se os anticorpos anti-D policlonais não estão disponíveis, é possível a utilização de anticorpos monoclonais anti-D, os quais estão comercialmente disponíveis, ou anti-D, que é normalmente utilizado para Rh profilaxia imunitária, que pode ser obtido a partir de bancos de sangue ou transfusão Serviços. testes de otimização deve ser realizada no início, durante a configuração do ensaio, e sempre que mudar um monte de anticorpos policlonais titulados-un ou a mudança para um anticorpo monoclonal. Este é o de identificar a melhor concentração ou o volume de anti-D necessário para um teste de antiglobulina (IAT) resultado de entre 3+ e 4+ e um resultado de fagocitose entre 70-90 GVs fagocitados por 100 monócitos contados. </li><li> Lava-se a opsonizard R 2 um total de três vezes em PBS utilizando centrifugação a 350 xg durante 5 min cada R 2. NOTA: opsonização bem sucedida de R 2 R 2 pode ser confirmada através da realização de uma IAT indirecta. Resumidamente, anticorpos policlonais anti-humanos secundários são adicionados para se ligar anticorpos opsonizantes primários em superfícies de RBC, e o sinal amplificado pode ser observada sob a forma de hemaglutinação. Um protocolo fabricante detalhada pode ser encontrada no arquivo de materiais suplementares. </li><li> Reconstituir o lavado R 2 R 2 pelete a 1,25% v / v, utilizando meio RPMI completo. NOTA: O excesso de R opsonizado 2 R 2 podem ser armazenados em solução de Alsever a 4 ° C durante até uma semana. </li></ol> 4. A fagocitose mediada pelo receptor Fc <ol><li> Aspirar o sobrenadante do meio de droga ou a partir do slide 8-câmara e adicionar 400 uL de a 1,25% v / v de R 2 R 2 mistura. Incubar a 37 ° C durante 2 h. </li><li> à réer 2 h de incubação, remove as câmaras que utilizam adaptadores do fabricante. Dab o excesso de R 2 R 2 sobre uma toalha de papel. Certifique-se de que o slide não seque. </li><li> Encher um copo de 100 mL com PBS. Submerge e lavar a lâmina lentamente movendo a lâmina e para trás (cerca de 30-40 pancadas) para remover a maioria do fagocitados-un R 2 R 2. </li><li> Remova a lâmina do PBS. Dab o excesso de PBS utilizando uma toalha de papel ou tecido e deixe secar o slide. </li><li> Fixar a lâmina seca ao ar em 100% de metanol durante 45 s. Em seguida, deixe secar a lâmina fixa. NOTA: As lâminas podem ser corrigidos usando um outro método que é mais compatível para a coloração jusante, como a mancha Grünwald-Giemsa 21 ou a mancha Wright-Giemsa 22. </li><li> Monte a lâmina utilizando um in-house-made de montagem ELVANOL médio (ou outro meio de montagem disponível no mercado) e adicionar lamelas. NOTA: Elvanol meio de montagem é composto por 15% w / v poresina de álcool lyvinyl e 30% v / v de glicerina em PBS. A mistura é aquecida até que toda a resina tenha dissolvido e a glicerina é misturado de forma homogénea. Isto pode ser substituído por outro meio de montagem disponível comercialmente. </li><li> Permitir ao monte a secar durante a noite antes da quantificação. </li></ol> 5. A quantificação da fagocitose <ol><li> Usando um microscópio de contraste de fase e uma lente de objectiva de 40x, quantificar manualmente a quantidade de eventos fagocíticas contando pelo menos 200 monócitos e o número de fagocitados R 2 R 2 dentro desses monócitos. Possui um contador em cada mão para quantificar simultaneamente o número de monócitos e o número de fagocitados R 2 R 2. </li><li> Obter o índice fagocítica média dividindo-se o número de fagocitados R 2 R 2 pelo número de monócitos e multiplicando por 100. expressar os dados como a média (média) de índice fagocítica ± o erro padrão da média (SEM). </li&gt; </ol>

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The authors have nothing to disclose.

