Agradecemos ao Dr. Roger Erickson por seu apoio e assistência na preparação do manuscrito. Este trabalho foi financiado pelo Instituto Nacional do Câncer, no Instituto Nacional de Saúde (Grant Número RO1CA177984; RO1CA138642), projeto de programa VA sobre o câncer de próstata (BX001604).

Foram obtidas amostras de câncer de próstata fresco congelado-fixada em formalina, embebidos em parafina (FFPE) ou a partir do SFVAMC. Amostras eram de pacientes com câncer de próstata submetidos à prostatectomia radical em SFVAMC. Termo de consentimento informado foi obtido de todos os pacientes eo estudo foi aprovado pelo Comitê UCSF em Pesquisa com Seres Humanos. Alternativamente, tecidos de câncer de próstata microarrays foram adquiridos a partir de fontes comerciais e utilizados para análises de miRNA por ISH. Informações clínico-patológico e acompanhamento para pacientes com câncer de próstata analisados ​​foram coletados. 1. As amostras de tecidos <ol><li> Cortar amostras de tecido da próstata câncer em 10 mm seções usando um micrótomo e mancha com H &amp; E seguindo o protocolo do fabricante. </li><li> Comente lâminas coradas para a identificação de focos de câncer de próstata, bem como epitélio glandular normal adjacente. Nota: A placa certificada patologista deve rever os slides H &amp; E manchada e maRK para o tumor e zonas normais. Use os slides marcados como guias nas seções subseqüentes para miRNA análises de tumor vs áreas normais. </li></ol> 2. miRNA expressão quantitativa Análises por PCR em tempo real Nota: Esse fluxo de trabalho envolve as seguintes etapas: Captura de Laser microdissection, isolamento de RNA total (incluindo miRNA e mRNA), ensaio de miRNAs maduros usando os ensaios de expressão TaqMan MicroRNA conforme detalhado nas seções seguintes. <ol><li> Extração de RNA <ol><li> Isolamento de miRNA de cancro da próstata tecidos FFPE <ol><li> Captura Laser microdissection (LCM) Nota: Siga as etapas 2.1.1.1.1- 2.1.1.1.4 em um exaustor química. <ol><li> Preparar lâminas de tecido (10 mm seções) para LCM. Deparrafinize secções de tecido por imersão em xileno (2x), durante 10 min cada, em seguida, re-hidratar os tecidos através da incubação das lâminas durante 5 min cada em etanol graduado (100%, 95%, 90%, 80%, 70%) seguido por destilada água(5 min). </li><li> Após reidratação, as secções com hematoxilina mancha durante 30 seg seguido de água. </li><li> Coloque tecidos em etanol graduado (70%, 95%, 90%, 80%, 70%) (5 min cada) e xileno (5 min). </li><li> Lâminas secas em um exaustor e, em seguida, colocar no instrumento LCM para microdissection. </li><li> Execute microdissecações com o Sistema de LCM de acordo com as instruções do fabricante 24. Uso patologista marcado lâminas como guias para a identificação de focos de cancro da próstata, bem como o tecido normal adjacente. Use o feixe de laser em uma pulsos 10-20 mm de diâmetro com uma potência de 70-90 mW. </li><li> Áreas de captura de interesse com pulsos de laser infravermelho em bonés LCM. Combinar células de 2-5 cápsulas para a extração de miRNA por amostra. Para garantir a integridade de ARN extraído, imediatamente processar células capturadas para extracção miARN. </li><li> Alternativamente, as células lisam em tampão de extracção de miARN (de acordo com o protocolo do fabricante) e STOre lisados ​​a -80 ºC. </li></ol></li><li> miARN Extracção e análises de LCM microdissecadas tecidos <ol><li> Extrair o ARN total a partir de tecidos FFPE microdissected utilizando um kit comercial, seguindo as instruções do fabricante. Nota: O rendimento de RNA de captura a laser miscrodissection é geralmente baixa. Portanto, o RNA é fluido em volumes baixos (20-30 ul) e utilizada para criação de perfil de expressão, utilizando ensaios de expressão de microRNA Taqman seguintes instruções do fabricante (também descrito na seção 2.2). Optimização de ARN de entrada para detecção por PCR em tempo real de miARNs maduras sugere que o 5 ul do ARN eluído é óptima para cada reacção de transcrição reversa miARN-específicos. Como um controle endógeno, RNU48 / RNU24 é usado. Para as reacções de controlo, 2 ul do ARN eluído foi utilizado para a reacção de transcrição reversa. </li></ol></li></ol></li><li> Isolamento de miRNA de cancro da próstata tecidos congelados <ol><li> Homogenhecer tecidos da próstata ressecados congelados por trituração dos tecidos em azoto líquido usando um almofariz e pilão. Transferir tecido homogeneizado para um tubo de microcentrífuga utilizando uma espátula arrefecida. Manter a argamassa / pilão e uma espátula à mesma temperatura por imersão em azoto líquido então homogeneizado de tecido pode ser facilmente transferido. </li><li> Adicionar comercial de isotiocianato de guanidina-fenol reagente (1 mL / 0,1 g de tecido) para o tecido homogeneizado e incubar à temperatura ambiente durante 5 min. Nota: Os tecidos homogeneizados em reagente isotiocianato de guanidina-f enol comercial pode ser armazenado a -80 ° C durante vários meses. </li><li> Adicionar clorofórmio ao homogeneizado (0,2 ml de clorofórmio / mL) e agitar vigorosamente durante 30 segundos. Incubar as amostras à temperatura ambiente durante 3-5 minutos, seguido por centrifugação a 10.000 xg durante 20 min a 4 ºC. </li><li> Transferir a fase aquosa superior a um tubo de 1,5 ml estéril