We would like to thank Ainara Ruiz de Sabando for providing H&amp;E images. This work was supported by grants from the National Institutes of Health (DK052230, DK093680 and CA172113) awarded to Dr. Vincent W. Yang.

1. Ratos <ol><li> Todos os estudos envolvendo ratos foram aprovados pelo Comitê Animal Care Institucional e Use o Stony Brook University (IACUC). Os ratinhos foram mantidos num ciclo de luz-escuro 12:12 h. <ol><li> Comercialmente obter ratinhos C57BL / 6. Obter camundongos C57BL / 6 com alelos Klf5 flanqueadas por locais loxP (Klf5 f l / f l). Estes ratos foram previamente descritos 21 e graciosamente cedido pelo Dr. Ryozo Nagai. </li></ol></li><li> Comprar camundongos C57BL / 6 portadores do gene induzível recombinase Cre sob regulação do promotor Lgr5 (ratos Lgr5-EGFP / CreERT2). </li><li> Para estabelecer Lgr5-EGFP / creer T2 / Klf5 f l / f l ratos, atravessar Klf5 fl / f l camundongos com ratos / creer T2 Lgr5-EGFP e depois retrocruzamento a prole para Klf5 fl / f l </sup&gt; ratos. </li><li> Camundongos deleite com tamoxifeno como por o protocolo previamente descrito 22. Injectar 8 semanas de idade, os ratinhos de controlo e experimentais por via intraperitoneal (IP) com 1 mg de tamoxifeno (10 mg / mL), dissolvidos em óleo de milho estéril, durante 5 dias consecutivos. </li><li> No dia 14 após a primeira injecção tamoxifeno, sacrificar os ratinhos utilizando asfixia com CO 2, colocando-os em uma câmara ligada ao CO 2 fonte de gás. Permitir que o gás flua para dentro da câmara até que os ratinhos são inconsciente e todo o movimento cessa. Para assegurar a eutanásia executar deslocamento cervical. </li></ol> 2. Preparação de tecidos e Swiss Rolamentos <ol><li> Utilizando fórceps de dissecção e uma tesoura, corte de uma incisão na pele do lado abdominal. Com um par de fórceps, segure a pele na incisão e puxe para fora do tecido do músculo abdominal. Utilizar um par de tesouras para cortar a pele abdominal e expor os músculos abdominais. </li><li> Segurar e puxar para cima o peritoneum com a pinça. Certifique-se de não estar segurando e puxando os intestinos. Cuidadosamente fazer uma incisão no tecido peritoneal e continuar a cortar afastado da pele para expor os músculos abdominais. Cuidadosamente fazer uma incisão nos músculos abdominais e continuar cortando-a para expor os intestinos. </li><li> Identificar os dois pontos e traço para a extremidade distai onde se junta o recto / ânus. Com um par de tesouras, cortar o mais próximo possível da abertura anal quanto possível. </li><li> Identificar o estômago e de rastreio, onde se junta com o intestino delgado. Com uma tesoura, corte libertar o intestino cerca de 1 cm de distância do estômago. Transferir todo o comprimento do intestino delgado e cólon libertado para uma placa de Petri limpa contendo solução salina tamponada com fosfato (PBS). </li><li> Com uma mão ou um par de fórceps, segure a extremidade distai do cólon e utilizar a outra mão para desvendar suavemente todo o comprimento do cólon a partir de qualquer tecido conjuntivo e / ou gordura mesentérica. </li><li> Identificar o ceco(Pequena bolsa entre o intestino delgado e grosso) e cortar onde o ceco e no cólon join (a extremidade proximal do cólon) para libertar no cólon. </li><li> Com uma mão ou um par de fórceps, segurar o intestino delgado e utilizar a outra mão para desvendar suavemente todo o comprimento do intestino delgado a partir de qualquer tecido conjuntivo e / ou gordura mesentérica. Cortar o ceco e descarte se não houver necessidade. Nota: O processo pode ser interrompido aqui por incubação dos intestinos dissecados em fixador de Bouin modificada (50% de etanol / 5% ácido acético em dH 2 O) durante a noite e continuar o procedimento no dia seguinte. </li><li> Manipulação de um segmento do intestino (intestino delgado ou do cólon), encher uma seringa de 10 ml com fixador de Bouin modificado e anexar uma agulha de gavagem a ele. Inserir a agulha cerca de meio centímetro na abertura anterior do segmento intestinal. </li><li> Segurar a agulha de gavagem no interior do segmento intestinal por aplicação de uma pressão firme com um instrumentono segmento intestinal. Com a outra mão segura a seringa, aplique pressão suave, mas consistente para liberar o conteúdo do segmento intestinal usando fixador modificado de Bouin. Este passo permite que a limpeza simultânea do segmento intestinal e fixação imediata. Use uma placa de Petri para recolher os resíduos de fluxo. A fixação pode ser observado pela cor cólon transformando opaco. Nota: Certifique-se de não aplicar muita pressão durante a lavagem ou o segmento intestinal poderia estourar aberto. </li><li> Com uma tesoura, cortar abrir o segmento intestinal longitudinalmente ao longo da linha mesentérica. Segure-o com um par de fórceps e lave-o brevemente em uma placa de Petri contendo PBS. <ol><li> Cortar o intestino delgado em 3 segmentos iguais: proximal, médio e distal. O segmento proximal é a um imediatamente a seguir ao estômago, e o segmento distai é a única imediatamente antes do cólon. O segmento proximal é equivalente para o duodeno, o meio para o jejuno, eo distalo íleo. </li><li> Para cada segmento de marcar as extremidades proximal e a extremidade distal. A extremidade proximal é a que foi inicialmente apontando para o estômago, e distal apontou para o cólon. </li></ol></li><li> Usar a parte superior de uma placa de Petri para colocar o segmento intestinal limpa e aberta. Colocar o segmento intestinal com o lado luminal voltada para cima. <ol><li> Para o cólon, identificar o lado luminal pelos variegations / nervuras correndo através da sua largura e estão presentes na extremidade proximal. As regiões médias e distais têm algumas variegations que correm longitudinalmente. Para o intestino delgado, identificar o lado luminal por a superfície áspera de aparência, que marca as vilosidades. Nota: Para o intestino delgado, não há a demarcação anatómica macroscópica externo proximal, médio e distal. No entanto, estas regiões podem ser podem ser identificados em secções sob o microscópio. As vilosidades são mais longa na região proximal e tornar-se gradualmente mais curto distally onde eles estãoo mais curto em comprimento. Microscopicamente, as criptas do cólon são mais curtos na região proximal que também pode ser identificado pela presença de saliências. As criptas colônicas são o mais alto no meio e mais curto na região distal e ainda mais alto do que na região proximal. </li></ol></li><li> Prossiga com a Swiss rolando o cólon: <ol><li> Manter o cólon plana aberta e