This work was supported by NIH grants R21 HD068949-01 and RO1 GM065303.

Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com a University of Wisconsin - Madison e Animal Care Institucional e diretrizes Use Committee (IACUC) (University of Wisconsin - Madison Assurance número A3368-01). 1. Seleção de fêmeas para coleta de ovos via acasalamento Interrompida NOTA: protocolos baseados em FIV contar com a extrusão dos óvulos maduros de fêmeas através de pressão manual 9. protocolos anteriores usaram fêmeas diretamente de tanques ou em acasalamentos de pares sem as fêmeas submetidas comportamento libertação do óvulo, mas apenas uma pequena fração dessas mulheres (cerca de 20% ou menos, dependendo da linha de peixe-zebra) produzem ovos extrudados e competentes sob pressão manual. Em um procedimento melhorado, as fêmeas são pré-classificadas para a postura de ovos por observação visual direta, seguido pela interrupção imediata de acasalamento. Este procedimento é muito eficaz, como quase todas as mulheres pré-selecionados através deste rendimento etapa de acasalamento interrompido ovos extrudados e competentesmediante pressão manual. <ol><li> A tarde antes do experimento, criar pares de acasalamento da estirpe de peixe-zebra desejado em caixas de acasalamento de peixe-zebra padrão. Mantenha homens na mesma câmara como fêmeas ainda fisicamente separadas a partir deles, seja por meio de uma divisão caixa de acasalamento ou colocando o homem sob uma inserção de postura ea fêmea dentro da inserção. </li><li> Na manhã do experimento, remover a partição física, colocando ambos os sexos masculino e feminino na mesma pastilha de postura, de modo que o acasalamento começa. </li><li> Inspecione visualmente os tanques que contêm pares de acasalamento para detectar extrusão de ovos durante o acasalamento natural. Aos primeiros sinais de extrusões de ovo, separado masculina e feminina para interromper a reprodução. Após a separação a partir de machos, fêmeas manter os pré-seleccionado, quer separadamente ou misturadas no mesmo tanque. Use várias fêmeas, dependendo do número de embriões desejados (tipicamente 50-150 ovos / fêmea). </li></ol> 2. Preparar uma solução de esperma NOTA: a fertilização in vitro relies na exposição dos ovos maduros a uma solução de esperma. Esta solução pode ser não tratada, para gerar zigotos diplóides (o qual após tratamento HS2 tornaram embriões tetraplóides) ou UV-tratado, para gerar zigotos haplóides (o qual após tratamento HS2 tornaram embriões diplóides homozigóticos). Esperma protocolos de preparação anteriores sugeriu a utilização de tubos capilares para recolha de sémen a região anal do sexo masculino vivos, mas foi um processo ineficaz uma vez que apenas uma pequena fracção de esperma produziu machos 9. O protocolo apresentado a seguir baseia-se em vez sobre a preparação esperma de testículos dissecados cortadas, que produz resultados mais confiáveis. <ol><li> Preparar a solução de Hank antes do tempo como solução de pré-mistura de um Hank, composto de todos os componentes (Soluções 1, 2, 4 e 5), exceto a solução de bicarbonato de sódio (solução 6). Preparar a solução de 6 fresco e adicionar à pré-mistura da manhã da experiência (Tabela 1). Para fazer a solução de Hanks (solução final, a preparação da manhãprocedimento de fertilização in vitro), misture 990 ul de Premix de Hank e 10 ul da recém-feitos Solução 6. </li><li> Eutanásia machos pela exposição excessiva ao tricaina como uma solução de 0,016% em água condicionado. <ol><li> Prepare tricaina como uma solução de estoque de 0,2% em água (tampão a pH 7,0 com Tris 1M pH 9,0) e manter a 4 ° C. Adicionar 8 mL de uma solução de estoque tricaina por 100 ml de água numa proveta, e utilizar um líquido para transferir os machos à solução tricaina. </li><li> Usar o equivalente de testículos de um macho por embraiagem necessário para ser fertilizado num volume de solução de Hank correspondente a 100 uL para cada macho (por exemplo, os testículos de 10 machos recolhidos em 1 ml de solução de Hank, para fertilizar 10 embraiagens com 100 ul / embraiagem). </li><li> Confirmar eutanásia por cessação de movimentos de emalhar por 15 minutos. Após a eutanásia, remova os machos do copo com uma colher. Lavar os machos brevemente com água condicionada e seque-os levemente, colocando-os brevemente sobre vários locais de umapapel toalha. </li></ol></li><li> Para remover os testículos, primeiros decapitar sacrificados machos usando tesouras de dissecação ou uma lâmina de barbear, e fazer um corte longitudinal ao longo do abdômen com dissecando scissors.Under um microscópio de dissecação com uma fonte de luz refletida, remover os órgãos internos com uma pinça de dissecação. Puxe cada uma das massas testículos com uma pinça e colocá-los dentro do tubo de microcentrífuga contendo solução de Hank. NOTA: Testículos pode ser identificado como cada uma das duas estruturas alongadas de aspecto translúcido encontrados ao lado das paredes do corpo e que convergem perto da cloaca. Testículos pode ficar 2-3 minutos sobre uma superfície da placa de Petri após a dissecação, e antes da sua colocação em solução de Hank. </li><li> Liberar o esperma para a solução por corte dos testículos