O MMA é uma técnica trabalhosa que requer experiência tanto em cultura de tecidos e microscopia. Há vários passos críticos para garantir o sucesso: 1) geração da monocamada de monócitos; 2) opsonização dos glóbulos vermelhos, e 3) quantificação manual. A monocamada de monócitos não adere muito fortemente ao slide câmara, de modo que o pH fisiológico deve ser mantida durante todo o ensaio de 11 e um número adequado de PBMC deve ser semeadas. pipetagem vigorosa, a qual poderia perturbar as células aderidas, devem ser evitados. Uma abordagem é sempre remover e adicionar soluções a partir do mesmo canto da câmara, e para assegurar que o movimento é lento e constante. Do mesmo modo, durante o último passo de lavagem para remover o excesso de glóbulos vermelhos, o movimento deve ser lento e constante. Isto garante um mínimo de perturbações para a monocamada enquanto ainda remover a maioria dos GVs fagocitados-un. lavagem inadequada irá conduzir a uma elevada interferência de fundo dos GVs contaminantes, o que torna o manual quantification difícil. Em segundo lugar, os R 2 R 2 hemácias deve ser suficientemente opsonizado para se obter um índice médio de 80-120 fagocítica para o controlo fagocitose. Esta gama fagocítica desejado estabelece um equilíbrio entre a facilidade de contagem (por exemplo, monócitos com mais de 5 fagocitados GVs são difíceis de quantificar com precisão) e manutenção de uma quantidade adequada de fagocitose para análise estatística. O grau de opsonização pode ser confirmada por um IAT, e é necessária uma leitura entre 3+ a 4+. O R 2 R 2 hemácias deve ser descartado quando não há excesso de lise durante a lavagem, em que o sobrenadante passa a vermelho escuro, ou quando ocorre uma diminuição significativa na fagocitose é observado em experiências devido ao envelhecimento das células em armazenamento. Por último, a quantificação manual usando o microscópio pode ser complicado, especialmente quando se compara contagens entre o pessoal de laboratório e entre experimentos. Ao examinar o mesmo campo em cada poço, ou simplesmente pela contagem mais células, Uma contagem mais consistente pode ser obtido. formação lado-a-lado com um técnico experiente e a utilização de um conjunto de lâminas de formação designada é recomendado. Uma grande crítica do MMA é a subjetividade da etapa de quantificação manual. No entanto, com formação adequada, a consistência pode ser obtido através de diferentes contadores. Outra limitação é a diferenças intrínsecas doador-a-doador em monócitos capacidades fagocíticas e em R 2 R níveis de expressão do antigénio de superfície 2, que é uma fonte de variação dos dados quando se lida com amostras humanas. Outras técnicas alternativas estão disponíveis para examinar a fagocitose FcyR mediada. A maioria dos kits comerciais utilizam saída fluorescente para monitorizar a fagocitose (por exemplo, biopartículas, a proteína de fluorescência sensível ao pH, ou IgG-esferas de látex marcadas fluorescentes). O uso de saída fluorescente não oferecem quantificação mais objetiva, mas também é preciso conconsiderar as disponibilidade, custo, e de formação associada com o uso de um microscópio de fluorescência ou um citómetro de fluxo, bem como a dependência que se seguiu após kits disponíveis comercialmente. Finalmente, este ensaio pode ser modificado, dependendo da questão de pesquisa. Por exemplo, no ensaio de inibição de droga de fagocitose, monócitos pode ser pré-tratado ou co-incubadas com ambos os fármacos e RBCs opsonizadas (ou seja, um ensaio de competição). A sinalização a jusante de anticorpos de diferentes subtipos, anticorpos quiméricos, ou construções recombinantes pode também ser testada. Com os recentes avanços no desenvolvimento de um sangue antígeno-nulo universal 24, o MMA poderia ser utilizada em telas iniciais desses hemácias antígeno-nulo com vários anticorpos para avaliar se há de fato uma eficácia reduzida no desencadeamento de fagocitose.