puxá-lo com uma pinça a partir da sua extremidade proximal para a extremidade da placa de Petri. </li><li> Mantenha lado luminal voltado para cima e segure a extremidade proximal com a pinça com uma mão e com a outra mão segure um palito. </li><li> Enrole a borda da extremidade proximal em torno do palito usando a pinça e um pouco beliscar a ponta envolto contra o palito para segurá-la no lugar. </li><li> Suave e lentamente começar a rolar o palito com os dedos para rolar os dois pontos em torno do palito para formar um rolo suíço. </li><li> Uma vez que todo o comprimento do cólon tem sido enrolado, use um par de fórceps para deslizar cuidadosamente o cOlon Swiss roll off o palito e em um tecido de processamento / cassete Embedding. Coloque a gaveta em 10% de formalina tamponada durante a noite à temperatura ambiente. </li></ol></li><li> Prossiga com a Swiss rolando o intestino delgado: <ol><li> Manipulação de um segmento de cada vez, manter o segmento plano aberto com o lado luminal para cima e puxe-o com uma pinça de sua extremidade proximal em direção à borda da placa de Petri. </li><li> Continuar com a laminagem do Swiss tal como descrito para o cólon. </li></ol></li><li> Prosseguir com o processamento de tecidos fixados em formalina para inclusão em parafina. Proceda da seguinte forma: NOTA: Use um processador automatizado (ver Materiais e equipamentos para obter detalhes). <ol><li> Enquanto o tecido está na cassete, lavar o tecido com PBS até fixador é completamente removido. </li><li> Desidratar o tecido utilizando etanol na sequência seguinte: 50% de etanol durante 10 min, 70% de etanol durante 10 min, 80% de etanol durante 10 min, 95% de etanol durante 10 min, 100% de etanol durante 10 min, 100% de etanol durante 10 min , e 100% de etanol durante 10 min. </li><li> etanol Exchange com xileno na seguinte sequência: 2: 1 de etanol: xileno durante 10 - 15 min, 1: 1 de etanol: xileno durante 10 - 15 min, 1: 2 de etanol: xileno durante 10 - 15 min, 100% de xileno para 10 - 15 min, 100% de xileno durante 10 - 15 min, e 100% de xileno durante 10 - 15 min. CUIDADO: O xileno é um perigo para a saúde, assim, o local de trabalho deve ser equipado com uma ventilação de exaustão local com um capuz adequada e o equipamento de protecção adequado deve ser usava por pessoal. </li><li> xileno intercâmbio com parafina. Executar os seguintes passos num forno de vácuo regulado para 54-58 ° C: 2: 1 xileno: parafina, durante 30 min, 1: 1 xileno: parafina, durante 30 min, 1: 2 xileno: parafina, durante 30 min, 100% de parafina para 1 - 2 horas, e% de parafina 100 para 1 - 2 horas ou durante a noite. Nota: Não deixe que a parafina superior a 60 ° C por períodos prolongados de tempo, porque isso irá degradar os polímeros de parafina e torná-lo duro e quebradiço. </li><li> Incorporar no novo tecido parafina e oriental fresco como dedesejado antes da parafina endurece. Para os rolos suíços, seguindo parafinização tecido, é importante para reposicionar cada rolo no seu lado durante a inclusão em parafina. Isso garante que, durante o corte, vão ser produzidas secções de todo o comprimento de cada rolo. </li></ol></li><li> Para a coloração, corte 5 mm de espessura usando micrótomo. Recolher as secções em lâminas carregadas e secá-las (bake) em um 65 ° C forno durante a noite; deixe esfriar à temperatura ambiente e subsequentemente utilizado para a coloração. Nota: O tempo de cozedura pode ser reduzido para 1 - 2 horas dependendo de como acabada de cortar as lâminas são. Se menos de um mês desde o corte, então é aconselhável para assar durante a noite. Se ele tem sido mais de um mês, em seguida, 1-2 hr de bicarbonato é suficiente para poupar tempo. Se correndo contra o tempo, o apoio durante a noite pode ser sempre utilizado. </li></ol> 3. Análise histológica e por imunofluorescência Coloração Realizar a análise histológica e immunofluorescence coloração como descrito anteriormente 23,24, com modificações. Para reforçada proteína verde fluorescente (EGFP) imunofluorescência: <ol><li> Coza os diapositivos num forno de 65 ° C durante 1 hora, para inactivar a actividade de fosfatase alcalina endógena e subsequentemente Desparafinar em xileno. </li><li> Incubar secções em um banho de 3% de peróxido de hidrogénio em metanol para bloquear peroxidases endógenas de tecido; em seguida, re-hidratados por incubação em série decrescente banho de álcool (100%, 95%, 70%), seguido por recuperação de antigénios em solução tampão de citrato (10 mM de citrato de sódio, 0,05% de Tween-20, pH 6,0) a 125 ° C durante 10 min usando uma câmara decloaking. </li><li> Desenhar um círculo em torno de secções de tecido utilizando pena de marcação que proporciona uma barreira hidrofóbica e incubar secções com um tampão de bloqueio (2,5% de albumina de soro bovino [BSA] em TBS-Tween) durante 30 min a 37 ° C e, em seguida, com o anticorpo primário contra EGFP (diluição 1 : 500) a 4 ° C durante a noite numa câmara humidificada, agitando suavemente.</li><li> Lave os cortes e incubar com o anticorpo secundário fluorescente marcada com a concentração apropriada, durante 30 min a 37 ° C. </li><li> Lavagem das lâminas após tratamento com o anticorpo e mancha núcleos secundários com Hoechst e montar com meios de montagem. <ol><li> Para Klf5 / EGFP / Ki-67 co-coloração, as lâminas de processo como descrito nas etapas 3.1 - 3.3 e realização da coloração Klf5 por incubação com anticorpo Klf5 (diluição 1: 150) durante a noite. </li><li> Aplicar detecção de polímero AP coelho para slides como por protocolo. </li><li> Revelar KLF4 coloração com coloração imuno-histoquímica cromógeno, conforme o protocolo do fabricante. </li><li> Realizar a eluição do anticorpo utilizando o protocolo previamente descrito 25. Incubar as lâminas a 50 ° C em glicina-SDS (pH 2,0) solução com agitação durante 1 h. </li><li> Lave as lâminas cuidadosamente com água destilada e incubar com um tampão de bloqueio (2,5% de BSA em TBS-Tween) durante 30 min a 37 ° C. </li><li> Adicionar o Ki-67 (diluição 1: 500) e a EGFP (diluição 1:500) Anticorpos simultaneamente e incubar a 37 ° C durante 1 h. </li><li> Realizar a detecção fluorescente com anticorpos secundários apropriados antes da coloração com Hoechst (dados não mostrados) e de montagem com meio de montagem. </li></ol></li><li> Observar a morfologia histológica dos tecidos na coloração seções 5 mícrons com hematoxilina e eosina (H &amp; E) 26. Para imagens fluorescentes, usar comprimentos de onda de emissão de 535, 646 e 700 para visualizar EGFP, Klf5 e Ki-67 coloração, respectivamente. </li></ol>