fresco livre de RNase. </li><li> Adicionar um volume igual de álcool isopropílico. Misturar e incubar por 10 miN, à TA, seguido por centrifugação a 12.000 xg durante 20 min a 4 ° C para sedimentar a ARN. </li><li> Aspirar o sobrenadante e lavar o sedimento de ARN com 1 mL de etanol a 70%. Centrifuga-se a 12000 xg durante 10 min a 4 ºC. </li><li> Aspirar cuidadosamente o sobrenadante. Sedimentos de RNA secar à temperatura ambiente durante 5-10 min. Dissolver RNA em 50-100 ul de água livre de nuclease. </li><li> Realizar quantificação de ARN utilizando um espectrofotómetro NanoDrop determinar a integridade de ARN e com um Bioanalyzer. Ajustar a concentração de ARN e 10 ng / ul. Use 10-50 ng RNA para miRNA- reação cDNA específico seguido por análises em tempo real PCR (Seção 2.2). </li></ol></li></ol></li><li> PCR quantitativa em tempo real para análises de expressão de miARN Nota: miARNs maduros ensaio utilizando um protocolo de duas etapas de RT-PCR tal como descrito abaixo. <ol><li> Transcrição Reversa (RT) <ol><li> Realizar a transcrição reversa de ARN a partir de ADNc utilizando um kit de transcrição reversa miARN em conformidade com as instruções do fabricante.Use de 10-50 ng de ARN total com miARN iniciador específico do kit MicroRNA Ensaios e RT. Use RNU48 / RNU24 / RNU6B como controles. Dilui-se ADNc de 1: 5 a 1:10 (dependendo da abundância de miARN analisados) e utilizar na detecção em tempo real de PCR tal como descrito no passo seguinte. </li></ol></li><li> PCR em tempo real para detecção de miRNA maduro <ol><li> Amplificar produtos de PCR de amostras de ADNc utilizando os ensaios MicroRNA com uma mistura mestre universal de modo rápido de acordo com as instruções do fabricante. Normalizar amostras para RNU48 / RNU24 controle / RNU6B. Usar o método comparativo Ct (limiar de ciclo) para calcular as alterações relativas na expressão do gene no rápido tempo real do sistema de PCR. Analisar cada amostra em triplicado. </li></ol></li></ol></li></ol> 3. miRNA expressão análises por hibridação in situ (ISH) <ol><li> Pré-tratamento de tecidos <ol><li> Corte 5 mm de blocos de tecido de câncer de próstata FFPE usando um micrótomo. </li><li&gt; Fix secções de tecido através da incubação das lâminas a 56 ° C durante 1 h. Nota: As lâminas podem ser armazenadas à temperatura ambiente durante várias semanas para análises miARN. </li><li> Deparrafinize os tecidos por imersão das lâminas com xileno (2 x), durante 15 min cada. </li><li> Reidratar os tecidos através da incubação das lâminas durante 5 min cada em etanol graduado (100% (2x), 95%, 90%, 80%, 70%), seguido por água destilada (5 minutos). </li><li> Fixar as lâminas com paraformaldeído a 4% em PBS à temperatura ambiente durante 20 min. </li><li> Lavam-se as lâminas com PBS (2x) à temperatura ambiente durante 5 min cada. </li><li> Tratar as lâminas com 10 ug / ml de Proteinase K a 37 ° C durante 10 min em tampão de proteinase K pré-aquecido (5 mM Tris-HCl pH 7,4, EDTA 1 mM, NaCl a 1 mM). </li><li> Seguindo o tratamento com proteinase-K, enxaguar as lâminas com 0,2% de glicina em PBS durante 30 segundos. </li><li> Lavagem das lâminas em PBS (1x) à temperatura ambiente durante 5 min. </li><li> Fixar as lâminas com paraformaldeído 4% em PBS durante 15 min. </li><li> Lavar as lâminas comPBS durante 5 min. </li></ol></li><li> Hibridização <ol><li> Pré-hibridar as lâminas com solução de pré-hibridação durante 3-4 horas a 55 ° C numa câmara humidificada. Use lenços de laboratório de tecido embebido em formamida 50% / 50% 5x SSC para manter a câmara úmida. </li><li> Use 5 &#39;sondas marcadas com digoxigenina a uma concentração de 20-50 nM em tampão de hibridação. Diluir sonda específica para miRNA (20-50 nM) e sonda de controlo U6 pequeno RNA nuclear (20 nM), aquecer a 90 ºC durante 4 minutos, coloque-o no gelo, e adicionar ao gelo tampão de hibridação frio (2-4 ng / mL ). </li><li> Remoção da solução de pré-hibridação, adicionar solução de hibridação (sonda + tampão de hibridação, 100 ul por slide), incubar durante 12-16 horas a sonda de temperatura específicas de hibridação (temperatura = hibridação sonda-21 Tm ºC). Realizar hibridações em uma câmara humidificada (50% de formamida / 50% 5x SSC). </li></ol></li><li> Lavar Passos <ol><li> Lavam-se as lâminas com 2x SSC durante 10 min a 45 ºC. </li><li> Wash tele desliza com SSC 1,5x durante 10 minutos a 45 ºC. </li><li> Lavar as lâminas com SSC 0,2x (2x) a 37 ºC durante 20 minutos cada. </li><li> Incubar as lâminas com solução de bloqueio 1x durante 1-2 horas à temperatura ambiente </li></ol></li><li> Detecção <ol><li> Incubar as lâminas com 1: 100 PBS diluído anticorpo anti-digoxigenina conjugado AP-para 1-4 horas ou durante a noite a 4 ºC. </li><li> Lavam-se as lâminas com PBS (3x), temperatura ambiente, durante 10 min cada. </li><li> Lavar as lâminas (2x) com fosfatase alcalina de tampão (100 mM Tris pH 9,5, 50 mM de MgCl2, 100 mM de NaCl, 0,1% de Tween-20) à temperatura ambiente durante 5 min cada. </li><li> Incubar as lâminas em substrato BM roxo AP no escuro à temperatura ambiente durante 1-20 horas. </li><li> Lavar as lâminas com PBS contendo 0,1% de Tween-20 e de lavagem (2x) em água. </li><li> Montar as lâminas utilizando uma mídia de montagem aquosas e examinar ao microscópio. </li></ol></li></ol>