The monocyte monolayer assay (MMA) is an in vitro assay originally developed to better predict blood transfusion outcomes in patients with auto- or alloantibodies to red blood cells (RBCs)1-5. By assessing the effect of anti-RBC antibodies in mediating Fc&#947; receptor (Fc&#947;R)-mediated phagocytosis using this in vitro assay, it is possible to predict the clinical outcome in vivo. Indeed, the MMA has been used successfully to avoid immune destruction of antibody-bound RBCs, despite the transfusion of serologically incompatible blood5. The typical pre-transfusion procedure for compatibility testing, also termed crossmatching, involves serological methods that include typing the patient's blood for ABO and Rh antigens and screening for the presence of anti-RBC antibodies in the patient6. Blood matched for ABO/Rh is selected, and if antibodies are present, an attempt to identify them is made so that blood for transfusion can be further selected to avoid these antigens. An ideal crossmatch result occurs when all donor blood is serologically compatible with the patient's blood, which reduces the risk of post-transfusion hemolysis7. However, this system falls short for the small group of patients who have become alloimmunized upon repeated transfusion or pregnancy. These patients produce alloantibodies against specific RBC antigens. Some produce antibodies to antigens of very high frequency in the general population, and thus become progressively more difficult to crossmatch8,9. Adding to the complexity, not all alloantibodies are clinically significant; in other words, the binding of an alloantibody to RBCs detected by a serology test does not necessarily result in hemolysis when antigen-positive, incompatible blood is transfused. The MMA was originally developed to assess the potential clinical significance of serologically incompatible blood in a transfusion setting1-5.
Since extravascular hemolysis of antibody-bound RBCs is known to be mediated by the mononuclear phagocyte system, primary monocytes/macrophages are utilized in the development of diagnostic assays. The first assay to study the interaction of monocytes, RBCs, and antibodies was published in 1975, but the sub-optimal conditions used led only to rosette formation (the binding of RBCs to the periphery of the monocyte), and no phagocytosis was observed10. Significant modifications to the assay were made by several groups, leading to an assay for which the level of phagocytosis of alloantibody-bound RBCs could be correlated to the clinical outcome of hemolysis1-5. Recently, the optimal storage conditions of clinical samples and further optimization of assay conditions were examined to enhance the utility of a clinical MMA crossmatch using autologous patient samples11.
Three other diagnostic techniques have been employed in addition to the MMA in predicting transfusion outcomes: the 51Cr release test, the rosette test, and the chemiluminescence test (CLT). In the 51Cr release test, the patient is injected with 51Cr-labeled donor RBCs, and the half-life of the labeled RBCs is monitored and is predictive of post-transfusion survival or clearance12,13. As this method uses radioactive materials, it is rarely performed anymore. The rosette test involves mixing and incubating monocytes with RBCs and quantifying the level of rosette formation (with no phagocytosis)14. The clinical significance of antibodies in vivo involves active phagocytosis by macrophages found in the spleen and/or the liver; thus, this method does not provide a relevant readout of phagocytosis. The CLT uses luminol to monitor the oxidative burst during monocyte phagocytosis of RBC, since luminol fluoresces blue when oxidized in the phagosome15. This method is good, but contamination by neutrophils can confound the readout. Parallel comparisons have been made to evaluate the sensitivity, practicality, and reproducibility of the four available methods, and both the CLT and MMA were ranked superior16. However, the CLT has been mainly utilized in assessing hemolytic disease of the fetus and newborn (HDFN), and the assay's optimal pH of 8.0 might compromise the level of phagocytosis11.
In addition to its diagnostic and clinical utility, the MMA has been modified for other research purposes. Indeed, the MMA can not only serve as a functional assay to address discrepancies between serology and biology, it has also been used to retrospectively investigate the cause of hemolysis after intravenous immunoglobulin (IVIG) therapy17. It has also been used to examine the structure-function of chemical inhibitors of Fc&#947;R-mediated phagocytosis18-20 and to study the downstream signaling of Fc&#947;R-mediated phagocytosis21. In our laboratory, in addition to using a human MMA, we are developing a murine MMA using primary mouse peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and autologous RBCs. The rationale is to screen antibodies that can induce Fc&#947;R-mediated phagocytosis as an intermediate to developing an in vivo autoimmune hemolytic anemia (AIHA) mouse model (unpublished data). The various modifications focus on different aspects of the IgG antibody and Fc&#947;R interaction that induce phagocytosis.

<table><tbody><tr><td>Acid citrate dextrose (ACD) vacutainers</td><td>BD</td><td>REF364606</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Sigma</td><td>R8758</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Bioshop</td><td>HEP003.100</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Multicell&amp;nbsp;</td><td>080150</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Gibco</td><td>15710-64</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>GE</td><td>17-1440-03</td><td>https://www.gelifesciences.com/</td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>8-chamber slides</td><td>Lab-Tek-ll</td><td>154534</td><td></td></tr><tr><td>R&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;R&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; (cDE/cDE) red blood cells</td><td>Canadian Blood Services</td><td></td><td>Commercially available (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt;, http://www.bio-rad.com/en-ca/product/reagent-red-blood-cells)</td></tr><tr><td>Polyclonal anti-D from human serum</td><td>Gamma Biologics</td><td>DIN 02247724</td><td>Can be substituted with commercially available monoclonal anti-D or with Rh immune globulin</td></tr><tr><td>100% methanol</td><td>Caledon</td><td>6700-1-42</td><td></td></tr><tr><td>Polyvinyl alcohol resin</td><td>Sigma</td><td>P8136</td><td>Can be substituted with commercially available mount</td></tr><tr><td>UltraPure glycerine</td><td>Invitrogen</td><td>15514-011</td><td></td></tr><tr><td>Cover slips</td><td>VWR</td><td>48366 067</td><td></td></tr><tr><td>Novaclone anti-IgG</td><td>Immucorgamma</td><td>5461023</td><td>Optional for IAT (http://www.fda.gov/downloads/biologicsbloodvaccines/.../ucm081743.pdf)</td></tr></tbody></table>

use of a monocyte monolayer assay to evaluate fc&#947; receptor-mediated phagocytosis