<ol>
	<li>van der Flier, L. G., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells,+self-renewal,+and+differentiation+in+the+intestinal+epithelium.">Stem cells, self-renewal, and differentiation in the intestinal epithelium.</a> Annu Rev Physiol. 71, 241-260 (2009).</li><li>Bjerknes, M., Cheng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+the+isolation+of+intact+epithelium+from+the+mouse+intestine.">Methods for the isolation of intact epithelium from the mouse intestine.</a> Anat Rec. 199, 565-574 (1981).</li><li>Barker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+stem+cells+in+small+intestine+and+colon+by+marker+gene+Lgr5.">Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5.</a> Nature. 449 (7165), 1003-1007 (2007).</li><li>van der Flier, L. G., Haegebarth, A., Stange, D. E., van de Wetering, M., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OLFM4+is+a+robust+marker+for+stem+cells+in+human+intestine+and+marks+a+subset+of+colorectal+cancer+cells.">OLFM4 is a robust marker for stem cells in human intestine and marks a subset of colorectal cancer cells.</a> Gastroenterology. 137 (1), 15-17 (2009).</li><li>van der Flier, L. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factor+achaete+scute-like+2+controls+intestinal+stem+cell+fate.">Transcription factor achaete scute-like 2 controls intestinal stem cell fate.</a> Cell. 136 (5), 903-912 (2009).</li><li>Sangiorgi, E., Capecchi, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bmi1+is+expressed+in+vivo+in+intestinal+stem+cells.">Bmi1 is expressed in vivo in intestinal stem cells.</a> Nat Genet. 40 (7), 915-920 (2008).</li><li>Montgomery, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+telomerase+reverse+transcriptase+(mTert)+expression+marks+slowly+cycling+intestinal+stem+cells.">Mouse telomerase reverse transcriptase (mTert) expression marks slowly cycling intestinal stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (1), 179-184 (2011).</li><li>Takeda, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interconversion+between+intestinal+stem+cell+populations+in+distinct+niches.">Interconversion between intestinal stem cell populations in distinct niches.</a> Science. 334 (6061), 1420-1424 (2011).</li><li>May, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+novel+putative+gastrointestinal+stem+cell+and+adenoma+stem+cell+marker,+doublecortin+and+CaM+kinase-like-1,+following+radiation+injury+and+in+adenomatous+polyposis+coli/multiple+intestinal+neoplasia+mice.">Identification of a novel putative gastrointestinal stem cell and adenoma stem cell marker, doublecortin and CaM kinase-like-1, following radiation injury and in adenomatous polyposis coli/multiple intestinal neoplasia mice.</a> Stem Cells. 26 (3), 630-637 (2008).</li><li>Powell, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pan-ErbB+negative+regulator+Lrig1+is+an+intestinal+stem+cell+marker+that+functions+as+a+tumor+suppressor.">The pan-ErbB negative regulator Lrig1 is an intestinal stem cell marker that functions as a tumor suppressor.</a> Cell. 149 (1), 146-158 (2012).</li><li>Pearson, R., Fleetwood, J., Eaton, S., Crossley, M., Bao, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kruppel-like+transcription+factors:+a+functional+family.">Kruppel-like transcription factors: a functional family.</a> Int J Biochem Cell Biol. 40 (10), 1996-2001 (2008).</li><li>McConnell, B. B., Yang, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+Kruppel-like+factors+in+health+and+diseases.">Mammalian Kruppel-like factors in health and diseases.</a> Physiol Rev. 90 (4), 1337-1381 (2010).</li><li>McConnell, B. B., Ghaleb, A. M., Nandan, M. O., Yang, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+diverse+functions+of+Kruppel-like+factors+4+and+5+in+epithelial+biology+and+pathobiology.">The diverse functions of Kruppel-like factors 4 and 5 in epithelial biology and pathobiology.</a> Bioessays. 29 (6), 549-557 (2007).</li><li>Nandan, M. O., Ghaleb, A. M., Bialkowska, A. B., Yang, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kruppel-like+factor+5+is+essential+for+proliferation+and+survival+of+mouse+intestinal+epithelial+stem+cells.">Kruppel-like factor 5 is essential for proliferation and survival of mouse intestinal epithelial stem cells.</a> Stem Cell Res. 14 (1), 10-19 (2015).</li><li>Gelberg, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+anatomy,+physiology,+and+mechanisms+of+disease+production+of+the+esophagus,+stomach,+and+small+intestine.">Comparative anatomy, physiology, and mechanisms of disease production of the esophagus, stomach, and small intestine.</a> Toxicol Pathol. 42 (1), 54-66 (2014).</li><li>De Robertis, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+AOM/DSS+murine+model+for+the+study+of+colon+carcinogenesis:+From+pathways+to+diagnosis+and+therapy+studies.">The AOM/DSS murine model for the study of colon carcinogenesis: From pathways to diagnosis and therapy studies.</a> J Carcinog. 10 (9), (2011).</li><li>Magnus, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observations+on+the+presence+of+intestinal+epithelium+in+the+gastric+mucosa.">Observations on the presence of intestinal epithelium in the gastric mucosa.</a> The Journal of Pathology and Bacteriology. 44 (2), 389-398 (1937).</li><li>Moolenbeek, C., Ruitenberg, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+"Swiss+roll":+a+simple+technique+for+histological+studies+of+the+rodent+intestine.">The "Swiss roll": a simple technique for histological studies of the rodent intestine.</a> Lab Anim. 15 (1), 57-59 (1981).</li><li>Park, C. M., Reid, P. E., Walker, D. C., MacPherson, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple,+practical+'swiss+roll'+method+of+preparing+tissues+for+paraffin+or+methacrylate+embedding.">A simple, practical 'swiss roll' method of preparing tissues for paraffin or methacrylate embedding.</a> J Microsc. 145, 115-120 (1987).</li><li>Summersgill, B., Clark, J., Shipley, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+and+chromogenic+in+situ+hybridization+to+detect+genetic+aberrations+in+formalin-fixed+paraffin+embedded+material,+including+tissue+microarrays.">Fluorescence and chromogenic in situ hybridization to detect genetic aberrations in formalin-fixed paraffin embedded material, including tissue microarrays.</a> Nat Protoc. 3 (2), 220-234 (2008).</li><li>Takeda, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+fibroblasts+are+essential+for+the+adaptive+response+of+the+murine+heart+to+pressure+overload.">Cardiac fibroblasts are essential for the adaptive response of the murine heart to pressure overload.</a> J Clin Invest. 120 (1), 254-265 (2010).</li><li>el Marjou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+and+inducible+Cre-mediated+recombination+in+the+gut+epithelium.">Tissue-specific and inducible Cre-mediated recombination in the gut epithelium.</a> Genesis. 39 (3), 186-193 (2004).</li><li>McConnell, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kruppel-like+factor+5+is+important+for+maintenance+of+crypt+architecture+and+barrier+function+in+mouse+intestine.">Kruppel-like factor 5 is important for maintenance of crypt architecture and barrier function in mouse intestine.</a> Gastroenterology. 141 (4), 1302-1313 (2011).</li><li>Nandan, M. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kruppel-like+factor+5+is+a+crucial+mediator+of+intestinal+tumorigenesis+in+mice+harboring+combined+ApcMin+and+KRASV12+mutations.">Kruppel-like factor 5 is a crucial mediator of intestinal tumorigenesis in mice harboring combined ApcMin and KRASV12 mutations.</a> Mol Cancer. 9 (63), (2010).</li><li>Pirici, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+elution+method+for+multiple+immunohistochemistry+on+primary+antibodies+raised+in+the+same+species+and+of+the+same+subtype.">Antibody elution method for multiple immunohistochemistry on primary antibodies raised in the same species and of the same subtype.</a> J Histochem Cytochem. 57 (6), 567-575 (2009).</li><li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematoxylin+and+eosin+staining+of+tissue+and+cell+sections.">Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections.</a> CSH Protoc. 2008, (2008).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