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The authors have no financial disclosures.

Neste artigo, descrevemos um fluxo de trabalho simplificado para criação de perfil de expressão de miRNA em FFPE arquivados ou tecidos clínicos de câncer de próstata fresco congelado. No cancro da próstata, diversos estudos sugerem um papel importante na iniciação da microARNs cancro da próstata, progressão e metástase. No entanto, resultados conflitantes são frequentemente obtidos em um determinado miRNA 22 desde a extração de miRNA e analisa métodos diferem amplamente. Em vista da evidência...

O câncer de próstata é um tumor maligno masculino comumente diagnosticado que é uma das principais causas de mortalidade relacionada com câncer entre os homens. Nos EUA, uma 220,800 novos casos estimados e 27.540 mortes serão relatados em 2015 1. O câncer de próstata é uma doença heterogênea com doença altamente variável course- tumores podem ser indolente ou muito agressivo. Um desafio crítico no manejo clínico do câncer de próstata é representada pela inadequação dos atualmente utilizados métodos / biomarcadores para o rastreio da doença, diagnóstico, prognóstico e tratamento 2. Métodos de rastreio atuais incluem antígeno (PSA), em específico da próstata e um exame de toque retal (DRE), seguido de biópsias de próstata 3. Antígeno específico da próstata (PSA) é o biomarcador de câncer de próstata mais amplamente utilizado que revolucionou significativamente a gestão clínica e melhoria das taxas de sobrevivência 4. No entanto, devido às limitações inerentes de PSA incluindo lack de especificidade, o rastreio baseada em PSA levou a mais de diagnóstico e tratamento ao longo da doença. Em vista disso, os esforços intensivos estão sendo direcionados para a busca de biomarcadores de câncer de próstata alternativos, especialmente aqueles que podem prever a agressividade da doença e tomar melhores decisões de tratamento 4,5. Ao longo dos últimos anos, microRNAs (miRNAs) surgiram como promissoras biomarcadores de câncer de próstata suplentes. Os microRNAs (miRNAs) constituem uma classe evolutivamente conservadas de pequenos RNAs não-codificantes que suprimem a expressão gênica pós-transcricionalmente através de interacções específicas para a sequência com os 3&#39;- não traduzidas (UTRs regiões) de alvos de RNAm cognatos. Estima-se que&gt; 60% de mRNAs são alvos de miARNs 6 conservada. miRNA genes estão localizados em regiões intergénicas ou dentro de exões intrões ou de proteína / proteína não-codificantes genes 7. Estes genes são preferencialmente transcrito pela ARN-polimerase II em primamiRNAs ry (pri-miRNAs, vários quilobases de comprimento) que as estruturas secundárias de loop haste em forma de forma hairpin. Estes miRNAs pri-são transformados em miRNAs precursoras (pré-miRNAs, 60-75 nucleótidos de comprimento) que são exportados para o citoplasma e novamente transformadas em miRNAs maduros (18-25 nucleótidos de comprimento) 8-10. miARNs regular processos celulares chave, incluindo a proliferação, desenvolvimento, diferenciação e apoptose 11. Estudos sugerem uma desregulação generalizada de perfis de expressão de miARN em várias malignidades humanas, incluindo cancro da próstata 12-15. perfis de expressão de miARN têm sido relatados para ser amplamente desregulado no cancro da próstata primário e metastático. MiRNA expressão alterada têm sido relacionados com a progressão do câncer de próstata, agressividade e recorrência destacando o potencial prognóstico de miRNAs 12,14,16-19. Um crescente corpo de evidências indicam que os miRNAs desempenham papéis importantes mecanicistas na iniciação do câncer de próstata, o desenvolvimento, o progressoião e metástase. No geral, os miRNAs estão emergindo como biomarcadores alternativas promissoras para o diagnóstico e prognóstico do câncer de próstata que podem distinguir entre tecidos e ajuda normais e cancerosas na estratificação de tumores de próstata 12. Além disso, os miRNAs são alvos importantes para o desenvolvimento de terapias eficazes contra o câncer de próstata 20. Devido ao seu pequeno tamanho e resistência à actividade da RNase endógena, miARNs biomarcadores são estáveis ​​que podem ser facilmente detectadas em tecidos fixados em formalina 21 e 22 em biópsias da próstata. Além