Although originally developed for predicting transfusion outcomes of serologically incompatible blood, the monocyte monolayer assay (MMA) is a highly versatile in vitro assay that can be modified to examine different aspects of antibody and Fc&#947; receptor (Fc&#947;R)-mediated phagocytosis in both research and clinical settings. The assay utilizes adherent monocytes from peripheral blood mononuclear cells isolated from mammalian whole blood. MMA has been described for use in both human and murine investigations. These monocytes express Fc&#947;Rs (e.g., Fc&#947;RI, Fc&#947;RIIA, Fc&#947;RIIB, and Fc&#947;RIIIA) that are involved in immune responses. The MMA exploits the mechanism of Fc&#947;R-mediated interactions, phagocytosis in particular, where antibody-sensitized red blood cells (RBCs) adhere to and/or activate Fc&#947;Rs and are subsequently phagocytosed by the monocytes. In vivo, primarily tissue macrophages found in the spleen and liver carry out Fc&#947;R-mediated phagocytosis of antibody-opsonized RBCs, causing extravascular hemolysis. By evaluating the level of phagocytosis using the MMA, different aspects of the in vivo Fc&#947;R-mediated process can be investigated. Some applications of the MMA include predicting the clinical relevance of allo- or autoantibodies in a transfusion setting, assessing candidate drugs that promote or inhibit phagocytosis, and combining the assay with fluorescent microscopy or traditional Western immunoblotting to investigate the downstream signaling effects of Fc&#947;R-engaging drugs or antibodies. Some limitations include the laboriousness of this technique, which takes a full day from start to finish, and the requirement of research ethics approval in order to work with mammalian blood. However, with diligence and adequate training, the MMA results can be obtained within a 24-h turnover time.

Seguindo os passos cruciais na Figura 1 e o procedimento acima descrito, o MMA pode ser realizada de forma reprodutível. IVIG foi usado como um exemplo para a inibição da fagocitose na Figura 2. IVIG é conhecido por se ligar e bloquear os receptores Fc, inibindo, assim, o resultado a jusante de fagocitose. Por titulação da quantidade de IVIG utilizado, uma inibição dependente da dose é observada, em que as concentrações acima de 200 ng / mL resultou em perto de 100% de inibição e as concentrações inferiores a 0,5 ug / ml não inibiu a todos (Figura 2A). Quando os índices fagocíticas são transformadas e normalizada para o controlo positivo R 2 R 2 como 0% de inibição, uma curva de inibição, com uma IC50 de 3 ng / mL pode ser determinada (Figura 2B). Além de realizar o ensaio de forma consistente, quantificação do ensaio, por vezes, pode ser difícil. A Figura 3 é um conjunto de imagens de microscopia de contraste de fase de vários diapositivos de MMA. Com microscopia experiência, pode-se distinguir um monócitos a partir de um contaminante de RBC (Figura 3D), ou de um vacúolo de um RBC fagocitado (Figura 3B). Conjuntos densos de células e / ou detritos deve ser evitada durante a quantificação (Figuras 3E e F). Além disso, deve-se evitar o excesso de opsonizantes o R 2 R 2 RBC, o que levaria a fagocitose aumentada que superlota o interior de monócitos e interfere com a quantificação exacta (Figura 3C). <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/55039/55039fig1.jpg" /> Figura 1. Diagrama esquemático do MMA. Uma descrição passo a passo dos passos cruciais no MMA: isolamento de PBMC a partir de sangue total, que alimenta o monocyt aderidaES opsonizado com R 2 R 2, e lavagem das lâminas de câmara. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55039/55039fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55039/55039fig2.jpg" /> Figura 2. IgG intravenosa (IVIG) inibe a fagocitose in vitro, utilizando o MMA. IVIG é que inibem a fagocitose e é usado como um controlo de inibição no MMA humano. (A) A titulação de IVIG resultou numa inibição dependente da dose da fagocitose quando em comparação com o não tratado R 2 R 2 controle. Os resultados mostram a média ± o erro padrão da média (SEM) de n = 3 experiências. A análise estatística foi realizada utilizando Student t -test: ** p≤0.01 e *** p≤0.001. (B) curva de inibição de IVIG com uma IC 50 OF 3? g / mL (linha pontilhada). Os resultados mostram dados normalizados para não tratado R 2 R 2 (0% de inibição); média ± SEM de n = 3 experiências. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55039/55039fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/55039/55039fig3.jpg" /> Figura 3. As imagens de microscopia de contraste de fase de lâminas de amostra em 40X. (A) O slide perfeito em que os monócitos fagocitado 1-2 R 2 R 2, em média (setas pretas com um brilho de halo distintivo), com muito poucos contaminantes, un-fagocitado R 2 R 2 no fundo (setas brancas). Vacúolos (B) Como mostrado neste slide, monócitos, por vezes, têm aumentado (setas brancas), que podem ser confundidos com fagocitado R 2 R 2. (C &lt;/ forte&gt;) Quando R 2 R 2 foram sobre-opsonizado, mais do que 4-5 fagocitados R 2 R 2 por monócitos (setas pretas) rende exacta contando difícil, uma vez que a R 2 R 2 são aglomeradas no monócitos e células distintas limites não podem ser distinguidos. (D) lavagem inadequada do slide leva a abundante R2 R2 contaminação (setas brancas), que poderia ser confundido com hemácias aderiram. (E) Às vezes, monócitos e glóbulos vermelhos contaminantes podem formar clusters. Clusters também indicar a contaminação bacteriana, o que deve ser evitado. (F) Os monócitos podem formar agregados maiores, que devem ser evitados durante a quantificação. Usando seleção aleatória dos campos para ver, painel A é o que é geralmente observado se o MMA tem sido realizada corretamente. barra de escala é de 20 mm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55039/55039fig3large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui</a>para ver uma versão maior desta figura.