com uma espátula estreita e / ou cuidado pipetando para cima e para baixo 5-6 vezes os testículos em solução com uma micropipeta 1.000 ul-ponta, evitando a formação de bolhas de ar. Deixar depositar o testículos detritos. </li><li> Guardar a solução de espermatozóides no gelo, onde ele pode manter a sua potência para até 2-3 horas. Se procedendo à luz UV-tratamento de solução de esperma, transferir a solução para um tubo de microcentrífuga limpo deixando as partes de trás dos testículos. </li></ol> 3. Tratamento de UV NOTA: O tratamento de UV é usada para a ligação cruzada de ADN de esperma de modo a torná-lo inactivo no embrião. Este passo só é usado quando a produção de embriões diplóides ginogenéticos haplóides ou homozigotos ginogenéticos. solução de esperma para o tratamento de UV devem ser separados a partir de pedaços de testículos (passo 2.4), como grandes peças podem proteger o esperma de o tratamento com UV. <ol><li> Transferir a solução esperma para um poço seco e limpo de uma placa de vidro depressão sentado em uma cama de gelo (por exemplo gelo dentro de uma placa de petri). Use até 1 ml de solução de espermatozóides por placa de vidro bem. </li><li> Expor a solução de esperma de UV, colocando a placa de vidro depressão no leito de gelo sob uma lâmpada UV. Tratar a solução do esperma para 90 segundos com um 115 V (60 Hz, 0.68A) lâmpada UV em um 19 cm (7,5 polegadas) de distância. Com o fim de uma ponta de pipeta, misturar suavemente a solução cada 30 segundos durante o tratamento com UV (utilizar uma ponta de pipeta limpa a cada 30 seg). </li><li> Usando uma ponta de pipeta limpa e micropipeta, transferir a solução de espermatozóides tratados para um novo tubo de microcentrífuga. Armazenar em gelo até ser necessário para a fertilização in vitro (não mais do que 2-3 horas de extracção). </li></ol> 4. Extrusão manual de óvulos maduros NOTA: As fêmeas obtidas por interrupção do acasalamentos naturais prontamente produzir ovos sob anestesia e pressão manual. Durante este procedimento, o tratamento tricaina deve ser cuidadosamente controlada para evitar a exposição excessiva que pode impedir a recuperação das fêmeas. <ol><li> Anestesiar fêmeas por exposição à luz a solução tricaina: fêmeas de transferência com uma rede de tricaina solução em água condicionado (feita pela adição de 8 ml de tricaina solução stock de 0,2% a 100 ml de água de peixe condicionado) por cerca de 2-5 minutos, até a parada de peixe movimento Gill. </li> &lt;li&gt; Assim que uma mulher interrompe o movimento de emalhar, use uma colher para recolher e brevemente lave-o em água condicionada. Ainda usando a colher para mover o peixe, seque-o levemente, colocando-o brevemente e repetidamente em vários locais de uma toalha de papel, em seguida, transferi-lo para um e seco placa de 10 cm de diâmetro petri limpo. Aproxime-se do peixe com a colher na anterior à direção posterior, para evitar potencialmente danificar o opérculo branquial. </li><li> Use lenços de laboratório ou tecido mole para secar delicadamente ainda mais a área anal, para evitar quaisquer ovos liberados a partir prematuramente sendo ativado pela água. Amortecendo os dedos levemente com água (para evitá-los furando a escamas de peixe), coloque um dedo de uma das mãos nas costas do sexo feminino como suporte, e com um dedo da outra mão aplicar uma leve pressão ao longo do abdômen da fêmea até que os ovos se tornar extrudido. </li><li> Usar uma espátula estreita para mover os ovos para longe do corpo da mulher. Coloque a fêmea de volta em um tanque com água condicionada para a recuperação. <br/&gt; NOTA: Uma vez que os ovos são extrudados enquanto a fêmea está encontrando-se em um lado de seu corpo, ela pode ser capotou e o processo repetido do outro lado dela para obter ovos adicionais. Para garantir a recuperação total da fêmea, aplicam-se apenas pressão manual suave no abdômen, e realizar o procedimento de parada movimento de emalhar para voltar à água em menos de 2 min. </li><li> Ative (com exposição à água) e fertilizar (com esperma solução adição) ovos simultaneamente e dentro de 90 segundos após a extrusão (ver secção 5). </li></ol> 5. Fertilização In Vitro NOTA: a fertilização Zebrafish em cruzamentos naturais é externo, dependente do lançamento simultâneo e ativação por água de óvulos e espermatozóides durante o acasalamento. Em fertilização in vitro imita este processo, expondo os ovos de solução de esperma, na presença de água. volume de água é inicialmente pequena (1 ml), a fim de aumentar a concentração efectiva do esperma. A ligação através de esperma ocorre no prazo de 15-20 seg 10 &lt;/ Sup&gt;, e o volume de água pode, então, ser aumentada. Chorion levantamento contribui ainda mais para a próxima sincronização da embreagem através da limitação da janela para a competência para a ligação dos espermatozóides 11,12. Os embriões resultantes, portanto, exibir ciclos de divisão celular em grande parte simultâneos durante os estágios iniciais de clivagem. <ol><li> Adicionar 100 ul de solução de esperma (correspondente ao equivalente de testículos de um macho - ver Parte 2) para a embraiagem de ovos extrudido sobre uma placa de petri. Agite suavemente a ponta da pipeta