disso, os perfis de expressão miARNs foram comparadas em tecidos congelados e fixados em formalina e foram encontrados para ser fortemente correlacionada 21. No entanto, a expressão miRNA perfis em tecidos clínicos de câncer de próstata é muitas vezes um desafio devido à heterogeneidade do tumor, erros de amostragem, a contaminação do estroma etc. O desenvolvimento de miRNAs como biomarcadores eficazes para o cancro da próstata fortemente reliES na sua detecção precisa em tecidos clínicos. Aqui nós descrevemos um fluxo de trabalho simplificado utilizado em nosso laboratório para a expressão miRNA de perfis FFPE arquivado ou espécimes clínicos de câncer de próstata fresco congelado. Nós empregar uma combinação de PCR quantitativo em tempo real e a hibridização in situ para miARN análises de amostras clínicas, com a ex-rendendo mais informações quantitativas e o último para visualizar a expressão diferencial de biomarcadores potenciais miARN em uma variedade de tecidos. Dentro desse fluxo de trabalho, otimizar as metodologias existentes para a extração de miRNA de FFPE e tecidos da próstata congelados, analisa expressão por Taqman-sonda baseada miRNA RT-PCR e miRNA in situ utilizando técnica de hibridização de ácidos nucleicos bloqueados (LNA) à base de sondas 23. Sondas à base de LNA oferecem maior sensibilidade e especificidade em relação ao ADN ou RNA-sondas base e permite a detecção robusta de todas as seqüências de miRNA, independentemente do seu conteúdo GC e também permitir que discriminação de famílias de miARN. Nosso protocolo miARN ISH optimizada pode ser aplicada a lâminas de tecido de cancro da próstata ou cancro da próstata Tissue microarrays (TMA), com este último que oferece o potencial para acelerar miARN descoberta biomarcador.

<table><tbody><tr><td>Microtome</td><td>Leica Biosystems&amp;nbsp;</td><td>RM2255</td><td></td></tr><tr><td>Arcturus Autopix for LCM</td><td>Arcturus/ Life Technologies</td><td>LCM1621/LCM1110</td><td>Alternatively, Arcutus Xt system from Life Technolgies can be used.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>CapSure Macro LCM Caps</td><td>Life Technologies</td><td>LCM0211</td><td></td></tr><tr><td>miRNeasy FFPE Kit&amp;nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>217504</td><td></td></tr><tr><td>7500 Fast Real-time PCR System&amp;nbsp;</td><td>Applied Biosystems/ Life Technologies</td><td>4351106</td><td></td></tr><tr><td>Taqman MicroRNA Reverse Transcription kit&amp;nbsp;</td><td>Applied Biosystems/ Life Technologies</td><td>4366596</td><td></td></tr><tr><td>Taqman Fast Universal PCR master mix&amp;nbsp;</td><td>Applied Biosystems/ Life Technologies</td><td>4352042</td><td></td></tr><tr><td>DIG labeled LNA probe for U6</td><td>Exiqon</td><td>99002-01</td><td></td></tr><tr><td>BM Purple AP substrate</td><td>Roche</td><td>11442074001</td><td></td></tr><tr><td>Pre-hybridization solution&amp;nbsp;</td><td>Biochain</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.biochain.com/coa/K21910XXCA.pdf&quot;&gt;K2191050-1&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Hybridization solution&amp;nbsp;</td><td>Biochain</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.biochain.com/coa/K21910XXCA.pdf&quot;&gt;K2191050-2&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Blocking solution&amp;nbsp;</td><td>Biochain</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.biochain.com/coa/K21910XXCA.pdf&quot;&gt;K2191050-8&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>AP-conjugated anti-digoxigenin antibody</td><td>Biochain</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.biochain.com/coa/K21910XXCA.pdf&quot;&gt;K2191050-7&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Aqueous mounting media&amp;nbsp;</td><td>Vector Laboratories&amp;nbsp;</td><td>H-5501&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Trizol (guanidine isothiocyanate-phenol reagent)&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>&lt;a href=&quot;https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15596018&quot;&gt;15596-018&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Harris hematoxylin</td><td>Statlab</td><td>SL200</td><td></td></tr><tr><td>Eosin&amp;nbsp;</td><td>Statlab</td><td>SL201&amp;nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