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Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate Fc&#947; Receptor-mediated Phagocytosis

The monocyte monolayer assay (MMA) is an in vitro assay that utilizes isolated primary monocytes obtained from mammalian peripheral whole blood to evaluate Fc&#947; receptor (Fc&#947;R)-mediated phagocytosis.

Uso de um monócito monocamada Ensaio para Avaliar a fagocitose mediada pelo receptor Fcy

Although originally developed for predicting transfusion outcomes of serologically incompatible blood, the monocyte monolayer assay (MMA) is a highly ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

17.9K visualizações.  University of Toronto. The monocyte monolayer assay (MMA) is an in vitro assay that utilizes isolated primary monocytes obtained from mammalian peripheral whole blood to evaluate Fcγ receptor (FcγR)-mediated phagocytosis.

Vídeo: Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate Fcγ Receptor-mediated Phagocytosis

Determining the Phagocytic Activity of Clinical Antibody Samples

Antibody-driven phagocytosis is induced via the engagement of Fc receptors on professional phagocytes, and can contribute to both clearance as well as pathology of disease. While the properties of the variable domains of antibodies have long been considered critical to in vivo function, the ability of antibodies to recruit innate immune cells via their Fc domains has become increasingly appreciated as a major factor in their efficacy, both in the setting of recombinant monoclonal antibody therapy, as well as in the course of natural infection or vaccination1-3.
Importantly, despite its nomenclature as a constant domain, the antibody Fc domain does not have constant function, and is strongly modulated by IgG subclass (IgG1-4) and glycosylation at Asparagine 2974-6. Thus, this method to study functional differences of antigen-specific antibodies in clinical samples will facilitate correlation of the phagocytic potential of antibodies to disease state, susceptibility to infection, progression, or clinical outcome.
Furthermore, this effector function is particularly important in light of the documented ability of antibodies to enhance infection by providing pathogens access into host cells via Fc receptor-driven phagocytosis7. Additionally, there is some evidence that phagocytic uptake of immune complexes can impact the Th1/Th2 polarization of the immune response8.
Here, we describe an assay designed to detect differences in antibody-induced phagocytosis, which may be caused by differential IgG subclass, glycan structure at Asn297, as well as the ability to form immune complexes of antigen-specific antibodies in a high-throughput fashion. To this end, 1 &mu;m fluorescent beads are coated with antigen, then incubated with clinical antibody samples, generating fluorescent antigen specific immune complexes. These antibody-opsonized beads are then incubated with a monocytic cell line expressing multiple Fc&gamma;Rs, including both inhibitory and activating. Assay output can include phagocytic activity, cytokine secretion, and patterns of Fc&gamma;Rs usage, and are determined in a standardized manner, making this a highly useful system for parsing differences in this antibody-dependent effector function in both infection and vaccine-mediated protection9.