usado para adicionar a solução de espermatozóides entre os ovos para misturar o esperma e os ovos juntos, certificando-se de não levantar a ponta da superfície da placa de petri para evitar danos ovo. </li><li> ativar imediatamente os ovos, adicionando 1 ml de solução embrionário médio (E3) (água condicionada também é aceitável como um substituto para a E3 nas partes 5 a 7) e novamente misture delicadamente óvulos e espermatozóides rodando suavemente com a ponta da pipeta. Iniciar um temporizador para iniciar a temporização relativa à adubação. </li&gt; <li> Em 1 mpf no volume de 1 ml, inundar o prato com E3. Antes de continuar, deixe repousar até 10-12 mpf para permitir a ativação do ovo, incluindo a expansão córion completo. </li></ol> 6. O tratamento de choque térmico NOTA: Um choque térmico aplicado no embrião inicial inibe a duplicação centriole, resultando em um complemento incompleto de centrioles para conduzir a formação do fuso durante o ciclo celular subsequente 2. A ausência de fuso por sua vez resulta na falta de formação de sulco 13. <ol><li> Após a expansão das córions (10-12 MPF), despeje os embriões a partir da placa de petri em um coador de chá. Lavar a placa de petri utilizando um frasco de lavagem com E3, a fim de recolher quaisquer embriões restantes no coador de chá. </li><li> Coloque o coador de chá com os embriões dentro de um copo num banho pré-aquecido com E3 a 28,5 ° C. Pré-equilibrar o copo e E3 à temperatura do banho de água e verifique se não há E3 suficiente para que todos os embriões no chácoador são expostos ao meio. </li><li> Aos 22 mpf, remova o coador de chá do banho de água de 28,5 ° C, brevemente apagá-lo em uma toalha de papel para remover o excesso de umidade, e colocá-lo dentro de um copo E3 semelhante pré-aquecido em um banho térmico a 41,4 ° C. </li><li> Aos 24 mpf, transferir o coador de chá de volta para a E3, em banho-maria a 28,5 ° C após uma breve blotting. Aos 29 mpf, use um frasco de lavagem com E3 para transferir os embriões do coador de chá para uma placa de Petri de 10 cm. </li></ol> 7. Seleção de embriões com um One-ciclo Citocinese Stall <ol><li> Durante o período de tempo de 35-45 MPF, sob um microscópio de dissecação com uma fonte luminosa transmitida, seleccionar os embriões que são submetidos a clivagem simétrico na fase de 2 células, e que são, portanto fertilizado. Remover embriões que não são submetidos a clivagem celular. </li><li> Continuar a observar os embriões fertilizados, seleccionados para a divisão celular normal durante o primeiro ciclo celular, e durante o segundoOND ciclo celular (50-65 MPF). </li><li> Classificar os embriões de acordo com as seguintes categorias (Figura 2C): 4 células ( &quot;no box&quot;, no 2: standard arranjo 2 para um embrião de 4 células); 3 células ( &quot;tenda parcial&quot;, em um aberrantes 2 células menores: 1 arranjo de grandes células); 2 e células ( &quot;impasse&quot;, embriões exibindo um atraso do ciclo de uma célula numa mistura 1: 1 arranjo idêntico ao de um embrião de duas células). Organizar os embriões paralisadas em uma placa de petri fresca. NOTA: Nesta fase, embriões no 2: arranjo 2 correspondem àquelas em que durante o segundo ciclo celular nem blastomere sofreu uma tenda divisão celular; embriões em um aberrantes 2 células menores: 1 arranjo de grandes células correspondem àquelas onde de choque térmico causado uma tenda do ciclo celular durante o segundo ciclo celular em um blastomere mas não o outro; e embriões &quot;estagnadas&quot; numa proporção de 1: 1 arranjo correspondem àqueles em que durante o segundo ciclo celular ambos os blastómeros foram submetidos a divisão celular desejadotenda. embriões paralisadas deve retomar a clivagem celular durante o período seguinte do ciclo celular (65-80 MPF). A disposição dos blastómeros podem ser variável, devido aos sinais incompletos do ciclo celular anterior para estabilizar o eixo de 2,14, mas a maioria dos embriões vai formar uma blástula relativamente normal que pode sofrer o desenvolvimento normal. </li><li> Permitir que embriões para desenvolver na placa de Petri, com um limite de 80 embriões por placa de 10 cm. Aos 24 hpf, observar os embriões para determinar se eles têm uma morfologia característica normal dos embriões diplóides diplóides ou homozigóticos 6 (medida normal da extensão do eixo (Figura 3A, 3C)), em contraste com a extensão do eixo reduzida e aumento da espessura da característica corpo de haplóides (Figura 3B)), e / ou avaliar diploidização utilizando marcadores genéticos de pigmento em 36 MPF, tal como ouro ou albino e outros tais ensaios (Figura 3 e ver abaixo) 2,6,9. </li&gt; <li> Remova todos os embriões que parecem ter uma morfologia haplóides, ou que tenham lisadas ou apresentar outros defeitos grosseiramente anormais. NOTA: Se desejar, permitir que os embriões a se desenvolver até 5 dias após a fertilização, continuando a remover embriões lisadas ou grosseiramente anormais em uma base diária e adicionando fresco E3 para refrescar o meio. NOTA: Sobrevivência embriões podem também ser cultivados após a insuflação da bexiga natatória no dia 5 por transferência para um sistema de alimentação e incubação sob condições padrão. </li></ol>