mirna expression analyses in prostate cancer clinical tissues

Um desafio crucial no cancro da próstata (PCA) manejo clínico é representada pela inadequação dos biomarcadores atualmente utilizados para o rastreio da doença, diagnóstico, prognóstico e tratamento. Nos últimos anos, microARNs (miARNs) surgiram como biomarcadores alternativos promissores para o diagnóstico e prognóstico do cancro da próstata. No entanto, o desenvolvimento de miARNs como biomarcadores eficazes para o cancro da próstata depende fortemente de sua detecção precisa em tecidos clínicos. analisa miRNA em amostras clínicas de câncer de próstata é muitas vezes um desafio devido à heterogeneidade do tumor, erros de amostragem, a contaminação do estroma etc. O objetivo deste artigo é descrever um fluxo de trabalho simplificado para análises de miRNA em FFPE arquivado ou espécimes clínicos de câncer de próstata fresco congelado usando uma combinação de -PCR quantitativo em tempo real (RT-PCR) e hibridação in situ (ISH). Dentro desse fluxo de trabalho, otimizar as metodologias existentes para a extração de miRNA de FFPE e congelado tissu próstataes e expressão análises por sonda Taqman-base miRNA RT-PCR. Além disso, nós descrevemos um método otimizado para ISH analisa detecção formiRNA em tecidos da próstata, utilizando ácido nucleico bloqueado (LNA) - sondas de base. Nosso protocolo miARN ISH optimizada pode ser aplicada a lâminas de tecido de cancro da próstata ou cancro da próstata Tissue microarrays (TMA).

Perfil de expressão de miR-203 em amostras clínicas LCM cancro da próstata primário por RT-PCR análises (Figura 1) Análises de RT-PCR da expressão relativa de miR-203 em LCM tecidos de cancro da próstata primário e as regiões adjacentes normais correspondentes foi realizada como descrito no Saini et ai. RNU48 15 foi utilizada como um controlo. A tabela abaixo resume a expressão de miR-203 em relação a tecidos de tumor de cancro da próstata r...

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miRNA Expression Analyses in Prostate Cancer Clinical Tissues

Here we describe a simplified protocol for microRNA (miRNA) expression analyses in archived Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded (FFPE) or fresh frozen prostate cancer (PCa) clinical tissues employing quantitative real-time PCR (RT-PCR) and in situ hybridization (ISH).

As análises de expressão de miRNA no câncer de próstata tecidos clínicos

A critical challenge in prostate cancer (PCa) clinical management is posed by the inadequacy of currently used biomarkers for disease screening, ...

mirna-expression-analyses-in-prostate-cancer-clinical-tissues

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Medicine

10.8K visualizações.  University of California San Francisco. Here we describe a simplified protocol for microRNA (miRNA) expression analyses in archived Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded (FFPE) or fresh frozen prostate cancer (PCa) clinical tissues employing quantitative real-time PCR (RT-PCR) and in situ hybridization (ISH).

Vídeo: miRNA Expression Analyses in Prostate Cancer Clinical Tissues

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR (qPCR)