We present a high-throughput flow cytometric assay to determine the phagocytic activity of antigen-specific antibodies from clinical samples, utilizing fluorescent antigen-coated beads and a monocytic cell line expressing multiple Fc receptors&#x2014;providing receptor usage and phagocytic activity determinations in a standardized and reproducible fashion for any antigen of interest.

Determinação da atividade fagocítica de amostras de anticorpos Clínica

Antibody-driven phagocytosis is induced via the engagement of Fc receptors on professional phagocytes, and can contribute to both clearance as well as ...

Imunologia e Infecção

High Throughput Fluorometric Technique for Assessment of Macrophage Phagocytosis and Actin Polymerization

The goal of fluorometric analysis is to serve as an efficient, cost effective, high throughput method of analyzing phagocytosis and other cellular processes. This technique can be used on a variety of cell types, both adherent and non-adherent, to examine a variety of cellular properties. When studying phagocytosis, fluorometric technique utilizes phagocytic cell types such as macrophages, and fluorescently labeled opsonized particles whose fluorescence can be extinguished in the presence of trypan blue. Following plating of adherent macrophages in 96-well plates, fluorescent particles (green or red) are administered and cells are allowed to phagocytose for varied amounts of time. Following internalization of fluorescent particles, cells are washed with trypan blue, which facilitates extinction of fluorescent signal from bacteria which are not internalized, or are merely adhering to the cell surface. Following the trypan wash, cells are washed with PBS, fixed, and stained with DAPI (nuclear blue fluorescent label), which serves to label nuclei of cells. By a simple fluorometric quantification through plate reading of nuclear (blue) or particle (red/green) fluorescence we can examine the ratio of relative fluorescence units of green:blue and determine a phagocytic index indicative of amount of fluorescent bacteria internalized per cell. The duration of assay using a 96-well method and multichannel pipettes for washing, from end of phagocytosis to end of data acquisition, is less than 45 min. Flow cytometry could be used in a similar manner but the advantage of fluorometry is its high throughput, rapid method of assessment with minimal manipulation of samples and quick quantification of fluorescent intensity per cell. Similar strategies can be applied to non adherent cells, live labeled bacteria, actin polymerization, and essentially any process utilizing fluorescence. Therefore, fluorometry is a promising method for its low cost, high throughput capabilities in the study of cellular processes.

Here we present a protocol to quantify phagocytosis of fluorescent particles by adherent macrophage cell line using a fluorometric method. This method facilitates a high throughput quantification of particle internalization as well as the resulting actin polymerization.

Técnica High Throughput Fluorometric de Avaliação da macrófago fagocitose e actina Polimerização

The goal of fluorometric analysis is to serve as an efficient, cost effective, high throughput method of analyzing phagocytosis and other cellular ...

Measuring Granulocyte and Monocyte Phagocytosis and Oxidative Burst Activity in Human Blood

The granulocyte and monocyte phagocytosis and oxidative burst (OB) activity assay can be used to study the innate immune system. This manuscript provides the necessary methodology to add this assay to an exercise immunology arsenal. The first step in this assay is to prepare two aliquots ("H" and "F") of whole blood (heparin). Then, dihydroethidium is added to the H aliquot, and both aliquots are incubated in a warm water bath followed by a cold water bath. Next, Staphylococcus aureus (S. aureus) is added to the H aliquot and fluorescein isothiocyanate-labeled S. aureus is added to the F aliquot (bacteria:phagocyte = 8:1), and both aliquots are incubated in a warm water bath followed by a cold water bath. Then, trypan blue is added to each aliquot to quench extracellular fluorescence, and the cells are washed with phosphate-buffered saline. Next, the red blood cells are lysed, and the white blood cells are fixed. Finally, a flow cytometer and appropriate analysis software are used to measure granulocyte and monocyte phagocytosis and OB activity. This assay has been used for over 20 years. After heavy and prolonged exertion, athletes experience a significant but transient increase in phagocytosis and an extended decrease in OB activity. The post-exercise increase in phagocytosis is correlated with inflammation. In contrast to normal weight individuals, granulocyte and monocyte phagocytosis is chronically elevated in overweight and obese participants, and is modestly correlated with C-reactive protein. In summary, this flow cytometry-based assay measures the phagocytosis and OB activity of phagocytes and can be used as an additional measure of exercise- and obesity-induced inflammation.

The purpose of this manuscript is to present a method for measuring monocyte and granulocyte phagocytosis and oxidative burst activity in human blood samples.