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The authors do not have competing financial interests.

As etapas críticas É fundamental para o trabalho em condições de efetiva em fertilização in vitro. Para garantir um bom suprimento de óvulos maduros (passo 1), as fêmeas configurado para o acasalamento não deveria ter sido criado em cruzes de acasalamento durante pelo menos 5 dias e deve aparecer grávida. Durante a interrupção da reprodução, um observador pode monitorar 15-30 tanques de forma adequada para a primeira aparição de extrusão de ovo natural. Interrupção de acoplam...

Este protocolo permite a manipulação de ploidia de embriões de peixe-zebra, tal como na geração de diplóides ginogenéticos homozigóticos de haplóides ginogenéticos (Figura 1) ou a produção de tetraplóides. Isto é conseguido através da indução de um atraso na citocinese correspondente a precisamente um ciclo celular (Figura 2A, 2B). O atraso tecla de um ciclo na citocinese é conseguido por tratamento com choque térmico. O protocolo padrão de Choque Térmico (SH) como originalmente descrito por Streisinger e colegas envolvido um impulso de temperatura durante o período de MPF 13-15, resultando em uma tenda a divisão celular de um ciclo durante o primeiro ciclo celular 1. A eficiência deste protocolo foi recentemente melhorado pela digitalização dos ciclos celulares início com uma janela deslizante temporal do tratamento de choque térmico. Esta verificação identificado um ponto de tempo depois de um choque de calor, ainda dentro do primeiro ciclo celular (22-24 MPF), que resulta em uma maior taxa de EMBRyos com uma tenda a divisão celular de um ciclo, que neste caso afecta o segundo ciclo celular 2. A observação de que as manipulações experimentais durante o primeiro ciclo celular interferir com a divisão celular durante o segundo ciclo celular e causar a duplicação do ADN conteúdo também tem sido relatada em outras espécies de peixe 3,4. Referimo-nos a este protocolo modificado como Choque Térmico 2 (HS2 - o termo &quot;2&quot; indica que o impulso de calor ocorre num ponto de tempo mais tarde do que o método HS padrão, e que o atraso do ciclo celular causado por HS2 ocorre durante o segundo ciclo celular ). Estes estudos mostraram que a base de prisão citocinese após o choque térmico é a inibição de duplicação centriole durante o impulso de calor, o que afecta a formação do fuso e indução sulco no seguinte ciclo celular. Resultados HS2 em rendimentos de parada do ciclo celular se aproximando de 100%, e as taxas de ploidia duplicação até 4 vezes superior HS standard 2. sagacidade embriões tratadosha choque térmico durante o ciclo celular blastomere apresentam muitos efeitos deletérios, sugerindo que o choque térmico afeta vários processos necessários para a divisão celular 2. Por outro lado, se o choque de calor é aplicada antes do início do ciclo celular (período de tempo de 0-30 MPF), parece ter efeitos consistentes com interferência específica com a duplicação centriole e não parece afectar outros processos celulares essenciais 2 . Estes estudos mostraram que o tempo antes da iniciação da divisão blastï¿½ero parece ser um período de desenvolvimento passível de choque térmico utilizando como ferramenta para manipular especificamente através da inibição de ploidia centriole. A causa subjacente da aparente selectividade para a choque térmico na duplicação centríolo é desconhecida, mas pode estar relacionada a uma degradação seletiva de subestruturas centrossoma observados em estresse por calor em certos tipos de células, como leucócitos 5. sincronização temporal de embrionáriosenvolvimento é conseguido por fertilização in vitro (FIV). O uso de esperma não tratada durante resultados de fertilização em embriões diplóides que após a HS2 induzidas por um ciclo tenda cytokinesis tornar tetraploid. O uso de espermatozóides tratados com UV, que transporta ligações cruzadas que inativam o seu DNA, resulta em embriões haplóides ginogenéticos 6, que após HSII induzidas por um ciclo cytokinesis tenda tornar diplóides ginogenéticos 2. Devido a toda a duplicação do genoma, resultando, os últimos ginogenéticos diplóides são homozigóticos em cada locus único em todo o genoma. Para concisão, nos referimos a ginogenéticos embriões haplóides como &quot;haplóides&quot; e embriões diplóides ginogenéticos homozigotos como &quot;diplóides homozigotos&quot;. Se viáveis ​​e férteis, diplóides homozigóticos pode ser utilizado para iniciar linhas estéreis e letais-livre. homozygosity direta induzida por HS2 deve também ser facilmente incorporados na análise genética ou telas genéticas, uma vez que diplóides homozigotos de fêmeas que são portadores heterozigotos de Muttaxas de exposição ções de homozigose em altas e fixas (50%) rácios 2. O protocolo a seguir descreve etapas para executar HS2 e induzem a duplicação ploidy com homozigose completa. Para a produção tetraplóide, solução de esperma deve ser tratada. Para a produção de diplóide homozigótica, o esperma deve ser inactivado por tratamento com UV. Além disso, como descrito na discussão, marcadores de pigmentos visíveis pode também ser usado para facilitar a identificação dos diplóides homozigóticos. Companheiro de peixe-zebra, principalmente durante a primeira 3 horas do início do seu ciclo de luz 7, e ambos os adultos e os ovos são sensíveis aos ritmos circadianos 8, portanto, para obter os melhores resultados do procedimento de fertilização in vitro deve ocorrer dentro deste período de tempo.