A técnica de laminação Swiss é um método poderoso para a preparação de tecido intestinal para avaliação histológica e morfológica em grande escala. Em contraste com a técnica Swiss-laminagem anteriormente descrita, que foi originalmente desenvolvido para preparação de secções congeladas 18,19, o processo aqui apresentado permite a preparação do tecido intestinal rápida e a fixação para a fixação de formalina e embebidos em parafina (FFPE). Em comparação com tecido congelado, o tecido ...

O epitélio intestinal de mamífero compreende uma única camada de células colunares. No intestino delgado, as células proliferativas são confinados às criptas enquanto que as células diferenciadas ocupar a região da vilosidade. No entanto, porque não há nenhum vilosidades no intestino grosso, as células proliferativas são localizadas na parte inferior das criptas e células diferenciadas ocupar a região superior das criptas. O epitélio intestinal sofre reposição rápida (cerca de 3-5 dias) que é accionado por divisão contínua das células proliferativas nas criptas. As células proliferativas das criptas não são uma população homogénea e são ainda subdivididas em células estaminais e células-amplificação de trânsito (TA) 1. As células estaminais reside na parte inferior da cripta, dentro das primeiras 4 - 5 células a partir da parte inferior 2. O modelo atual suporta a existência de dois tipos de células-tronco: as células-tronco da cripta colunar base (CBC) e de reserva de células estaminais quiescentes. A CBC scélulas dez estão se proliferando de forma activa e são marcados por rica em leucina contendo repetição G-proteína receptor acoplado 5 (Lgr5) 3, Olfactomedin 4 (Olfm4) 4 e Achaete scute-like 2 (Ascl2) 5. Por outro lado, as células estaminais quiescentes de reserva são rotulados por Moloney site B específico da célula vírus da leucemia murina de integração 1 (Bmi1) 6, a telomerase rato transcriptase reversa (mTert) 7, HOP homeobox (Hopx) 8, duplacortina-like e CAM Kinase -como 1 (Dclk1) 9, e leucina-ricos repete e do tipo imunoglobulina domínios 1 (Lrig1) 10. As células estaminais que proliferam activamente dar origem a células TA, em seguida, submetido a posterior diferenciação em células absortivas (enterócitos) e células secretoras (enteroendócrinas, caliciformes, células de Paneth e flocos). divisão celular contínua na zona proliferativa resulta em movimento ascendente de células epiteliais ao longo do eixo de cripta-vilosidade até atingirem a parte superior da vilosidade, onde eles sofrem apoptose e sãodescartadas a partir da superfície do epitélio. Os diferentes tipos de células epiteliais intestinais estão marcados pela expressão de proteínas diferentes (por exemplo, células caliciformes intestinais podem ser reconhecidos através de coloração com anticorpo contra células de Paneth MUC2 e com anticorpo contra lisozima). Nós estudar o papel de factores como Krüppel-(KLFs) na homeostase e patobiologia do epitélio intestinal 11-13. Os resultados aqui apresentados apoiar a viabilidade de uma técnica de laminagem Swiss modificado baseiam-se em estudos anteriores sobre o papel do factor-Krüppel como 5 (KLF5) na manutenção das proliferam activamente células estaminais epiteliais intestinais 14. KLF5 é um factor de transcrição dedo de zinco que é altamente expresso na haste intestinal activa e 12 alvéolos Ta. Estudos anteriores demonstraram que KLF5 é co-expressa com Ki-67, um marcador conhecido proliferativa nas criptas intestinais. O tr gastrointestinal<html> ato não é um tecido estruturalmente ou funcionalmente homogénea. O intestino delgado é dividido em duodeno, jejuno e íleo e o intestino grosso no ceco e no cólon, com esta última ainda divididas em segmentos proximal, médio e distal. Cada uma destas secções tem características histológicas únicas e desempenha papéis distintos 15. Como tal, os efeitos de insultos e o grau de resposta do epitélio intestinal pode depender da região de tecido estudado 16. Além disso, várias estirpes de ratos demonstrar a diversidade da resposta ao nível histológico com base no tipo de insulto utilizado nos estudos 16. Assim, condizente com a preparação do tecido é necessário para permitir histológico apropriado e análise molecular dos tecidos intestinais. Como tal, a-rolo suíço análise bolsas técnica de todo o comprimento do epitélio intestinal de uma só vez e, assim, verifica conclusões bem informadas com base numa informação global. e_content &quot;&gt; A técnica Swiss-rolo foi mencionado pela primeira vez por Magnus 17, e descrito em detalhe por Moolenbeck e Ruitenberg e Park et al., como um método para a preparação de tecidos e realizando análises histológicas do intestino roedor 18,19, respectivamente. O protocolo delineada na presente publicação apresenta uma versão melhorada do método original que permite a preparação do tecido oportuna e confiável para fins de diagnóstico. esta técnica modificada permite coleções e preparação do epitélio intestinal de técnicas universalmente utilizados, tais como imuno-histoquímica, imunofluorescência, bem eficientes como hibridação in situ (fluorescente e cromogénico 20). Além disso, o tecido modificado espécime método de preparação utiliza reagentes facilmente disponíveis e relativamente pouco dispendiosos, enquanto que oferecem um método de fixação rápida dos tecidos e permite a recuperação de proteína, ADN e ARN para a avaliação adicional. Tomados juntos, this técnica é excelente para avaliação abrangente dos aspectos histopatológicos, patológicas e moleculares do epitélio intestinal.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1016">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Stainless Steel Dissecting Kits</td>
			<td style="width:179px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">25640-002</td>
			<td style="width:403px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Decloaking Chamber</td>
			<td style="width:179px;">Biocare Medical</td>