MicroRNAs (miRNAs) are single-stranded, 18&#x2013;24 nucleotide long, non-coding RNA molecules. They are involved in virtually every cellular process including development1, apoptosis2, and cell cycle regulation3. MiRNAs are estimated to regulate the expression of 30% to 90% of human genes4 by binding to their target messenger RNAs (mRNAs)5. Widespread dysregulation of miRNAs has been reported in various diseases and cancer subtypes6. Due to their prevalence and unique structure, these small molecules are likely to be the next generation of biomarkers, therapeutic agents and/or targets.
Methods used to investigate miRNA expression include SYBR green I dye- based as well as Taqman-probe based qPCR. If miRNAs are to be effectively used in the clinical setting, it is imperative that their detection in fresh and/or archived clinical samples be accurate, reproducible, and specific. qPCR has been widely used for validating expression of miRNAs in whole genome analyses such as microarray studies7. The samples used in this protocol were from patients who underwent radical prostatectomy for clinically localized prostate cancer; however other tissues and cell lines can be substituted in. Prostate specimens were snap-frozen in liquid nitrogen after resection. Clinical variables and follow-up information for each patient were collected for subsequent analysis8.
Quantification of miRNA levels in prostate tumor samples. The main steps in qPCR analysis of tumors are: Total RNA extraction, cDNA synthesis, and detection of qPCR products using miRNA-specific primers. Total RNA, which includes mRNA, miRNA, and other small RNAs were extracted from specimens using TRIzol reagent. Qiagen's miScript System was used to synthesize cDNA and perform qPCR (Figure 1). Endogenous miRNAs are not polyadenylated, therefore during the reverse transcription process, a poly(A) polymerase polyadenylates the miRNA. The miRNA is used as a template to synthesize cDNA using oligo-dT and Reverse Transcriptase. A universal tag sequence on the 5' end of oligo-dT primers facilitates the amplification of cDNA in the PCR step. PCR product amplification is detected by the level of fluorescence emitted by SYBR Green, a dye which intercalates into double stranded DNA. Specific miRNA primers, along with a Universal Primer that binds to the universal tag sequence will amplify specific miRNA sequences. 
The miScript Primer Assays are available for over a thousand human-specific miRNAs, and hundreds of murine-specific miRNAs. Relative quantification method was used here to quantify the expression of miRNAs. To correct for variability amongst different samples, expression levels of a target miRNA is normalized to the expression levels of a reference gene. The choice of a gene on which to normalize the expression of targets is critical in relative quantification method of analysis. Examples of reference genes typically used in this capacity are the small RNAs RNU6B, RNU44, and RNU48 as they are considered to be stably expressed across most samples. In this protocol, RNU6B is used as the reference gene.

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR qPCR

Quantitative Real Time polymerase chain reaction (qPCR) is a rapid and sensitive method to investigate the expression levels of various microRNA (miRNA) molecules in tumor samples. Using this method expression of hundreds of different miRNA molecules can be amplified, quantified, and analyzed from the same cDNA template.

Detecção MicroRNA em tumores de próstata por Quantitative PCR em tempo real (qPCR)

MicroRNAs (miRNAs) are single-stranded, 18&#x2013;24 nucleotide long, non-coding RNA molecules. They are involved in virtually every cellular process ...

Medicina

Sequencing Small Non-coding RNA from Formalin-fixed Tissues and Serum-derived Exosomes from Castration-resistant Prostate Cancer Patients

Ablation of androgen receptor (AR) signaling by androgen deprivation is the goal of the first line of therapy for prostate cancer that initially results in cancer regression. However, in a significant number of cases, the disease progresses to advanced, castration-resistant prostate cancer (CRPC), which has limited therapeutic options and is often aggressive. Distant metastasis is mostly observed at this stage of the aggressive disease. CRPC is treated by a second generation of AR pathway inhibitors that improve survival initially, followed by the emergence of therapy resistance. Neuroendocrine prostate cancer (NEPC) is a rare variant of prostate cancer (PCa) that often develops as a result of therapy resistance via a transdifferentiation process known as neuroendocrine differentiation (NED), wherein PCa cells undergo a lineage switch from adenocarcinomas and show increased expression of neuroendocrine (NE) lineage markers. In addition to the genomic alterations that drive the progression and transdifferentiation to NEPC, epigenetic factors and microenvironmental cues are considered essential players in driving disease progression. This manuscript provides a detailed protocol to identify the epigenetic drivers (i.e., small non-coding RNAs) that are associated with advanced PCa. Using purified microRNAs from formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) metastatic tissues and corresponding serum-derived extracellular vesicles (EVs), the protocol describes how to prepare libraries with appropriate quality control for sequencing microRNAs from these sample sources. Isolating RNA from both FFPE and EVs is often challenging because most of it is either degraded or is limited in quantity. This protocol will elaborate on different methods to optimize the RNA inputs and cDNA libraries to yield most specific reads and high-quality data upon sequencing.

Therapy resistance often develops in patients with advanced prostate cancer, and in some cases, cancer progresses to a lethal subtype called neuroendocrine prostate cancer. Assessing the small non-coding RNA-mediated molecular changes that facilitate this transition would allow better disease stratification and identification of causal mechanisms that lead to development of neuroendocrine prostate cancer.

Sequenciamento de RNA não codificador de tecidos reparados em formalina e exossomos derivados do soro de pacientes com câncer de próstata resistentes à castração

Ablation of androgen receptor (AR) signaling by androgen deprivation is the goal of the first line of therapy for prostate cancer that initially results ...

Pesquisa do câncer

Microarray-based Identification of Individual HERV Loci Expression: Application to Biomarker Discovery in Prostate Cancer