<table><tbody><tr><td>Zebrafish mating boxes</td><td>Aqua Schwarz</td><td>SpawningBox1</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>S3264</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>P9791</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;-7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma</td><td>63138</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine</td><td>Western Chemical</td><td>Tricaine-D (MS 222)</td><td>FDA approved (ANADA 200-226)</td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Sigma</td><td>77-86-1</td><td>to prepare 1 M Tris pH 9.0</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sigma</td><td>920-1</td><td>to prepare 1 M Tris pH 9.0</td></tr><tr><td>Fish net (fine mesh) (4-5 in)</td><td>PennPlax</td><td>(ThatFishThatPlace # 212370)</td><td>available in ThatFishThatPlace</td></tr><tr><td>Plastic spoon</td><td></td><td></td><td>available in most standard stores</td></tr><tr><td>Dissecting scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14091-09</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting forceps</td><td>Dumont</td><td>SS</td><td>available from Fine Science Tools</td></tr><tr><td>Dissecting stereoscope (with transmitted light source)</td><td>Nikon</td><td>SMZ645</td><td>or equivalent</td></tr><tr><td>Reflective light source (LED arms)</td><td>Fostec</td><td>KL1600 LED</td><td>or equivalent</td></tr><tr><td>Petri plates 10 cm diameter</td><td></td><td></td><td>any maker</td></tr><tr><td>Eppendorf tubes 1.5 ml</td><td></td><td></td><td>any maker</td></tr><tr><td>Ice bucket</td><td></td><td></td><td>any maker</td></tr><tr><td>Pipetteman P-1000</td><td></td><td></td><td>any maker</td></tr><tr><td>Pipette tips 1,000 &amp;micro;l</td><td></td><td></td><td>any maker</td></tr><tr><td>Narrow spatula</td><td>Fisher</td><td>14-374</td><td></td></tr><tr><td>Depression glass plate</td><td>Corning Inc</td><td>722085 (Fisher cat. No 13-748B)</td><td>available from Fisher Scientific</td></tr><tr><td>UV lamp</td><td>UVP</td><td>Model XX-15 (cat No. UVP18006201)</td><td>available from Fisher Scientific. Although not observed by us with this model, some UV sources have been observed to experience a decrease of intensity over time (if this is the case, see Modifications and Troubleshooting)</td></tr><tr><td>UV glasses</td><td></td><td></td><td>any maker</td></tr><tr><td>Paper towels</td><td></td><td></td><td>any maker</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark</td><td>06-666-11</td><td>available from Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Timer stop watch</td><td></td><td></td><td>any maker</td></tr><tr><td>Wash bottle</td><td>Thermo Scientific</td><td>24020500</td><td>available from Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Tea strainer</td><td></td><td></td><td>available in kitchen stores</td></tr><tr><td>beakers, 250 ml (2)</td><td>Corning Inc.</td><td>1000250</td><td>available from Fisher Scientific</td></tr><tr><td>water bath (2)</td><td></td><td></td><td>any maker, with accurary to 0.1 C (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; Shel Lab H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O Bath Series)</td></tr><tr><td>Hanks&amp;rsquo; Solution 1</td><td>see above</td><td>see above</td><td>8.0 g NaCl, 0.4 g KCl in 100 ml ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O. Store at 4&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Hanks&amp;rsquo; Solution 2</td><td>see above</td><td>see above</td><td>0.358 g Anhydrous Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 0.6 g KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; in 100 ml ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O. Store at 4 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Hanks&amp;rsquo; Solution 4</td><td>see above</td><td>see above</td><td>0.72 g CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; in 50 ml ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O. Store at 4 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Hank&#039;s Premix</td><td>see above</td><td>see above</td><td>add, in the following order: 10.0 ml Solution 1;&amp;nbsp; 1.0 ml Solution 2;&amp;nbsp; 1.0 ml Solution 4;&amp;nbsp; 86.0 ml ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O;&amp;nbsp; 1.0 ml Solution 5. Store at 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Hanks&amp;rsquo; Solution 6</td><td>see above</td><td>see above</td><td>0.33 g NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; in 10 ml ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O. Prepare fresh the morning of the IVF procedure.</td></tr><tr><td>Hank&#039;s Solution (final solution)</td><td>see above</td><td>see above</td><td>Combine 990 &amp;mu;l of Hank&amp;rsquo;s Premix and 10 &amp;mu;l of freshly made Solution 6 (NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; solution)</td></tr></tbody></table>

ploidy manipulation of zebrafish embryos with heat shock 2 treatment

Manipulação de ploidia permite transformações úteis, tais como diplóides para tetraploids, ou haplóides para diplóides. No peixe-zebra Danio rerio, especificamente a geração de diplóides ginogenéticos homozigóticos é útil na análise genética, porque permite a produção directa de homozigotos de um único mãe heterozigótica. Este artigo descreve um protocolo modificado para a duplicação de ploidia com base num impulso de calor durante o primeiro ciclo celular, choque térmico 2 (HS2). Através da inibição de duplicação centriole, este método resulta em uma tenda preciso divisão celular durante o segundo ciclo celular. A baia de divisão de um ciclo preciso, acoplado a duplicação DNA afetado, resulta na duplicação do genoma inteiro. Protocolos associados com este método incluem ovo e esperma recolha, tratamento com UV de esperma, fertilização in vitro e pulso de calor para provocar um atraso da divisão do ciclo de uma célula e a duplicação de ploidia. Uma versão modificada deste protocolo pode ser aplicadopara induzir alterações de ploidia em outras espécies animais.

Apesar de a uma célula-box ciclo citocinese, a replicação do ADN ocorre normalmente em tais embriões, o que resulta na duplicação do teor de ADN do embrião (figura 1). O protocolo Streisinger Choque Térmico (HS standard) envolve um pulso de calor durante o período de 13-15 minutos após a fertilização (MPF) e induz principalmente detenção cytokinesis durante a primeira divisão celular embrionária em 35 mpf 1,2, enquanto que o método derivado de...

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Ploidy Manipulation of Zebrafish Embryos with Heat Shock 2 Treatment

Um protocolo modificado para a manipulação ploidy usa um choque de calor para induzir uma tenda de um ciclo na citocinese no embrião. Este protocolo é demonstrado no peixe-zebra, mas podem ser aplicados a outras espécies.