Medição de granulócitos e monócitos fagocitose e oxidativo Atividade Burst no Sangue

The granulocyte and monocyte phagocytosis and oxidative burst (OB) activity assay can be used to study the innate immune system. This manuscript provides ...

Time-lapse 3D Imaging of Phagocytosis by Mouse Macrophages

Phagocytosis plays a key role in host defense, as well as in tissue development and maintenance, and involves rapid, receptor-mediated rearrangements of the actin cytoskeleton to capture, envelop and engulf large particles. Although phagocytic receptors, downstream signaling pathways, and effectors, such as Rho GTPases, have been identified, the dynamic cytoskeletal remodeling of specific receptor-mediated phagocytic events remain unclear. Four decades ago, two distinct mechanisms of phagocytosis, exemplified by Fc&#947; receptor (Fc&#947;R)- and complement receptor (CR)-mediated phagocytosis, were identified using scanning electron microscopy. Binding of immunoglobulin G (IgG)-opsonized particles to Fc&#947;Rs triggers the protrusion of thin membrane extensions, which initially form a so-called phagocytic cup around the particle before it becomes completely enclosed and retracted into the cell. In contrast, complement opsonized particles appear to sink into the phagocyte following binding to complement receptors. These two modes of phagocytosis, phagocytic cup formation and sinking in, have become well established in the literature. However, the distinctions between the two modes have become blurred by reports that complement receptor-mediated phagocytosis may induce various membrane protrusions. With the availability of high resolution imaging techniques, phagocytosis assays are required that allow real-time 3D (three dimensional) visualization of how specific phagocytic receptors mediate the uptake of individual particles. More commonly used approaches for the study of phagocytosis, such as end-point assays, miss the opportunity to understand what is happening at the interface of particles and phagocytes. Here we describe phagocytic assays, using time-lapse spinning disk confocal microscopy, that allow 3D imaging of single phagocytic events. In addition, we describe assays to unambiguously image Fc&#947; receptor- or complement receptor-mediated phagocytosis.

Here we describe methods using spinning disk confocal microscopy to image single phagocytic events by mouse resident peritoneal macrophages. The protocols can be extended to other phagocytic cells.

Time-Lapse imagem em 3D da fagocitose por macrófagos de rato

Phagocytosis plays a key role in host defense, as well as in tissue development and maintenance, and involves rapid, receptor-mediated rearrangements of ...

Prediction of Red Blood Cell Antibody Significance Using the Monocyte-Macrophage Assay

Derived from monocytes in the bone marrow, macrophages are large, innate immune cells that play a major role in clearing dead cells, debris, tumor cells, and foreign pathogens. The phagocytic capacity of monocytes versus macrophages is a concept that is not well understood. Here, we aim to examine a difference in the phagocytosis of monocytes versus macrophages, specifically M1/M2 macrophages, against various opsonized red cells using a modified and updated version of the established monocyte monolayer assay (MMA). Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were isolated from donor buffy coats. Using purified monocytes, inflammatory M1 and anti-inflammatory M2 macrophages were produced by in vitro culture and polarization. M1/M2 cells were harvested and used in an MMA-like assay, which we refer to as the M-MA, to decipher clinically significant phagocytosis of various red cell antibodies. A phagocytic index (PI) &#62; 5 was deemed clinically significant phagocytosis with the use of monocytes. A phagocytic index (PI) &#62; 12 was deemed clinically significant phagocytosis with the use of M1/M2 macrophages. M2 macrophages demonstrate an increased ability to phagocytose opsonized RBCs compared to monocytes and M1s. The same weak antibody (anti-S) yields significant phagocytosis with only M2 macrophages (PI=43) but not M1s (PI=2) or monocytes (PI=0), and this was demonstrated repeatedly using various antibodies. The use of M2 macrophages instead of monocytes may allow for more accurate results as these cells are more phagocytic, offering further clinical relevance to the assay. Further studies with different antibodies to red blood cells, including validation of the monocyte-macrophage assay (M-MA) with antibodies having known clinical significance, may show the M-MA&#160;more useful to help predict clinically significant red cell alloantibodies and transfusion reactions. This method will advance the field of transfusion medicine and immunology.

We have developed enhancements and updated methods for the existing monocyte-monolayer assay (MMA), in which macrophages are used to help better predict the clinical relevance of red cell alloantibodies in transfusion medicine and immunology. This assay is named the monocyte-macrophage assay (M-MA).

