We are grateful to Ms. Kaori Shimizu and Mr. Masaki Takasu of the Graduate School of Life Sciences, Toyo University, for their technical support. This project was supported by research grants from the Special Research Foundation and Bio-Nano Electronics Research Centre of Toyo University (to SK); by the Science Research Promotion Fund of the Promotion and Mutual Aid Corporation for Private Schools of Japan (to SK); by the New Project Fund for Risk Assessments, from the Ministry of Economy, Trade and Industry (to SK); by a Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research (award 23651028 to SK); by a Grant-in-Aid for Scientific Research (B) and (C) (award 23310026 and 26340030 to SK); and by a Grant-in-Aid for Strategic Research Base Project for Private Universities (award S1411016 to SK) from the Ministry of Education, Culture, Sports, Science and Technology of Japan.

Os medaka japoneses utilizados neste estudo foram tratados de forma humana, em conformidade com as diretrizes institucionais da Universidade de Toyo, com a devida consideração para o alívio do sofrimento e desconforto. 1. Prata nanocolóides (SNCs) <ol><li> Comprar SNCs purificadas (20 mg / L-1, 99,99% de pureza, de partículas de diâmetro médio cerca de 28,4 ± 8,5 nm, suspensas em água destilada). </li><li> Validar a pureza e concentração da prata por espectrometria de massa com plasma acoplado indutivamente (ICP-MS) para análises de acordo com o manual de funcionamento 8. O método de pré-tratamento para ICP-MS análises está descrito no capítulo 7. </li></ol> 2. Preparação de SNC Solutions (misturas de prata Colloids e Ag +) com diferentes salinidades <ol><li> Preparar 60 × MTC que consiste em 60 g de NaCl, 1,8 g de KCl, 2,4 g de CaCl 2 2H 2 O, e 9,78 g de MgSO 4 · 7H 2 O em 1 L de ultágua rapure; ajustar o pH para 7,0 com 1,25% de NaHCO3 em água ultrapura. </li><li> Agita-se a solução MTC a 25 ° C durante a noite. </li><li> Misture SNCs com ERM diluída. Prepare 40 ml de cada solução mista SNC-ERM. A concentração final é de 10 mg / L-1 de SNCs em diferentes concentrações de ERM (1x, 5x, 10x, 15x, 20x, ou 30x). </li><li> Ajustar o pH da solução mista SNC-MTC para 7,0 com 0,625% de NaHCO3 em água ultrapura. ajuste do pH é muito importante na preparação da solução SNC, porque Ag + de libertação é facilitada por condições acídicas 9. </li><li> Use AgNO 3 como composto de referência para SNCs. <ol><li> Misture AgNO3 com ERM diluído. Preparar 40 ml de AgNO3 -ERM solução mista a uma concentração de AgNO3 de 15,7 mg / L-1 (10 mg / L de prata -1) em diferentes concentrações de ERM (1x, 5x, 10x, 15x, 20x, ou 30x) . Nota: Para examinar a toxicidade colóide de prata, AgNO3solução, que é uma fonte de prata solúvel, é usado como composto de referência para SNCs, que são uma mistura de colóides de prata e prata solúvel. </li></ol></li></ol> 3. Medaka cultura e colheita Egg <ol><li> Obter o medaka (O. latipes) (estirpe vermelho-alaranjado) (60 homens e 60 mulheres). </li><li> medaka cultura como grupos (20 homens e 20 mulheres como um grupo) em ERM 1x em 3 tanques L, usando um sistema de cultura flow-through medaka. <ol><li> Cultura nas seguintes condições: intervalo de pH do meio de cultura: 6,2-6,5 luz: ciclo escuro: 16: 8 hr temperatura do meio de cultura: 24 ° C ± 0,5 pressão osmótica do meio de cultura: 257 mOsm </li></ol></li><li> Alimente medaka sobre náuplios de Artemia salina às 10:00 (uma vez por dia) e alimentar uma dieta de peixe seco artificial às 09:00, 11:00, 13:00, 15:00 e 17:00 (cinco vezes por dia). <ol><li> Obter A. náuplios salina. </li> &lt;li&gt; Prepare 5 L de uma solução de sal de 3,0% num copo de plástico. </li><li> Adicionar 30 g de ovos de artémia para a solução do sal contido no copo. </li><li> Incubar os ovos a 25 ° C durante 48 horas com borbulhamento (4 L / min -1) usando uma bomba de arejamento. </li><li> Após 48 h, parar o borbulhamento. </li><li> Deixar a solução repousar durante 5 a 10 min para separar o A. eclodidos salina náuplios (parte inferior da solução) a partir de ovos não eclodidos e cascas de ovos (parte superior da solução). </li><li> Remover a camada superior da solução por decantação. </li><li> Filtra-se a porção inferior da solução através de um peneiro com aberturas de 283 um, e recolher os náuplios que passam através de uma rede com aberturas de 198 ^ m. </li><li> Alimente o náuplios aos medaka dentro de 6 horas. </li></ol></li><li> Após as medaka do sexo feminino têm gerado, remover os aglomerados de ovos externos suavemente de corpos das fêmeas ou recolher os ovos a partir do fundo do tanque de peixes usando um smtoda a rede (net tamanho 5 cm x 5 cm, tamanho do furo 0,2 mm x 0,2 mm). </li><li> Lavar o cluster de ovo com água corrente da torneira por 5 s. </li><li> Adicione todos os aglomerados de ovos lavados 30x solução ERM. </li><li> Remover os clusters a partir da solução após 1 min e colocar os aglomerados de ovos entre toalhas de papel seco e rolar suavemente. </li><li> Coloque os ovos de volta para o ERM 30x. </li><li> Seleccionar ovos fertilizados sob um microscópio de dissecação. </li><li> Lugar seleccionado 810 ovos em ERM 1x em seis poços placas de plástico usando uma pinça. </li><li> Incubar os ovos a 25 ± 0,1 ° C em uma incubadora até que estágio de desenvolvimento 21. (estádios de desenvolvimento dos embriões medaka foram definidos a partir do trabalho de Iwamatsu 10). </li><li> Escolher ovos incubados no estágio de desenvolvimento 21 sob um microscópio de dissecação. </li><li> Lavar os ovos selecionados com ERM 1x. </li><li> Sujeitar os ovos lavados para experimentos de exposição (Seção 4). </li></ol> 4. Ensaios de Toxicidade de SNCs ou AgNO3 </sub&gt; Em diferentes salinidades ERM <ol><li> Lavar os ovos medaka (fase 21), três vezes com solução de ensaio [SNCs (10 mg / L-1) ou AgNO 3 (15,7 mg / L-1 como de 10 mg / L de prata -1) para cada concentração de MTC (1x, 5x , 10x, 15x, 20x, ou 30x) a pH 7]. Como controlos, usam ovos em 1 × a 30 × MTC a um pH de 7. </li><li> Adicionar 15 ovos enxaguados a 5 ml de cada solução de teste em seis-se placas de plástico. (Execute os experimentos de exposição três vezes por SNC ou AgNO3 toxicidade testando o uso de cada solução de teste.) </li><li> Enrole as placas em folha de alumínio. </li><li> Incubar as placas revestidas apresentam um de 25 ° C no escuro até à eclosão ou durante 14 dias. </li><li> Observar os ovos expostos a cada 24 horas para mudanças biológicas e ovos mortos (Figuras 1 e 2). </li><li> Trocar as soluções de teste a cada 24 horas. </li><li> Realizar observações como se segue. <ol><li> No dia 6 de exposição, contar o ritmo cardíaco (por 15 segundos) of embriões medaka sob um microscópio de dissecação, utilizando um cronometro (Figura 3A). </li><li> No dia 6 de exposição, medir o tamanho do olho (diâmetro) de embriões medaka sob um microscópio de dissecação, usando um micrómetro (Figura 3b). </li><li> No dia incubação, medir os comprimentos de corpo inteiro de larvas sob um microscópio de dissecação, utilizando um micrômetro (Figura 3c). </li><li> Contar o número total de ovos que eclodem expostos ao longo dos 14 dias (Figura 3D). </li></ol></li></ol> 5. Isolamento de prata solúvel de Solução SNC, e análise de prata <ol><li> Isolar prata solúveis a partir de cada solução SNC (uma mistura de colóides de prata e prata solúvel) por filtração através de um filtro de membrana de 3 kDa a 14.000 x g e 4 ° C durante 10 min. Usar um filtro de membrana de 3 kDa, para isolar prata solúvel dos SNCs, porque o diâmetro médio de relatado SNCs agregados no MTC 1x é 67,8 nm, 11 umnd a de Ag + é 0,162 nm 12; a membrana de 3 kDa, exclui partículas com diâmetros de 2 nm ou mais 13. </li><li> Medir a concentração de prata em 50 ml de solução filtrada (= a concentração de prata solúvel) por análise de ICP-MS (Figura 3e) de acordo com o manual de instruções ICP-MS 8. O método de pré-tratamento para o ICP-MS análises está descrito no capítulo 7. </li></ol> 6. Medição de prata bioacumulação em Medaka Embriões <ol><li> Expor ovos medaka (fase 21) para SNCs ou AgNO3 como descrito na seção 4. </li><li> No dia 6 de exposição, remover cório do ovo (isto é, dechorion) usando Medaka incubação da enzima de acordo com o protocolo descrito no Livro Medaka 14. </li><li> Medir a concentração de prata dos ovos dechorioned pela análise ICP-MS de acordo com o ICP-MS manual de operação 8 (Figura 3-F). o pré-tratamentométodo para a ICP-MS análises está descrito no capítulo 7. </li></ol> 7. Medição de Concentração de prata pelo ICP-MS Análise <ol><li> Adicione exemplos [50 mL de solução de prata (para validação da concentração de prata, secção 1); três embriões dechorionated (seção 5); ou 50 ml de solução filtrada (seção 5)] para um copo de 50 ml Teflon. </li><li> Adicionar 2,0 ml de ácido nítrico ultrapura ao copo de 50 ml. </li><li> Aquece-se a mistura sobre uma placa quente a 110 ° C, até pouco antes de secar (cerca de 3 h). </li><li> Para dissolver a matéria orgânica por completo, adicionar 2,0 ml de ácido nítrico ultrapura e 0,5 ml de peróxido de hidrogénio para a proveta. </li><li> Aquecer a mistura novamente na chapa quente até pouco antes de ele seca (cerca de 3 horas). </li><li> Dissolve-se o resíduo em 4 ml de solução de ácido nítrico 1,0% ultrapura. </li><li> Transferência de 4 ml de solução para um tubo de centrífuga. </li><li> Repita duas vezes 7,6-7,7 (um total de três vezes). O volume final é de 12,0ml. </li><li> Medir a concentração de prata da amostra (dissolvido em ácido nítrico ultrapura 1,0%) por meio de análise ICP-MS de acordo com o manual de instruções 8. <ol><li> Use uma interna e uma solução padrão externo (Veja Lista de Materiais) para quantificar a concentração de prata. A solução padrão interna e externa é credenciada pela Associação Americana de Acreditação de Laboratórios (A2LA). Os limites de detecção de prata foram 0,0018 ng / ml -1 (solução) e 0,016 ng mg de peso -1 (corpo do embrião). </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 2 Effects on Biotic Systems. , (2015).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> National Coastal Condition Report. , (2001).</li><li>Sakaizumi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+inorganic+salts+on+mercury-compound+toxicity+to+the+embryos+of+the+Medaka,+Oryzias+latipes.">Effect of inorganic salts on mercury-compound toxicity to the embryos of the Medaka, Oryzias latipes.</a> J. Fac. Sci. Univ. Tokyo. 14 (4), 369-384 (1980).</li><li>Sumitani, K., Kashiwada, S., Osaki, K., Yamada, M., Mohri, S., Yasumasu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medaka+(Oryzias+latipes)+Embryo+toxicity+of+treated+leachate+from+waste-landfill+sites.">Medaka (Oryzias latipes) Embryo toxicity of treated leachate from waste-landfill sites.</a> J. Jpn. Soc. Waste Manage. Exp. 15 (6), 472-479 (2004).</li><li>Kashiwada, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+Nanoparticles+in+the+See-through+Medaka+(Oryzias+latipes).">Distribution of Nanoparticles in the See-through Medaka (Oryzias latipes).</a> EHP. 114 (11), 1697-1702 (2006).</li><li>Iwamatsu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Integrated Book for the Biology of the Medaka. , (2006).</li><li>Miyamoto, T., Machida, T., Kawashima, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+environmental+salinity+on+the+development+of+chloride+cells+of+freshwater+and+brackish-water+medaka,+Oryzias+latipes.">Influence of environmental salinity on the development of chloride cells of freshwater and brackish-water medaka, Oryzias latipes.</a> Zoo. Sci. 3 (5), 859-865 (1986).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> XSERIES 2 ICP-MS Getting Started Guide Revision B - 121 9590. , (2007).</li><li>Kashiwada, S., Ariza, M. E., Kawaguchi, T., Nakagame, Y., Jayasinghe, B. S., Gartner, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silver+nanocolloids+disrupt+medaka+embryogenesis+through+vital+gene+expressions.">Silver nanocolloids disrupt medaka embryogenesis through vital gene expressions.</a> ES &amp; T. 46 (11), 6278-6287 (2012).</li><li>Iwamatsu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+normal+development+in+the+medaka+Oryzias+latipes.">Stages of normal development in the medaka Oryzias latipes.</a> Mech. Dev. 121, 605-618 (2004).</li><li>Kataoka, C., Ariyoshi, T., Kawaguchi, H., Nagasaka, S., Kashiwada, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salinity+increases+the+toxicity+of+silver+nanocolloids+to+Japanese+medaka+embryos.">Salinity increases the toxicity of silver nanocolloids to Japanese medaka embryos.</a> Environ. Sci.: Nano. 2, 94-103 (2014).</li><li>Shannon, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revised+effective+ionic+radii+and+systematic+studies+of+interatomic+distances+in+halides+and+chalcogenides.">Revised effective ionic radii and systematic studies of interatomic distances in halides and chalcogenides.</a> Acta Cryst. 32, 751-767 (1976).</li><li>Wakamatsu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Medaka Book, 6.1: Preparation of hatching enzyme. , (2015).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Medaka é um peixe de água doce que é altamente tolerante à água do mar; não é bem conhecido que o habitat natural original este peixe era água salgada ao largo da costa japonesa 6. Assim, peixes medaka ter bem desenvolvida células de cloreto 7. Esta propriedade única fornece aos cientistas uma nova maneira de testar a toxicidade dos produtos químicos no ambiente em função da salinidade (água doce para a água do mar), utilizando apenas uma única espécie de peixe. <p class="jove_...