			<td>DC2012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Syringe 10ml</td>
			<td style="width:179px;">VWR</td>
			<td>89215-218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:316px;">Swingsette Tissue embedding/processing cassette with lid</td>
			<td style="width:179px;">Simport</td>
			<td>M515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Superfrost Plus Slides [size: 25x75x1mm]</td>
			<td style="width:179px;">VWR</td>
			<td>48311-703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Manual Slide Staining Set</td>
			<td style="width:179px;">Tissue-Tek/Sakura</td>
			<td>4451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Staining Dish Green</td>
			<td style="width:179px;">Tissue-Tek/Sakura</td>
			<td>4456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Staining Dish White</td>
			<td style="width:179px;">Tissue-Tek/Sakura</td>
			<td>4457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">24-Slide Slide Holder with Detachable Handle</td>
			<td style="width:179px;">Tissue-Tek/Sakura</td>
			<td>4465</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Oven</td>
			<td style="width:179px;">Thermo Scientific</td>
			<td>6243</td>
			<td>for baking slides at 65 degree</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Dissection microscope</td>
			<td style="width:179px;">Zeiss</td>
			<td>Stemi 2000C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluorescence Microscope</td>
			<td style="width:179px;">Nikon</td>
			<td>Eclipse 90i</td>
			<td>Bright and fluoerescent light, with objectives: 10x, 20x</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">PAP Pen Super-Liquid Blocker Mini</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td>DAI-PAP-S-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Ethanol 200 proof</td>
			<td style="width:179px;">AAPR</td>
			<td>111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Methanol</td>
			<td style="width:179px;">VWR</td>
			<td>BDH1135-4LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Glacial acetic acid</td>
			<td style="width:179px;">AAPR</td>
			<td>281000ACS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Xylene</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td>X5P-1GAL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Hydrogen peroxide 25% solution in water</td>
			<td style="width:179px;">ACROS</td>
			<td>202465000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">10% bufered formalin</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td>22-026-213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Bovine serum fraction V, heat shock</td>
			<td style="width:179px;">Roche</td>
			<td>3116956001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Tween 20</td>
			<td style="width:179px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>P7949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Sodium citrate</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Gavage needle</td>
			<td style="width:179px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">20068-624</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Rabbit anti Klf5 antibody</td>
			<td style="width:179px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:119px;">sc-22797</td>
			<td>Dilution 1: 150</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Chicken anti EGFP antibody</td>
			<td style="width:179px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">AB16901</td>
			<td>Dilution 1: 500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Rabbit anti Ki67 antibody</td>
			<td style="width:179px;">Biocare Medical</td>
			<td style="width:119px;">CRM325B</td>
			<td>Dilution 1: 500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Mach3 rabbit AP polymer detection kit</td>
			<td style="width:179px;">Biocare Medical</td>
			<td style="width:119px;">M3R533L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Warp red chromogen kit</td>
			<td style="width:179px;">Biocare Medical</td>
			<td style="width:119px;">WR806 H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Lgr5-EGFP/CreERT2 mice&#160;</td>
			<td>Jackson labs</td>
			<td>008875&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Automated processor</td>
			<td style="width:179px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;">Leica TP1020</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

improved swiss-rolling technique for intestinal tissue preparation for immunohistochemical and immunofluorescent analyses

Understanding the role of factors that regulate intestinal epithelial homeostasis and response to injury and regeneration is important. The current literature describes several different methodological approaches to obtain images of intestinal tissues for data validation. In this paper, we delineate a common protocol relating to the derivation and processing of mouse intestinal tissues. Proper fixation of intestinal tissues and Swiss-roll techniques that enhance intestinal epithelial morphology are discussed. Postresection processing and reorientation of embedded intestinal tissues are critical in obtaining paraffin-embedded blocks that display intact intestinal structural features after sectioning. The Swiss-rolling technique helps in histological assessment of the complete intestinal or colonic sections examined. An ability to differentiate intestinal structural features can be vital in quantitative measurements of intestinal inflammation and tumorigenesis along the entire length. Finally, paraffin-embedded sections are ideal for robust processing using both immunohistochemical and immunofluorescent detection methods. Nonfluorescent immunohistochemical sections provide a vibrant image of the tissue detailing different cellular structural features but do not provide flexibility for intracellular co-localization experiments. Multiple fluorescent channels can be appropriately utilized with immunofluorescent detection for co-localization experiments, lending support to mechanistic studies.