Previsão da significância do anticorpo eritrocitário usando o ensaio de monócitos-macrófagos

Derived from monocytes in the bone marrow, macrophages are large, innate immune cells that play a major role in clearing dead cells, debris, tumor cells, ...

Real-Time Imaging of Macrophage Phagocytosis of IgG-Opsonized Red Blood Cells

Source: Horsthemke, M., et al. <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/57566">Time-lapse 3D Imaging of Phagocytosis by Mouse Macrophages.</a> J. Vis. Exp. (2018)
This video demonstrates an assay to monitor independent macrophage-mediated red blood cell (RBC) phagocytosis events. Mouse immunoglobulin G (IgG)-opsonized human RBCs are incubated with mouse macrophages and observed under a confocal microscope. The RBCs are engulfed by macrophages via a phagocytic cup formation and targeted for lysosomal degradation.

Imagem em tempo real da fagocitose de macrófagos de glóbulos vermelhos opsonizados por IgG

Source: Horsthemke, M., et al. Time-lapse 3D Imaging of Phagocytosis by Mouse Macrophages. J. Vis. Exp. (2018)
This video demonstrates an assay to monitor ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Imunologia

Imunodiagnóstico

Specialized Assays

An In Vitro Assay for Evaluating the Immunomodulatory Impact of Monocytes on Leukocyte Proliferation

Source: Hsu, P., et al. <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/53265">Assessment of the Immunomodulatory Properties of Human Mesenchymal Stem Cells (MSCs).</a> J. Vis. Exp. (2015)
This video demonstrates an in vitro assay to explore the immunomodulatory influence of mesenchymal stem cells (MSCs) on effector T cell proliferation. The assay includes co-culturing MSCs with PBMCs to induce the monocyte population to acquire an immunomodulatory phenotype, leading to the secretion of interleukin-10 (IL-10). Following incubation with activated CD4+ T cells, the induced monocytes effectively suppress T cell proliferation.

Um ensaio in vitro para avaliar o impacto imunomodulador dos monócitos na proliferação de leucócitos

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Density Gradient Isolation of ...

In Vitro and In Vivo Models

An Assay to Assess Phagocytosis and Oxidative Burst Activity In Granulocytes and Monocytes

Source: Meaney, M. P. et al., <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/54264">Measuring Granulocyte and Monocyte Phagocytosis and Oxidative Burst Activity in Human Blood.</a> J. Vis. Exp. (2016)
This video demonstrates the assay to confirm phagocytic activity by cells in human blood via flow cytometry. The granulocytes and monocytes confirm their phagocytic activity by showing green and red fluorescence confirming the presence of engulfed bacteria and oxidative burst activity respectively.

Um ensaio para avaliar a fagocitose e a atividade de explosão oxidativa em granulócitos e monócitos

All procedures involving human participants have been performed in compliance with the institutional, national, and international guidelines for human ...

An Assay for Quantifying Antibody-Mediated Phagocytosis of Parasite-Infected Erythrocytes

Source: Quintana, M. d. P. et al., <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/61538">Measuring Naturally Acquired Phagocytosis-Inducing Antibodies to Plasmodium falciparum Parasites by a Flow Cytometry-Based Assay.</a>&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2020)
This video demonstrates a flow cytometry-based phagocytosis assay involving labeled and opsonized Plasmodium falciparum-infected erythrocytes by monocytes. Flow cytometry identifies fluorescence in monocytes, confirming the successful identification of opsonized erythrocytes through phagocytosis.

Um ensaio para quantificar a fagocitose mediada por anticorpos de eritrócitos infectados por parasitas

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Parasite culture
NOTE: Follow the ...

An In Vitro Assay to Measure Antibody-Dependent Cellular Phagocytosis by Phagocytes

Source: Powell, R. L., et al. <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/60149">Isolation of Leukocytes from Human Breast Milk for Use in an Antibody-dependent Cellular Phagocytosis Assay of HIV Targets.</a> J. Vis. Exp. (2019).
This video demonstrates an assay to measure the antibody-dependent cellular phagocytosis (ADCP) by breast milk phagocytes. Fluorescently labeled microspheres conjugated to an antigen-antibody complex, are combined with a cell suspension isolated from breast milk to induce antibody-dependent cellular phagocytosis by the phagocytic leukocytes. Upon labeling the cells with antibodies against common leukocyte antigen (CD45), flow cytometry is used to measure the fluorescence intensity of microsphere-positive viable phagocytic leukocytes, indicating the level of ADCP activity.

Um ensaio in vitro para medir a fagocitose celular dependente de anticorpos por fagócitos

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Target Microsphere preparation

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