Manipulação de ploidia de embriões Zebrafish com choque térmico 2 Tratamento

Manipulation of ploidy allows for useful transformations, such as diploids to tetraploids, or haploids to diploids. In the zebrafish Danio rerio, ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

10.0K visualizações.  University of Wisconsin.  Um protocolo modificado para a manipulação ploidy usa um choque de calor para induzir uma tenda de um ciclo na citocinese no embrião. Este protocolo é demonstrado no peixe-zebra, mas podem ser aplicados a outras espécies. 

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Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA mutation rates. Changes in replication timing occur during development and in cancer, but the role replication timing plays in development and disease is not known. Zebrafish were recently established as an in vivo model system to study replication timing. Here is detailed the protocols for using the zebrafish to determine DNA replication timing. After sorting cells from embryos and adult zebrafish, high-resolution genome-wide DNA replication timing patterns can be constructed by determining changes in DNA copy number through analysis of next generation sequencing data. The zebrafish model system allows for evaluation of the replication timing changes that occur in vivo throughout development, and can also be used to assess changes in individual cell types, disease models, or mutant lines. These methods will enable studies investigating the mechanisms and determinants of replication timing establishment and maintenance during development, the role replication timing plays in mutations and tumorigenesis, and the effects of perturbing replication timing on development and disease.

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Zebrafish were recently used as an in vivo model system to study DNA replication timing during development. Here is detailed the protocols for using zebrafish embryos to profile replication timing. This protocol can be easily adapted to study replication timing in mutants, individual cell types, disease models, and other species.

Sincronismo de replicação de DNA usando Zebrafish como um sistema modelo In Vivo de criação de perfil

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA ...

Genética

Making Gynogenetic Diploid Zebrafish by Early Pressure

Heterozygosity in diploid eukaryotes often makes genetic studies cumbersome. Methods that produce viable homozygous diploid offspring directly from heterozygous females allow F1 mutagenized females to be screened directly for deleterious mutations in an accelerated forward genetic screen. Streisinger et al.1,2 described methods for making gynogenetic (homozygous) diploid zebrafish by activating zebrafish eggs with ultraviolet light-inactivated sperm and preventing either the second meiotic or the first zygotic cell division using physical treatments (heat or pressure) that deploymerize microtubules. The "early pressure" (EP) method blocks the meiosis II, which occurs shortly after fertilization. The EP method produces a high percentage of viable embryos that can develop to fertile adults of either sex. The method generates embryos that are homozygous at all loci except those that were separated from their centromere by recombination during meiosis I. Homozygous mutations are detected in EP clutches at between 50% for centromeric loci and less than 1% for telomeric loci. This method is reproduced verbatim from the Zebrafish Book3.

This is a method for generating gynogenetic diploid zebrafish embryos (embryos whose only genetic contribution comes from the mother) by blocking the second meiotic division immediately after fertilization with ultraviolet light-inactivated sperm. EP embryos are not fully homozygous due to recombination during the first meiotic division, however they are homozygous at all loci that have not been separated from their centromere by recombination.

Fazendo Zebrafish Diplóide Gynogenetic por pressão inicial

Heterozygosity in diploid eukaryotes often makes genetic studies cumbersome. Methods that produce viable homozygous diploid offspring directly from ...

Biologia

Visualizing the Developing Brain in Living Zebrafish using Brainbow and Time-lapse Confocal Imaging

Development of the vertebrate nervous system requires a precise coordination of complex cellular behaviors and interactions. The use of high resolution in vivo imaging techniques can provide a clear window into these processes in the living organism. For example, dividing cells and their progeny can be followed in real time as the nervous system forms. In recent years, technical advances in multicolor techniques have expanded the types of questions that can be investigated. The multicolor Brainbow approach can be used to not only distinguish among like cells, but also to color-code multiple different clones of related cells that each derive from one progenitor cell. This allows for a multiplex lineage analysis of many different clones and their behaviors simultaneously during development. Here we describe a technique for using time-lapse confocal microscopy to visualize large numbers of multicolor Brainbow-labeled cells over real time within the developing zebrafish nervous system. This is particularly useful for following cellular interactions among like cells, which are difficult to label differentially using traditional promoter-driven colors. Our approach can be used for tracking lineage relationships among multiple different clones simultaneously. The large datasets generated using this technique provide rich information that can be compared quantitatively across genetic or pharmacological manipulations. Ultimately the results generated can help to answer systematic questions about how the nervous system develops.

In vivo imaging is a powerful tool that can be used to investigate the cellular mechanisms underlying nervous system development. Here we describe a technique for using time-lapse confocal microscopy to visualize large numbers of multicolor Brainbow-labeled cells in real time within the developing zebrafish nervous system.

Visualizando o cérebro em desenvolvimento em zebrafish vivo usando Brainbow e Imagem Confocal de lapso de tempo

Development of the vertebrate nervous system requires a precise coordination of complex cellular behaviors and interactions. The use of high resolution in ...

Biologia do Desenvolvimento

Separation of Follicular Cells and Oocytes in Ovarian Follicles of Zebrafish

Zebrafish has become an ideal model to study the ovarian development of vertebrates. The follicle is the basic unit of the ovary, which consists of oocytes and surrounding follicular cells. It is vital to separate both follicular cells and oocytes for various research purposes such as for primary culture of follicular cells, analysis of gene expression, oocyte maturation and in vitro fertilization, etc. The conventional method uses forceps to separate both compartments, which is laborious, time consuming and has high damage to the oocyte. Here, we have established a simple method to separate both compartments using a pulled glass capillary. Under a stereomicroscope, oocytes and follicular cells can be easily separated by pipetting in a pulled fine glass capillary (the diameter depends on the follicle diameter). Compared with the conventional method, this new method has high efficiency in separating both oocytes and follicular cells and has low damage to the oocytes. More importantly, this method can be applied to early-stage follicles including at the pre-vitellogenesis stage. Thus, this simple method can be used to separate follicular cells and oocytes of zebrafish.