Desde a criação da Organização para a Cooperação e as diretrizes de teste Desenvolvimento Económico (OCDE) para produtos químicos de teste em 1979, 38 guias do teste foram publicados na Seção 2 das orientações, efeitos sobre os sistemas bióticos 1. Todos os organismos aquáticos testados ter sido de habitats de água doce, ou seja, plantas de água doce; algas; invertebrados, como dáfnias e quironomídeos; e peixes, como medaka, peixe-zebra, e truta arco-íris. Em comparação com ambientes de água salgada, ambientes de água doce estão mais directamente afectados pelas actividades económicas e industriais humanos. Portanto, ambientes de água doce foram priorizados para testes, porque eles estão em maior risco de poluição. Nas zonas costeiras, incluindo estuários, salinidades variam entre as condições de água e água salgada, salobra, e estas áreas são muitas vezes poluída por atividade industrial 2. As zonas costeiras e as suas zonas húmidas associadas são caracterizados por hbiodiversidade ecológica igh e produtividade. ecossistemas costeiros devem, portanto, ser protegido da poluição química. No entanto, tem havido pesquisas ecotoxicológicas em habitats de água e água salgada salobra limitado. Sakaizumi 3 estudaram as interacções entre tóxicos metil-mercúrio e salinidade em ovos medaka japoneses e descobriram que o aumento da pressão osmótica da solução de teste aumentou a toxicidade do mercúrio metilo. . Sumitani et al 4 utilizaram ovos medaka para investigar a toxicidade do lixiviado de aterro sanitário; eles descobriram que a equivalência osmótica de lixiviados para os ovos era a chave para induzir anormalidades durante a embriogênese. Além disso, Kashiwada 5 relataram que as nanopartículas de plástico (39,4 nm de diâmetro) facilmente permeado através do córion medaka ovo em condições salobras (15x embrião criação médio (ERM)). Um modelo pequeno peixe típico, os medaka japonês (Oryzias latipes </em&gt;) tem sido utilizado em biologia básica e ecotoxicology 6. Medaka japonês pode viver em condições que variam de água doce para a água do mar por causa de suas células de cloreto altamente desenvolvidos 7. Eles são, portanto, susceptíveis de ser útil para testar em condições com uma vasta gama de salinidade.