A técnica de rolamento suíça em combinação com coloração imuno-histoquímica permite a análise abrangente do tecido intestinal pequeno ou grande. O exemplo de coloração de H &amp; E de um intestino grosso de um C57BL / 6 de ratinho (Figura 1) é uma ilustração da exequibilidade e a eficácia desta técnica. Como mostrado na Figura 1, a imagem é capaz de capturar todas as porções do cólon: proximal, médio e distal. Assim,...

Watch this Scientific Journal Video about Improved Swiss-rolling Technique for Intestinal Tissue Preparation for Immunohistochemical and Immunofluorescent Analyses at JoVE.com

Improved Swiss-rolling Technique for Intestinal Tissue Preparation for Immunohistochemical and Immunofluorescent Analyses

A identificação precisa e localização de células epiteliais ao longo da mucosa intestinal são essenciais para definir diferentes linhagens celulares. imagiologia adequado dos tecidos intestinais é crucial para a identificação de padrões de expressão de proteínas com uma resolução máxima. Este estudo visa delinear os métodos ótimos e as condições de processamento do mouse tecidos intestinais.

Técnica Swiss-rolamento melhorado para preparo intestinal tecido por imuno-histoquímica e análises de imunofluorescência

Understanding the role of factors that regulate intestinal epithelial homeostasis and response to injury and regeneration is important. The current ...

improved-swiss-rolling-technique-for-intestinal-tissue-preparation

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

68.1K visualizações.  Stony Brook University School of Medicine.  A identificação precisa e localização de células epiteliais ao longo da mucosa intestinal são essenciais para definir diferentes linhagens celulares. imagiologia adequado dos tecidos intestinais é crucial para a identificação de padrões de expressão de proteínas com uma resolução máxima. Este estudo visa delinear os métodos ótimos e as condições de processamento do mouse tecidos intestinais. 

Vídeo: Improved Swiss-rolling Technique for Intestinal Tissue Preparation for Immunohistochemical and Immunofluorescent Analyses

Pressure-polishing Pipettes for Improved Patch-clamp Recording

Pressure-polishing is a method for shaping glass pipettes for patch-clamp recording. We first developed this method for fabricating pipettes suitable for recording from small (&lt;3 m) neuronal cell bodies. The basic principal is similar to glass-blowing and combines air pressure and heat to modify the shape of patch pipettes prepared by a conventional micropipette puller. It can be applied to so-called soft (soda lime) and hard (borosilicate) glasses. Generally speaking, pressure polishing can reduce pipette resistance by 25% without decreasing the diameter of the tip opening (Goodman and Lockery, 2000). It can be applied to virtually any type of glass and requires only the addition of a high-pressure valve and fitting to a microforge. This technique is essential for recording from ultrasmall cells (&lt;5 m) and can also improve single-channel recording by minimizing pipette resistance. The blunt shape is also useful for perforated-patch clamp recording since this tip shape results in a larger membrane bleb available for perforation.

This is a guide to modifying the shape of glass micropipettes. Specifically, by using heat and air pressure the taper is widened without increasing the tip opening, leading to lower pipette resistance. This is critical to obtain low noise recordings of small cells but is useful in many applications.

Pressão polimento Pipetas para Gravação de patch-clamp melhorada

Pressure-polishing is a method for shaping glass pipettes for patch-clamp recording.  We first developed this method for fabricating pipettes suitable for ...

Biologia

Immunofluorescent Detection of Two Thymidine Analogues (CldU and IdU) in Primary Tissue

Accurate measurement of cell division is a fundamental challenge in experimental biology that becomes increasingly complex when slowly dividing cells are analyzed. Established methods to detect cell division include direct visualization by continuous microscopy in cell culture, dilution of vital dyes such as carboxy&#64258;uorescein di-aetate succinimidyl ester (CFSE), immuno-detection of mitogenic antigens such as ki67 or PCNA, and thymidine analogues. Thymidine analogues can be detected by a variety of methods including radio-detection for tritiated thymidine, immuno-detection for bromo-deoxyuridine (BrdU), chloro-deoxyuridine (CldU) and iodo-deoxyuridine (IdU), and chemical detection for ethinyl-deoxyuridine (EdU). We have derived a strategy to detect sequential incorporation of different thymidine analogues (CldU and IdU) into tissues of adult mice. Our method allows investigators to accurately quantify two successive rounds of cell division. By optimizing immunostaining protocols our approach can detect very low dose thymidine analogues administered via the drinking water, safe to administer to mice for prolonged periods of time. Consequently, our technique can be used to detect cell turnover in very long-lived tissues. Optimal immunofluoresent staining results can be achieved in multiple tissue types, including pancreas, skin, gut, liver, adrenal, testis, ovary, thyroid, lymph node, and brain. We have also applied this technique to identify oncogenic transformation within tissues. We have further applied this technique to determine if transit-amplifying cells contribute to growth or renewal of tissues. In this sense, sequential administration of thymidine analogues represents a novel approach for studying the origins and survival of cells involved in tissue homeostasis.

Immunofluorescent Detection of Two Thymidine Analogues CldU and IdU in Primary Tissue

We have derived a strategy to detect sequential incorporation of thymidine analogues (CldU and IdU) into tissues of adult mice to quantify two successive rounds of cell division. This strategy is useful to detect cell turnover of long-lived tissues, oncogenic transformation, or transit-amplifying cells.

Detecção de imunofluorescência de dois análogos da timidina (CldU e UDI), em tecido primário

Accurate measurement of cell division is a fundamental challenge in experimental biology that becomes increasingly complex when slowly dividing cells are ...