Here, we present a simple method for separating follicular cells and oocytes in zebrafish ovarian follicles, which will facilitate investigations of ovarian development in zebrafish.

Separação de células foliculares e oócitos em folículos ovarianos de zebrafish

Zebrafish has become an ideal model to study the ovarian development of vertebrates. The follicle is the basic unit of the ovary, which consists of ...

Rapid and Efficient Spatiotemporal Monitoring of Normal and Aberrant Cytosine Methylation within Intact Zebrafish Embryos

Cytosine methylation is highly conserved across vertebrate species and, as a key driver of epigenetic programming and chromatin state, plays a critical role in early embryonic development. Enzymatic modifications drive active methylation and demethylation of cytosine into 5-methylcytosine (5-mC) and subsequent oxidation of 5-mC into 5-hydroxymethylcytosine, 5-formylcytosine, and 5-carboxylcytosine. Epigenetic reprogramming is a critical period during in utero development, and maternal exposure to chemicals has the potential to reprogram the epigenome within offspring. This can potentially cause adverse outcomes such as immediate phenotypic consequences, long-term effects on adult disease susceptibility, and transgenerational effects of inherited epigenetic marks. Although bisulfite-based sequencing enables investigators to interrogate cytosine methylation at base-pair resolution, sequencing-based approaches are cost-prohibitive and, as such, preclude the ability to monitor cytosine methylation across developmental stages, multiple concentrations per chemical, and replicate embryos per treatment. Due to the ease of automated in vivo imaging, genetic manipulations, rapid ex utero development time, and husbandry during embryogenesis, zebrafish embryos continue to be used as a physiologically intact model for uncovering xenobiotic-mediated pathways that contribute to adverse outcomes during early embryonic development. Therefore, using commercially available 5-mC-specific antibodies, we describe a cost-effective strategy for rapid and efficient spatiotemporal monitoring of cytosine methylation within individual, intact zebrafish embryos by leveraging whole-mount immunohistochemistry, automated high-content imaging, and efficient data processing using programming language prior to statistical analysis. To current knowledge, this method is the first to successfully detect and quantify 5-mC levels in situ within zebrafish embryos during early development. The method enables the detection of DNA methylation within the cell mass and also has the ability to detect cytosine methylation of yolk-localized maternal mRNAs during the maternal-to-zygotic transition. Overall, this method will be useful for the rapid identification of chemicals that have the potential to disrupt cytosine methylation in situ during epigenetic reprogramming.

This paper describes a protocol for the rapid and efficient spatiotemporal monitoring of normal and aberrant cytosine methylation within intact zebrafish embryos.

Monitoramento espaço-temporal rápido e eficiente da metilação normal e aberrante da citosina em embriões intactos de peixe-zebra

Cytosine methylation is highly conserved across vertebrate species and, as a key driver of epigenetic programming and chromatin state, plays a critical ...

The Zebrafish Tol2 System: A Modular and Flexible Gateway-Based Transgenesis Approach

Fetal alcohol spectrum disorders (FASD) are characterized by a highly variable set of structural defects and cognitive impairments that arise due to prenatal ethanol exposure. Due to the complex pathology of FASD, animal models have proven critical to our current understanding of ethanol-induced developmental defects. Zebrafish have proven to be a powerful model to examine ethanol-induced developmental defects due to the high degree of conservation of both genetics and development between zebrafish and humans. As a model system, zebrafish possess many attributes that make them ideal for developmental studies, including large numbers of externally fertilized embryos that are genetically tractable and translucent. This allows researchers to precisely control the timing and dosage of ethanol exposure in multiple genetic contexts. One important genetic tool available in zebrafish is transgenesis. However, generating transgenic constructs and establishing transgenic lines can be complex and difficult. To address this issue, zebrafish researchers have established the transposon-based Tol2 transgenesis system. This modular system uses a multisite Gateway cloning approach for the quick assembly of complete Tol2 transposon-based transgenic constructs. Here, we describe the flexible Tol2 system toolbox and a protocol for generating transgenic constructs ready for zebrafish transgenesis and their use in ethanol studies.

This work describes a protocol for the modular Tol2 transgenesis system, a gateway-based cloning method to create and inject transgenic constructs into zebrafish embryos.

O Sistema Zebrafish Tol2: Uma Abordagem de Transgênese Modular e Flexível Baseada em Gateway

Fetal alcohol spectrum disorders (FASD) are characterized by a highly variable set of structural defects and cognitive impairments that arise due to ...

Triggering Cell Stress and Death Using Conventional UV Laser Confocal Microscopy

Using a standard confocal setup, a UV ablation method can be utilized to selectively induce cellular injury and to visualize single-cell responses and cell-cell interactions in the CNS in real-time. Previously, studying these cell-specific responses after injury often required complicated setups or the transfer of cells or animals into different, non-physiological environments, confounding immediate and short-term analysis. For example, drug-mediated ablation approaches often lack the specificity that is required to study single-cell responses and immediate cell-cell interactions. Similarly, while high-power pulsed laser ablation approaches provide very good control and tissue penetration, they require specialized equipment that can complicate real-time visualization of cellular responses. The refined UV laser ablation approach described here allows researchers to stress or kill an individual cell in a dose- and time-dependent manner using a conventional confocal microscope equipped with a 405-nm laser. The method was applied to selectively ablate a single neuron within a dense network of surrounding cells in the zebrafish spinal cord. This approach revealed a dose-dependent response of the ablated neurons, causing the fragmentation of cellular bodies and anterograde degeneration along the axon within minutes to hours. This method allows researchers to study the fate of an individual dying cell and, importantly, the instant response of cells-such as microglia and astrocytes-surrounding the ablation site.