<table><tbody><tr><td>Silver nanocolloids</td><td>Utopia Silver Supplements</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Nacalai Tesque, Inc.</td><td>31319-45</td><td>For making ERM</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Nacalai Tesque, Inc.</td><td>28513-85</td><td>For making ERM</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;middot;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Nacalai Tesque, Inc.</td><td>06730-15</td><td>For making ERM</td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;middot;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Nacalai Tesque, Inc.</td><td>21002-85</td><td>For making ERM</td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;&amp;nbsp;</td><td>Nacalai Tesque, Inc.</td><td>31212-25</td><td>For making ERM</td></tr><tr><td>AgNO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Nacalai Tesque, Inc.</td><td>31018-72</td><td></td></tr><tr><td>pH meter</td><td>HORIBA, Ltd.</td><td>F-51S</td><td></td></tr><tr><td>Balance</td><td>Mettler-Toledo International Inc.</td><td>MS204S</td><td></td></tr><tr><td>medaka (&lt;em&gt;Oryzias latipes&lt;/em&gt;) orange-red strain</td><td>National Institute for Environmental Studies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>medaka flow-through culturing system</td><td>Meito Suien Co.</td><td>MEITOsystem</td><td></td></tr><tr><td>Artemia salina nauplii eggs</td><td>Japan pet design Co. Ltd</td><td>4975677033759</td><td></td></tr><tr><td>aeration pump</td><td>Japan pet design Co. Ltd</td><td>non-noise w300</td><td></td></tr><tr><td>Otohime larval &amp;beta;-1</td><td>Marubeni Nissin Feed Co. Ltd</td><td>Otohime larval &amp;beta;-1</td><td>Artificial dry fish diet</td></tr><tr><td>dissecting microscope</td><td>Leica microsystems</td><td>M165FC</td><td></td></tr><tr><td>micrometer</td><td>Fujikogaku, Ltd.</td><td>10450023</td><td></td></tr><tr><td>incubator</td><td>Nksystem</td><td>TG-180-5LB</td><td></td></tr><tr><td>shaker</td><td>ELMI Ltd.</td><td>Aizkraukles 21-136</td><td></td></tr><tr><td>6-well plastic plates</td><td>Greiner CELLSTAR</td><td>M8562-100EA</td><td></td></tr><tr><td>aluminum foil</td><td>AS ONE Co.</td><td>6-713-02</td><td></td></tr><tr><td>stopwatch</td><td>DRETEC Co. Ltd.</td><td>SW-111YE</td><td></td></tr><tr><td>3 kDa membrane filter</td><td>EMD Millipore Corporation</td><td>0.5 ml centrifugal-type filter</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Teflon beaker</td><td>AS ONE Co.</td><td>33431097</td><td></td></tr><tr><td>Custom claritas standard</td><td>SPEXertificate</td><td>ZSTC-538</td><td>For internal standard</td></tr><tr><td>Custom claritas standard</td><td>SPEXertificate</td><td>ZSTC-622</td><td>For external standard</td></tr><tr><td>ultrapure nitric acid</td><td>Kanto Chemical Co.</td><td>28163-5B</td><td></td></tr><tr><td>hydrogen peroxide&amp;nbsp;</td><td>Kanto Chemical Co.</td><td>18084-1B</td><td>for atomic absorption spectrometry</td></tr><tr><td>ICP-MS</td><td>Thermo Scientific</td><td>Thermo Scientific X Series 2&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>hot plate</td><td>Tiger Co.</td><td>CRC-A300</td><td></td></tr></tbody></table>