Evisceration of Mouse Vitreous and Retina for Proteomic Analyses

While the mouse retina has emerged as an important genetic model for inherited retinal disease, the mouse vitreous remains to be explored. The vitreous is a highly aqueous extracellular matrix overlying the retina where intraocular as well as extraocular proteins accumulate during disease.1-3 Abnormal interactions between vitreous and retina underlie several diseases such as retinal detachment, proliferative diabetic retinopathy, uveitis, and proliferative vitreoretinopathy.1,4 The relative mouse vitreous volume is significantly smaller than the human vitreous (Figure 1), since the mouse lens occupies nearly 75% of its eye.5 This has made biochemical studies of mouse vitreous challenging. In this video article, we present a technique to dissect and isolate the mouse vitreous from the retina, which will allow use of transgenic mouse models to more clearly define the role of this extracellular matrix in the development of vitreoretinal diseases.

The dissection technique illustrates evisceration of the vitreous, retina, and lens from the mouse eye, separation by centrifugation, and characterization with protein assays.

Evisceração de Vítreo Mouse e Retina de Análises Proteômica

While the mouse retina has emerged as an important genetic model for inherited retinal disease, the mouse vitreous remains to be explored. The vitreous is ...

Simple and Efficient Technique for the Preparation of Testicular Cell Suspensions

Mammalian testes are very complex organs that contain over 30 different cell types, including somatic testicular cells and different stages of germline cells. This heterogeneity is an important drawback concerning the study of the bases of mammalian spermatogenesis, as pure or enriched cell populations in certain stages of sperm development are needed for most molecular analyses1.
 Various strategies such as Staput2,3, centrifugal elutriation1, and flow cytometry (FC)4,5 have been employed to obtain enriched or purified testicular cell populations in order to enable differential gene expression studies. 
It is required that cells are in suspension for most enrichment/ purification approaches. Ideally, the cell suspension will be representative of the original tissue, have a high proportion of viable cells and few multinucleates - which tend to form because of the syncytial nature of the seminiferous epithelium6,7 - and lack cell clumps1 . Previous reports had evidenced that testicular cell suspensions prepared by an exclusively mechanical method clumped more easily than trypsinized ones1 . On the other hand, enzymatic treatments with RNAses and/or disaggregating enzymes like trypsin and collagenase lead to specific macromolecules degradation, which is undesirable for certain downstream applications. The ideal process should be as short as possible and involve minimal manipulation, so as to achieve a good preservation of macromolecules of interest such as mRNAs. Current protocols for the preparation of cell suspensions from solid tissues are usually time-consuming, highly operator-dependent, and may selectively damage certain cell types1,8 . 
	The protocol presented here combines the advantages of a highly reproducible and extremely brief mechanical disaggregation with the absence of enzymatic treatment, leading to good quality cell suspensions that can be used for flow cytometric analysis and sorting4, and ulterior gene expression studies9 .

A novel protocol for the mechanical preparation of testicular cell suspensions from rodent material, avoiding enzymes and detergents, is described. The method is very simple, fast, reproducible, and renders good quality cell suspensions, which are suitable for flow sorting and RNA extraction.

Técnica simples e eficiente para a preparação de suspensões de células testiculares

Mammalian testes are very complex organs that contain over 30 different cell types, including somatic testicular cells and different stages of germline ...

Trajectory Data Analyses for Pedestrian Space-time Activity Study

It is well recognized that human movement in the spatial and temporal dimensions has direct influence on disease transmission1-3. An infectious disease typically spreads via contact between infected and susceptible individuals in their overlapped activity spaces. Therefore, daily mobility-activity information can be used as an indicator to measure exposures to risk factors of infection. However, a major difficulty and thus the reason for paucity of studies of infectious disease transmission at the micro scale arise from the lack of detailed individual mobility data. Previously in transportation and tourism research detailed space-time activity data often relied on the time-space diary technique, which requires subjects to actively record their activities in time and space. This is highly demanding for the participants and collaboration from the participants greatly affects the quality of data4.
Modern technologies such as GPS and mobile communications have made possible the automatic collection of trajectory data. The data collected, however, is not ideal for modeling human space-time activities, limited by the accuracies of existing devices. There is also no readily available tool for efficient processing of the data for human behavior study. We present here a suite of methods and an integrated ArcGIS desktop-based visual interface for the pre-processing and spatiotemporal analyses of trajectory data. We provide examples of how such processing may be used to model human space-time activities, especially with error-rich pedestrian trajectory data, that could be useful in public health studies such as infectious disease transmission modeling.
The procedure presented includes pre-processing, trajectory segmentation, activity space characterization, density estimation and visualization, and a few other exploratory analysis methods. Pre-processing is the cleaning of noisy raw trajectory data. We introduce an interactive visual pre-processing interface as well as an automatic module. Trajectory segmentation5 involves the identification of indoor and outdoor parts from pre-processed space-time tracks. Again, both interactive visual segmentation and automatic segmentation are supported. Segmented space-time tracks are then analyzed to derive characteristics of one's activity space such as activity radius etc. Density estimation and visualization are used to examine large amount of trajectory data to model hot spots and interactions. We demonstrate both density surface mapping6 and density volume rendering7. We also include a couple of other exploratory data analyses (EDA) and visualizations tools, such as Google Earth animation support and connection analysis. The suite of analytical as well as visual methods presented in this paper may be applied to any trajectory data for space-time activity studies.

A suite of spatiotemporal processing methods are presented to analyze human trajectory data, such as that collected using a GPS device, for the purpose of modeling pedestrian space-time activities.

Trajetória Análise de Dados para Estudo de Atividade pedonal espaço-tempo

It is well recognized that human movement in the  spatial and temporal dimensions has direct influence on disease transmission1-3.  An infectious disease ...

An Immunofluorescent Method for Characterization of Barrett&#8217;s Esophagus Cells

Esophageal adenocarcinoma (EAC) has an overall survival rate of less than 17% and incidence of EAC has risen dramatically over the past two decades. One of the primary risk factors of EAC is Barrett&#8217;s esophagus (BE), a metaplastic change of the normal squamous esophagus in response to chronic heartburn. Despite the well-established connection between EAC and BE, interrogation of the molecular events, particularly altered signaling pathways involving progression of BE to EAC, are poorly understood. Much of this is due to the lack of suitable in vitro models available to study these diseases. Recently, immortalized BE cell lines have become commercially available allowing for in vitro studies of BE. Here, we present a method for immunofluorescent staining of immortalized BE cell lines, allowing in vitro characterization of cell signaling and structure after exposure to therapeutic compounds. Application of these techniques will help develop insight into the mechanisms involved in BE to EAC progression and provide potential avenues for treatment and prevention of EAC.