Targeted manipulations to cause directed stress or death in individual cells have been relatively difficult to accomplish. Here, a single-cell-resolution ablation approach to selectively stress and kill individual cells in cell culture and living animals is described based on a standard confocal UV laser.

Provocando estresse celular e morte utilizando convencional UV laser microscopia confocal

Using a standard confocal setup, a UV ablation method can be utilized to selectively induce cellular injury and to visualize single-cell responses and ...

Neurociência

Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes oxidation of molecules (lipid, DNA, protein) and leads to cell death. Oxidative stress also impacts the progression of several pathological conditions such as diabetes, retinopathies, neurodegeneration, and cancer. Thus, it is important to define tools to investigate oxidative stress conditions not only at the level of single cells but also in the context of whole organisms. Here, we consider the zebrafish embryo as a useful in vivo system to perform such studies and present a protocol to measure in vivo oxidative stress. Taking advantage of fluorescent ROS probes and zebrafish transgenic fluorescent lines, we develop two different methods to measure oxidative stress in vivo: i) a &#8220;whole embryo ROS-detection method&#8221; for qualitative measurement of oxidative stress and ii) a &#8220;single-cell&#160;ROS detection method&#8221; for quantitative measurements of oxidative stress. Herein, we demonstrate the efficacy of these procedures by increasing oxidative stress in tissues by oxidant agents and physiological or genetic methods. This protocol is amenable for forward genetic screens and it will help address cause-effect relationships of ROS in animal models of oxidative stress-related pathologies such as neurological disorders and cancer.

Here we report a protocol to measure oxidative stress in living zebrafish embryos. This procedure allows reactive oxygen species (ROS) detection in both whole embryo tissues and single-cell populations. This protocol will accomplish both qualitative and quantitative analyses.

Análise do estresse oxidativo em embriões Zebrafish

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes ...

Production of Haploid Zebrafish Embryos by In Vitro Fertilization

The zebrafish has become a mainstream vertebrate model that is relevant for many disciplines of scientific study. Zebrafish are especially well suited for forward genetic analysis of developmental processes due to their external fertilization, embryonic size, rapid ontogeny, and optical clarity &#8211; a constellation of traits that enable the direct observation of events ranging from gastrulation to organogenesis with a basic stereomicroscope. Further, zebrafish embryos can survive for several days in the haploid state. The production of haploid embryos in vitro is a powerful tool for mutational analysis, as it enables the identification of recessive mutant alleles present in first generation (F1) female carriers following mutagenesis in the parental (P) generation. This approach eliminates the necessity to raise multiple generations (F2, F3, etc.) which involves breeding of mutant families, thus saving the researcher time along with reducing the needs for zebrafish colony space, labor, and the husbandry costs. Although zebrafish have been used to conduct forward screens for the past several decades, there has been a steady expansion of transgenic and genome editing tools. These tools now offer a plethora of ways to create nuanced assays for next generation screens that can be used to further dissect the gene regulatory networks that drive vertebrate ontogeny. Here, we describe how to prepare haploid zebrafish embryos. This protocol can be implemented for novel future haploid screens, such as in enhancer and suppressor screens, to address the mechanisms of development for a broad number of processes and tissues that form during early embryonic stages.

Production of Haploid Zebrafish Embryos by In Vitro Fertilization

The zebrafish is a powerful model system for developmental biology and human disease research due to their genetic similarity with higher vertebrates. This protocol describes a methodology to create haploid zebrafish embryos that can be utilized for forward screen strategies to identify recessive mutations in genes essential for early embryogenesis.

Produção de Haplóide embriões Zebrafish por<em&gt; In Vitro</em&gt; Fertilização

The zebrafish has become a mainstream vertebrate model that is relevant for many disciplines of scientific study. Zebrafish are especially well suited for ...

Efficient PAM-Less Base Editing for Zebrafish Modeling of Human Genetic Disease with zSpRY-ABE8e

CRISPR/Cas9 technology has increased the value of zebrafish for modeling human genetic diseases, studying disease pathogenesis, and drug screening, but protospacer adjacent motif (PAM) limitations are a major obstacle to creating accurate animal models of human genetic disorders caused by single-nucleotide variants (SNVs). Until now, some SpCas9 variants with broad PAM compatibility have shown efficiency in zebrafish. The application of the optimized SpRY-mediated adenine base editor (ABE), zSpRY-ABE8e, and synthetically modified gRNA in zebrafish has enabled efficient adenine-guanine base conversion without PAM restriction. Described here is a protocol for efficient adenine base editing without PAM limitation in zebrafish using zSpRY-ABE8e. By injecting a mixture of zSpRY-ABE8e mRNA and synthetically modified gRNA into zebrafish embryos, a zebrafish disease model was constructed with a precise mutation that simulated a pathogenic site of the TSR2 ribosome maturation factor (tsr2). This method provides a valuable tool for the establishment of accurate disease models for studying disease mechanisms and treatments.

This protocol describes how to perform efficient adenine base editing without PAM limitation to construct a precise zebrafish disease model using zSpRY-ABE8e.

Edição de Base Eficiente sem PAM para Modelagem de Zebrafish de Doenças Genéticas Humanas com zSpRY-ABE8e

CRISPR/Cas9 technology has increased the value of zebrafish for modeling human genetic diseases, studying disease pathogenesis, and drug screening, but ...