salinity-dependent toxicity assay of silver nanocolloids using medaka eggs

A salinidade constitui uma característica importante do ambiente aquático. Para os organismos aquáticos que define os habitats de água doce, água salobra e água do mar. Os testes de toxicidade dos produtos químicos e avaliações de seus riscos ecológicos para os organismos aquáticos são freqüentemente realizada em água doce, mas a toxicidade dos produtos químicos para os organismos aquáticos depende do pH, temperatura e salinidade. Não existe um método, no entanto, para testar a dependência salinidade de toxicidade para os organismos aquáticos. Aqui, usamos medaka (Oryzias latipes), porque eles podem se adaptar à água doce, água salobra e água do mar. Diferentes concentrações do meio de criação de embriões (ERM) (1x, 5x, 10x, 15x, 20x e 30x) foram empregadas para testar a toxicidade de partículas nanocolloidal prata (SNCs) para Medaka ovos (ERM 1x e 30x ERM têm pressões osmóticas equivalentes à água doce e água do mar, respectivamente). Em placas de seis poços de plástico, de 15 ovos medaka, em triplicado, foram expostas a SNCs a 10 mg / L &amp;# 8722; 1 em diferentes concentrações de MTC a pH 7 e 25 ° C no escuro. Foi utilizado um microscópio de dissecação e um micrômetro para medir a frequência cardíaca por 15 seg e olho de diâmetro no dia 6 e comprimento do corpo cheio de larvas em incubação dia (secção 4). Os embriões foram observados até a eclosão ou dia 14; Em seguida, contou a taxa de eclosão todos os dias, durante 14 dias (Seção 4). Para ver a acumulação de prata em embriões, que usamos em espectrometria de massa com plasma para medir a concentração de prata de soluções de teste (seção 5) e embriões dechorionated (secção 6) .A toxicidade dos SNCs para embriões medaka, obviamente, aumentou com o aumento da salinidade. Este novo método permite-nos testar a toxicidade dos produtos químicos em diferentes salinidades.

O efeito da salinidade na toxicidade SNC foi muito óbvio: a indução de morte ou deformidade foi salinidade dependentes (Figuras 1 e 2). Nós medimos biomarcadores fenotípicas (frequência cardíaca, tamanho do olho, comprimento de corpo inteiro, e taxa de eclosão) no SNC (10 mg / L -1) embriões -exposed. Esses biomarcadores fenotípicas revelou dependente da salinidade toxicidade SNC. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-p...

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Salinity-dependent Toxicity Assay of Silver Nanocolloids Using Medaka Eggs

Embryonic stages are the most susceptible to xenobiotics. Although chemical toxicity depends on salinity, no method exists to test the salinity dependence of toxicity to aquatic organisms. Here, we describe a new and high-throughput method for determining the salinity dependence of toxicity to aquatic embryos.

dependente da salinidade toxicidade Ensaio de prata nanocolóides Usando Medaka Eggs

Salinity is an important characteristic of the aquatic environment. For aquatic organisms it defines the habitats of freshwater, brackish water, and ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

8.0K visualizações.  Toyo University. Embryonic stages are the most susceptible to xenobiotics. Although chemical toxicity depends on salinity, no method exists to test the salinity dependence of toxicity to aquatic organisms. Here, we describe a new and high-throughput method for determining the salinity dependence of toxicity to aquatic embryos.

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Ecotoxicological Method with Marine Bacteria Vibrio anguillarum to Evaluate the Acute Toxicity of Environmental Contaminants

Bacteria are an important component of the ecosystem, and microbial community alterations can have a significant effect on biogeochemical cycling and food webs. Toxicity testing based on microorganisms are widely used because they are relatively quick, reproducible, cheap, and are not associated with ethical issues. Here, we describe an ecotoxicological method to evaluate the biological response of the marine bacterium Vibrio anguillarum. This method assesses the acute toxicity of chemical compounds, including new contaminants such as nanoparticles, as well as environmental samples. The endpoint is the reduction of bacterial culturability (i.e., the capability to replicate and form colonies) due to exposure to a toxicant. This reduction can be generally referred to as mortality. The test allows for the determination of the LC50, the concentration that causes a 50% decrease of bacteria actively replicating and forming colonies, after a 6 h exposure. The culturable bacteria are counted in terms of colony forming units (CFU), and the &#34;mortality&#34; is evaluated and compared to the control. In this work, the toxicity of copper sulphate (CuSO4) was evaluated. A clear dose-response relationship was observed, with a mean LC50 of 1.13 mg/L, after three independent tests. This protocol, compared to existing methods with microorganisms, is applicable in a wider range of salinity and has no limitations for colored/turbid samples. It uses saline solution as the exposure medium, avoiding any possible interferences of growth medium with the investigated contaminants. The LC50 calculation facilitates comparisons with other bioassays commonly applied to ecotoxicological assessments of the marine environment.