The prostate-specific antigen (PSA) is the main diagnostic biomarker for prostate cancer in clinical use, but it lacks specificity and sensitivity, particularly in low dosage values1&#8203;&#8203;. &#8216;How to use PSA&#39; remains a current issue, either for diagnosis as a gray zone corresponding to a concentration in serum of 2.5-10 ng/ml which does not allow a clear differentiation to be made between cancer and noncancer2 or for patient follow-up as analysis of post-operative PSA kinetic parameters can pose considerable challenges for their practical application3,4. Alternatively, noncoding RNAs (ncRNAs) are emerging as key molecules in human cancer, with the potential to serve as novel markers of disease, e.g. PCA3 in prostate cancer5,6 and to reveal uncharacterized aspects of tumor biology. Moreover, data from the ENCODE project published in 2012 showed that different RNA types cover about 62% of the genome. It also appears that the amount of transcriptional regulatory motifs is at least 4.5x higher than the one corresponding to protein-coding exons. Thus, long terminal repeats (LTRs) of human endogenous retroviruses (HERVs) constitute a wide range of putative/candidate transcriptional regulatory sequences, as it is their primary function in infectious retroviruses. HERVs, which are spread throughout the human genome, originate from ancestral and independent infections within the germ line, followed by copy-paste propagation processes and leading to multicopy families occupying 8% of the human genome (note that exons span 2% of our genome). Some HERV loci still express proteins that have been associated with several pathologies including cancer7-10. We have designed a high-density microarray, in Affymetrix format, aiming to optimally characterize individual HERV loci expression, in order to better understand whether they can be active, if they drive ncRNA transcription or modulate coding gene expression. This tool has been applied in the prostate cancer field (Figure 1).

Human endogenous retroviruses (HERV), which occupy 8% of the human genome, retain scarce coding capacities but a hundred thousand long terminal repeats (LTRs). A custom Affymetrix microarray was designed to identify individual HERV locus expression and was used on prostate cancer tissues as a proof of concept for future clinical studies.

Identificação baseada em Microarray de Individual HERV Loci Expressão: Aplicação a descoberta de biomarcadores em câncer de próstata

The prostate-specific antigen (PSA) is the main diagnostic biomarker for prostate cancer in clinical use, but it lacks specificity and sensitivity, ...

An Orthotopic Murine Model of Human Prostate Cancer Metastasis

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but rather the formation of distinct metastasis, the ability to effectively model this progression pre-clinically is of high value. In this model, cells are directly implanted into the ventral lobe of the prostate in Balb/c athymic mice, and allowed to progress for 4-6 weeks. At experiment termination, several distinct endpoints can be measured, such as size and molecular characterization of the primary tumor, the presence and quantification of circulating tumor cells in the blood and bone marrow, and formation of metastasis to the lung. In addition to a variety of endpoints, this model provides a picture of a cells ability to invade and escape the primary organ, enter and survive in the circulatory system, and implant and grow in a secondary site. This model has been used effectively to measure metastatic response to both changes in protein expression as well as to response to small molecule therapeutics, in a short turnaround time.

This orthotopic model of human prostate cancer allows for quantification of tumor size, circulating tumor cells, and formation of distinct metastasis to the lung. As cells must escape the primary organ, enter the blood stream, and implant into a secondary site, this model effectively recapitulates the scenario in humans.

Um Modelo murino de próstata humana Metástase Ortotópico

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of  human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but  ...

Profiling of Estrogen-regulated MicroRNAs in Breast Cancer Cells

Estrogen plays vital roles in mammary gland development and breast cancer progression. It mediates its function by binding to and activating the estrogen receptors (ERs), ER&#945;, and ER&#946;. ER&#945; is frequently upregulated in breast cancer and drives the proliferation of breast cancer cells. The ERs function as transcription factors and regulate gene expression. Whereas ER&#945;&#39;s regulation of protein-coding genes is well established, its regulation of noncoding microRNA (miRNA) is less explored. miRNAs play a major role in the post-transcriptional regulation of genes, inhibiting their translation or degrading their mRNA. miRNAs can function as oncogenes or tumor suppressors&#160;and are also promising biomarkers. Among the miRNA assays available, microarray and quantitative real-time polymerase chain reaction (qPCR) have been extensively used to detect and quantify miRNA levels. To identify miRNAs regulated by estrogen signaling in breast cancer, their expression in ER&#945;-positive breast cancer cell lines were compared before and after estrogen-activation using both the &#181;Paraflo-microfluidic microarrays and Dual Labeled Probes-low density arrays. Results were validated using specific qPCR assays, applying both Cyanine dye-based and Dual Labeled Probes-based chemistry. Furthermore, a time-point assay was used to identify regulations over time. Advantages of the miRNA assay approach used in this study is that it enables a fast screening of mature miRNA regulations in numerous samples, even with limited sample amounts. The layout, including the specific conditions for cell culture and estrogen treatment, biological and technical replicates, and large-scale screening followed by in-depth confirmations using separate techniques, ensures a robust detection of miRNA regulations,&#160;and eliminates false positives and other artifacts. However, mutated or unknown miRNAs, or regulations at the primary and precursor transcript level, will not be detected. The method presented here represents a thorough investigation of estrogen-mediated miRNA regulation.

Molecular signaling through both estrogen and microRNAs are critical in breast cancer development and growth. Estrogen activates the estrogen receptors, which are transcription factors. Many transcription factors can regulate the expression of microRNAs, and estrogen-regulated microRNAs can be profiled using different large-scale techniques.

Profiling de MicroRNAs estrogênio regulados em células do cancro da mama

Estrogen plays vital roles in mammary gland development and breast cancer progression. It mediates its function by binding to and activating the estrogen ...