There is a discernible need for improved information on molecular drivers of Barrett&#8217;s Esophagus. Immunofluorescent staining is a useful technique for understanding the effects of cell signaling on cell morphology. We present a simple, effective protocol for the use of immunofluorescent staining to assess therapeutic treatment in Barrett&#8217;s Esophagus cells.

O método de imunofluorescência para Caracterização de Células Esôfago de Barrett

Esophageal adenocarcinoma (EAC) has an overall survival rate of less than 17% and incidence of EAC has risen dramatically over the past two decades. One ...

A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth factors. Since organoids are highly similar to the original tissue in terms of homeostatic stem cell differentiation, cell polarity and presence of all terminally differentiated cell types known to the adult intestinal epithelium, they serve as an essential resource in experimental research on the epithelium. The possibility to express transgenes or interfering RNA using lentiviral or retroviral vectors in organoids has increased opportunities for functional analysis of the intestinal epithelium and intestinal stem cells, surpassing traditional mouse transgenics in speed and cost. In the current video protocol we show how to utilize transduction of small intestinal organoids with lentiviral vectors illustrated by use of doxycylin inducible transgenes, or IPTG inducible short hairpin RNA for overexpression or gene knockdown. Furthermore, considering organoid culture yields minute cell counts that may even be reduced by experimental treatment, we explain how to process organoids for downstream analysis aimed at quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry. Techniques that enable transgene expression and gene knock down in intestinal organoids contribute to the research potential that these intestinal epithelial structures hold, establishing organoid culture as a new standard in cell culture.

In this video protocol we give a step by step explanation of lentiviral transduction in organoids of primary intestinal epithelium and of processing and downstream analysis of these cultures by quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry.

Um Protocolo de Transdução Lentivirus e Análise de Downstream da Intestinal Organóides

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth ...

Preparation of Formalin-fixed Paraffin-embedded Tissue Cores for both RNA and DNA Extraction

Formalin-fixed paraffin embedded tissue (FFPET) represents a valuable, well-annotated substrate for molecular investigations. The utility of FFPET in molecular analysis is complicated both by heterogeneous tissue composition and low yields when extracting nucleic acids. A literature search revealed a paucity of protocols addressing these issues, and none that showed a validated method for simultaneous extraction of RNA and DNA from regions of interest in FFPET. This method addresses both issues. Tissue specificity was achieved by mapping cancer areas of interest on microscope slides and transferring annotations onto FFPET blocks. Tissue cores were harvested from areas of interest using 0.6 mm microarray punches. Nucleic acid extraction was performed using a commercial FFPET extraction system, with modifications to homogenization, deparaffinization, and Proteinase K digestion steps to improve tissue digestion and increase nucleic acid yields. The modified protocol yields sufficient quantity and quality of nucleic acids for use in a number of downstream analyses, including a multi-analyte gene expression platform, as well as reverse transcriptase coupled real time PCR analysis of mRNA expression, and methylation-specific PCR (MSP) analysis of DNA methylation.

This modified extraction protocol improves RNA and DNA yields from more precisely targeted regions of interest in histopathologic tissue blocks.

Preparação de Núcleos de tecido parafina-encaixados formalina-fixados para RNA e DNA Extraction

Formalin-fixed paraffin embedded tissue (FFPET) represents a valuable, well-annotated substrate for molecular investigations. The utility of FFPET in ...

Hybrid-Cut: An Improved Sectioning Method for Recalcitrant Plant Tissue Samples

Maintaining plant section integrity is essential for studying detailed anatomical structures at the cellular, tissue, or even organ level. However, some plant cells have rigid cell walls, tough fibers and crystals (calcium oxalate, silica, etc.), and high water content that often disrupt tissue integrity during plant tissue sectioning.
This study establishes a simple Hybrid-Cut tissue sectioning method. This protocol modifies a paraffin-based sectioning technique and improves the integrity of tissue sections from different plants. Plant tissues were embedded in paraffin before sectioning in a cryostat at -16 &#176;C. Sectioning under low temperature hardened the paraffin blocks, reduced tearing and scratching, and improved tissue integrity significantly. This protocol was successfully applied to calcium oxalate-rich Phalaenopsis orchid tissues as well as recalcitrant tissues such as reproductive organs and leaves of rice, maize, and wheat. In addition, the high quality of tissue sections from Hybrid-Cut could be used in combination with in situ hybridization (ISH) to provide spatial expression patterns of genes of interest. In conclusion, this protocol is particularly useful for recalcitrant plant tissue containing high crystal or silica content. Good quality tissue sections enable morphological and other biological studies.

This protocol describes a simple Hybrid-Cut tissue sectioning method that is useful for recalcitrant plant tissues. Good quality tissue sections enable anatomical studies and other biological studies including in situ hybridization (ISH).

Hybrid-Cut: Um Método Seccionamento melhorado para amostras de tecidos de plantas recalcitrante

Maintaining plant section integrity is essential for studying detailed anatomical structures at the cellular, tissue, or even organ level. However, some ...

Stomata Tape-Peel: An Improved Method for Guard Cell Sample Preparation

The study of guard cells is essential to the knowledge of the specific contributions of this cell type to the overall function of plants. However, it is often difficult to isolate and thus studying them often provides a challenge. 
This study establishes a stomatal guard cell enrichment method. The protocol utilizes Scotch tape to isolate guard cells and extract proteins from the cells. This method improves the integrity and yield of guard cell during isolation and provides a reliable sample for the study of cell signaling processes and how they correlate to stomatal movement phenotypes. In this method, the plant leaves were partitioned between two portions of tape and peeled apart to remove the abaxial side. This protocol was applied to Arabidopsis leaf tissue to isolate guard cells. The cells were treated with fluorescein diacetate (FDA) to determine viability and with abscisic acid (ABA) to assess stomata movement in response to ABA. In conclusion, this protocol proves useful for preparing enriched stomatal guard cells and isolating proteins. The quality of the cells and proteins obtained here enable physiological and other biological studies.

This protocol describes a method of preparing enriched stomatal guard cells that is useful for physiological and other biological studies.

Fita de estomas-casca: Um método melhorado para preparação de amostras de células de guarda

The study of guard cells is essential to the knowledge of the specific contributions of this cell type to the overall function of plants. However, it is ...