Ecotoxicological Method with Marine Bacteria Vibrio anguillarum to Evaluate the Acute Toxicity of Environmental Contaminants

This work describes a new protocol to assess the ecotoxicity of pollutants, including emerging contaminants such as nanomaterials, using the marine bacterium Vibrio anguillarum. This method allows for the determination of the LC50, or mortality, the concentration that causes a 50% decrease in bacteria culturability, after a 6 h exposure.

Método Ecotoxicológico com Bactérias Marinhas<em&gt; Vibrio anguillarum</em&gt; Avaliar a Toxicidade Aguda dos Contaminantes Ambientais

Bacteria are an important component of the ecosystem, and microbial community alterations can have a significant effect on biogeochemical cycling and food ...

Ambiente

Drug Treatment and In Vivo Imaging of Osteoblast-Osteoclast Interactions in a Medaka Fish Osteoporosis Model

Bone-forming osteoblasts interact with bone-resorbing osteoclasts to coordinate the turnover of bone matrix and to control skeletal homeostasis. Medaka and zebrafish larvae are widely used to analyze the behavior of bone cells during bone formation, degeneration, and repair. Their optical clarity allows the visualization of fluorescently labeled bone cells and fluorescent dyes bound to the mineralized skeletal matrix. Our lab has generated transgenic medaka fish that express the osteoclast-inducing factor Receptor Activator of Nuclear-factor &#954;B Ligand (RANKL) under the control of a heat&#160;shock-inducible promoter. Ectopic expression of RANKL results in the excess formation of activated osteoclasts, which can be visualized in reporter lines with nlGFP expression under the control of the cathepsin K (ctsk) promoter. RANKL induction and ectopic osteoclast formation leads to severe osteoporosis-like phenotypes. Compound transgenic medaka lines that express ctsk:nlGFP in osteoclasts, as well as mCherry under the control of the osterix (osx) promoter in premature osteoblasts, can be used to study the interaction of both cell types. This facilitates the in vivo observation of cellular behavior under conditions of bone degeneration and repair. Here, we describe the use of this system to test a drug commonly used in human osteoporosis therapy and describe a protocol for live imaging. The medaka model complements studies in cell culture and mice, and offers a novel system for the in vivo analysis of drug action in the skeletal system.

Drug Treatment and In Vivo Imaging of Osteoblast-Osteoclast Interactions in a Medaka Fish Osteoporosis Model

Small laboratory fish have become popular models for bone research on the mechanisms underlying human bone disorders and for the screening of bone-modulating drugs. In this report, we describe a protocol to assess the effect of alendronate on bone cells in medaka larvae with osteoporotic lesions.

Tratamento de drogas e<em&gt; In Vivo</em&gt; Imagem de Osteoblast-osteoclastos Interações em um modelo de Medaka Peixe Osteoporose

Bone-forming osteoblasts interact with bone-resorbing osteoclasts to coordinate the turnover of bone matrix and to control skeletal homeostasis. Medaka ...

Biologia do Desenvolvimento

Use of Autometallography to Localize and Semi-Quantify Silver in Cetacean Tissues

Silver nanoparticles (AgNPs) have been extensively used in commercial products, including textiles, cosmetics, and health care items, due to their strong antimicrobial effects. They also may be released into the environment and accumulate in the ocean. Therefore, AgNPs are the major source of Ag contamination, and public awareness of the environmental toxicity of Ag is increasing. Previous studies have demonstrated the bioaccumulation (in producers) and magnification (in consumers/predators) of Ag. Cetaceans, as the apex predators of ocean, may have been negatively affected by the Ag/Ag compounds. Although the concentrations of Ag/Ag compounds in cetacean tissues can be measured by inductively coupled plasma mass spectroscopy (ICP-MS), the use of ICP-MS is limited by its high capital cost and the requirement for tissue storage/preparation. Therefore, an autometallography (AMG) method with an image quantitative analysis by using formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissue may be an adjuvant method to localize Ag distribution at the suborgan level and estimate the Ag concentration in cetacean tissues. The AMG positive signals are mainly brown to black granules of various sizes in the cytoplasm of proximal renal tubular epithelium, hepatocytes, and Kupffer cells. Occasionally, some amorphous golden yellow to brown AMG positive signals are noted in the lumen and basement membrane of some proximal renal tubules. The assay for estimating the Ag concentration is named the Cetacean Histological Ag Assay (CHAA), which is a regression model established by the data from image quantitative analysis of the AMG method and ICP-MS. The use of AMG with CHAA to localize and semi-quantify heavy metals provides a convenient methodology for spatio-temporal and cross-species studies.

A protocol is presented to localize Ag in cetacean liver and kidney tissues by autometallography. Furthermore, a new assay, named the cetacean histological Ag assay (CHAA) is developed to estimate the Ag concentrations in those tissues.

Uso de Autometallography para localizar e quantificar semi prata em tecidos de cetáceos

Silver nanoparticles (AgNPs) have been extensively used in commercial products, including textiles, cosmetics, and health care items, due to their strong ...

A Small-Scale Setup for Algal Toxicity Testing of Nanomaterials and Other Difficult Substances

Ecotoxicity data is a requirement for pre- and post-market registration of chemicals by European and international regulations (e.g., REACH). The algal toxicity test is frequently used in regulatory risk assessment of chemicals. In order to achieve high reliability and reproducibility the development of standardized guidelines is vital. For algal toxicity testing, the guidelines require stable and uniform conditions of parameters such as pH, temperature, carbon dioxide levels and light intensity. Nanomaterials and other so-called difficult substances can interfere with light causing a large variation in results obtained hampering their regulatory acceptance. To address these challenges, we have developed LEVITATT (LED Vertical Illumination Table for Algal Toxicity Tests). The setup utilizes LED illumination from below allowing for a homogenous light distribution and temperature control while also minimizing intra-sample shading. The setup optimizes the sample volume for biomass quantification and does at the same time ensure a sufficient influx of CO2 to support exponential growth of the algae. Additionally, the material of the test containers can be tailored to minimize adsorption and volatilization. When testing colored substances or particle suspensions, the use of LED lights also allows for increasing the light intensity without additional heat generation. The compact design and minimal equipment requirements increase the possibilities for implementation of the LEVITATT in a wide range of laboratories. While compliant with standardized ISO and OECD guidelines for algal toxicity testing, LEVITATT also showed a lower inter-sample variability for two reference substances (3,5-Dicholorophenol and K2Cr2O7) and three nanomaterials (ZnO, CeO2, and BaSO4) compared to Erlenmeyer flasks and microtiter plates.

We demonstrate algal toxicity testing for difficult substances (e.g., colored substances or nanomaterials) using a setup illuminated vertically with an LED.

Uma configuração em pequena escala para testes de toxicidade de algas de nanomateriais e outras substâncias difíceis

Ecotoxicity data is a requirement for pre- and post-market registration of chemicals by European and international regulations (e.g., REACH). The algal ...

Lethality Bioassay Using Artemia salina L.

Natural products have been used since ancient times to produce medicines. Nowadays, there are plenty of chemotherapeutic drugs obtained from natural sources and used against a plethora of diseases. Unfortunately, most of these compounds often display systemic toxicity and adverse effects. In order to better evaluate the tolerability of selected potentially bioactive samples, brine shrimp (Artemia salina) is generally used as a model in lethality studies. The A. salina test is based on the ability of the studied bioactive compounds to kill the microcrustaceans in their larval stage (nauplii). This method represents a convenient starting point for cytotoxicity studies, as well as for the general toxicity screening of synthetic, semisynthetic, and natural products. It can be considered a simple, quick, and low-cost assay, compared to many other assays (in vitro cells or yeast strains, zebrafish, rodents) generally suitable for the aforementioned purposes; moreover, it can be easily performed even without any specific training. Overall, A. salina assay represents a useful tool for the preliminary toxicity evaluation of selected compounds and the bio-guided fractionation of natural product extracts.

Lethality Bioassay Using Artemia salina L.

This work aims to evaluate and review the Artemia salina lethality bioassay procedure, also identified as brine shrimp lethality assay. This simple and cheap method gives information about the general toxicity (considered as a preliminary toxicity evaluation) of samples, namely, natural products.

Bioensaio de Letalidade Utilizando Artemia salina L.

Natural products have been used since ancient times to produce medicines. Nowadays, there are plenty of chemotherapeutic drugs obtained from natural ...

Química

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish water and sediment. The choice of biological indicators must be based on reliable scientific knowledge and, possibly, on the availability of standardized procedures. In this article, we present a standardized protocol that used the marine crustacean Artemia to evaluate the toxicity of chemicals and/or of marine environmental matrices. Scientists propose that the brine shrimp (Artemia) is a suitable candidate for the development of a standard bioassay for worldwide utilization. A number of papers have been published on the toxic effects of various chemicals and toxicants on brine shrimp (Artemia). The major advantage of this crustacean for toxicity studies is the overall availability of the dry cysts; these can be immediately used in testing and difficult cultivation is not demanded1,2. Cyst-based toxicity assays are cheap, continuously available, simple and reliable and are thus an important answer to routine needs of toxicity screening, for industrial monitoring requirements or for regulatory purposes3. The proposed method involves the mortality as an endpoint. The numbers of survivors were counted and percentage of deaths were calculated. Larvae were considered dead if they did not exhibit any internal or external movement during several seconds of observation4. This procedure was standardized testing a reference substance (Sodium Dodecyl Sulfate); some results are reported in this work. This article accompanies a video that describes the performance of procedural toxicity testing, showing all the steps related to the protocol.

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

This study concerns the development and standardization of a valuable methodological protocol to determine long-term (14 days) lethal toxicity exerted by chemical substances, industrial wastewater or sewage and liquid environmental samples on the saltwater crustacean, Artemia franciscana.

A longo prazo de Teste de toxicidade letal com o crustáceo Artemia franciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

Biologia

Rapid Evaluation of Toxicity of Chemical Compounds Using Zebrafish Embryos

The zebrafish is a widely used vertebrate model organism for the disease and phenotype-based drug discovery. The zebrafish generates many offspring, has transparent embryos and rapid external development. Zebrafish embryos can, therefore, also be used for the rapid evaluation of toxicity of the drugs that are precious and available in small quantities. In the present article, a method for the efficient screening of the toxicity of chemical compounds using 1-5-day post fertilization embryos is described. The embryos are monitored by stereomicroscope to investigate the phenotypic defects caused by the exposure to different concentrations of compounds. Half-maximal lethal concentrations (LC50) of the compounds are also determined. The present study required 3-6 mg of an inhibitor compound, and the whole experiment takes about 8-10 h to be completed by an individual in a laboratory having basic facilities. The current protocol is suitable for testing any compound to identify intolerable toxic or off-target effects of the compound in the early phase of drug discovery and to detect subtle toxic effects that may be missed in the cell culture or other animal models. The method reduces procedural delays and costs of drug development.

Zebrafish embryos are used for evaluating the toxicity of chemical compounds. They develop externally and are sensitive to chemicals, allowing detection of subtle phenotypic changes. The experiment only requires a small amount of compound, which is directly added to the plate containing embryos, making the testing system efficient and cost-effective.

Avaliação rápida da toxicidade de compostos químicos usando embriões de zebrafish

The zebrafish is a widely used vertebrate model organism for the disease and phenotype-based drug discovery. The zebrafish generates many offspring, has ...

Medicina

Bateria de Testes Comportamentais para Avaliação de Efeitos Neurotóxicos em Peixe-Zebra Adulto

Neurotoxicity Assessment in Adult Danio rerio using a Battery of Behavioral Tests in a Single Tank

The presence of neuropathological effects proved to be, for many years, the main endpoint for assessing the neurotoxicity of a chemical substance. However, in the last 50 years, the effects of chemicals on the behavior of model species have been actively investigated. Progressively, behavioral endpoints were incorporated into neurotoxicological screening protocols, and these functional outcomes are now routinely used to identify and determine the potential neurotoxicity of chemicals. Behavioral assays in adult zebrafish provide a standardized and reliable means to study a wide range of behaviors, including anxiety, social interaction, learning, memory, and addiction. Behavioral assays in adult zebrafish typically involve placing the fish in an experimental arena and recording and analyzing their behavior using video tracking software. Fish can be exposed to various stimuli, and their behavior can be quantified using a variety of metrics. The novel tank test is one of the most accepted and widely used tests to study anxiety-like behavior in fish. The shoaling and social preference tests are useful in studying the social behavior of zebrafish. This assay is particularly interesting since the behavior of the entire shoal is studied. These assays have proven to be highly reproducible and sensitive to pharmacological and genetic manipulations, making them valuable tools for studying the neural circuits and molecular mechanisms underlying behavior. Additionally, these assays can be used in drug screening to identify compounds that may be potential modulators of behavior.
We will show in this work how to apply behavioral tools in fish neurotoxicology, analyzing the effect of methamphetamine, a recreational drug, and glyphosate, an environmental pollutant. The results demonstrate the significant contribution of behavioral assays in adult zebrafish to the understanding of the neurotoxicological effects of environmental pollutants and drugs, in addition to providing insights into the molecular mechanisms that may alter neuronal function.

Autor em destaque: Avaliação de mudanças comportamentais ambientais e induzidas por drogas em peixes-zebra adultos 

Here, we present a comprehensive behavioral test battery, including the novel tank, Shoaling, and social preference tests, to effectively determine the potential neurotoxic effects of chemicals (e.g., methamphetamine and glyphosate) on adult zebrafish using a single tank. This method is relevant to neurotoxicity and environmental research.

dependente da salinidade toxicidade Ensaio de prata nanocolóides Usando Medaka Eggs

Resumo

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Método Ecotoxicológico com Bactérias Marinhas

Tratamento de drogas e

Uso de Autometallography para localizar e quantificar semi prata em tecidos de cetáceos

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Bioensaio de Letalidade Utilizando Artemia salina L.

A longo prazo de Teste de toxicidade letal com o crustáceo Artemia franciscana

Avaliação rápida da toxicidade de compostos químicos usando embriões de zebrafish

Avaliação da Neurotoxicidade em Danio rerio Adulto utilizando uma Bateria de Testes Comportamentais em um Único Tanque

Avaliação da Neurotoxicidade em Danio rerio Adulto utilizando uma Bateria de Testes Comportamentais em um Único Tanque

Avaliação da Neurotoxicidade em Danio rerio Adulto utilizando uma Bateria de Testes Comportamentais em um Único Tanque