TMEM200A: Um novo oncogene que regula EMT e PI3K/AKT no câncer gástrico

Multiomics Analysis of TMEM200A as a Pan-Cancer Biomarker

The transmembrane protein, TMEM200A, is known to be associated with human cancers and immune infiltration. Here, we assessed the function of TMEM200A in common cancers by multiomics analysis and used in vitro cell cultures of gastric cells to verify the results. The expression of TMEM200A in several human cancer types was assessed using the RNA-seq data from the UCSC Xena database. Bioinformatic analysis revealed a potential role of TMEM200A as a diagnostic and prognostic biomarker. 
Cultures of normal gastric and cancer cell lines were grown and TMEM200A was knocked down. The expression levels of TMEM200A were measured by using quantitative real-time polymerase chain reaction and western blotting. In vitro loss-of-function studies were then used to determine the roles of TMEM200A in the malignant behavior and tumor formation of gastric cancer (GC) cells. Western blots were used to assess the effect of the knockdown on epithelial-mesenchymal transition (EMT) and PI3K/AKT signaling pathway in GC. Bioinformatic analysis showed that TMEM200A was expressed at high levels in GC. 
The proliferation of GC cells was inhibited by TMEM200A knockdown, which also decreased vimentin, N-cadherin, and Snai proteins, and inhibited AKT phosphorylation. The PI3K/AKT signaling pathway also appeared to be involved in TMEM200A-mediated regulation of GC development. The results presented here suggest that TMEM200A regulates the tumor microenvironment by affecting the EMT. TMEM200A may also affect EMT through PI3K/AKT signaling, thus influencing the tumor microenvironment. Therefore, in pan-cancers, especially GC, TMEM200A may be a potential biomarker and oncogene.

Autor em destaque: Revelando marcadores relacionados à família de proteínas transmembranares no câncer gástrico e implicações para terapias direcionadas 

Here, a protocol is presented in which multiple bioinformatic tools are combined to study the biological functions of TMEM200A in cancer. In addition, we also experimentally validate the bioinformatics predictions.

Análise Multiômica de TMEM200A como Biomarcador Pan-Câncer

The transmembrane protein, TMEM200A, is known to be associated with human cancers and immune infiltration. Here, we assessed the function of TMEM200A in ...

Optimization of a Multiplex RNA-based Expression Assay Using Breast Cancer Archival Material

Nucleic acid degradation in archival tissue, tumor heterogeneity, and a lack of fresh frozen tissue specimens can negatively impact cancer diagnostic services in pathology laboratories worldwide. Gene amplification and expression diagnostic testing using archival material or material that requires transportation to servicing laboratories, needs a more robust and accurate test adapted to current clinical workflows. Our research team optimized the use of Invitrogen&#8482; QuantiGene&#8482; Plex Assay (Thermo Fisher Scientific) to quantify RNA in archival material using branched-DNA (bDNA) technology on Luminex xMAP&#174; magnetic beads. The gene expression assay described in this manuscript is a novel, quick, and multiplex method that can accurately classify breast cancer into the different molecular subtypes, omitting the subjectivity of interpretation inherent in imaging techniques. In addition, due to the low input of material required, heterogeneous tumors can be laser microdissected using Hematoxylin and Eosin (H&#38;E) stained sections. This method has a wide range of possible applications including tumor classification with diagnostic potential and measurement of biomarkers in liquid biopsies, which would allow better patient management and disease monitoring. In addition, the quantitative measurement of biomarkers in archival material is useful in oncology research with access to libraries of clinically-annotated material, in which retrospective studies can validate potential biomarkers and their clinical outcome correlation.

Nucleic acid degradation in archival tissue, tumor heterogeneity, and a lack of fresh frozen tissue specimens can negatively impact cancer diagnostic services in pathology laboratories worldwide. This manuscript describes the optimization of a panel of biomarkers using a multiplex magnetic bead assay to classify breast cancers.

Otimização de um ensaio de expressão baseada em RNA Multiplex usando Material de arquivo de câncer de mama

Nucleic acid degradation in archival tissue, tumor heterogeneity, and a lack of fresh frozen tissue specimens can negatively impact cancer diagnostic ...

Bioengenharia

Laser-capture Microdissection of Human Prostatic Epithelium for RNA Analysis

The prostate gland contains a heterogeneous milieu of stromal, epithelial, neuroendocrine and immune cell types. Healthy prostate is comprised of fibromuscular stroma surrounding discrete epithelial-lined secretory lumens and a very small population of immune and neuroendocrine cells. In contrast, areas of prostate cancer have increased dysplastic luminal epithelium with greatly reduced or absent stromal population. Given the profound difference between stromal and epithelial cell types, it is imperative to separate the cell types for any type of downstream molecular analysis. Despite this knowledge, the bulk of gene expression studies compare benign prostate to cancer without micro-dissection, leading to stromal bias in the benign samples. Laser-capture micro-dissection (LCM) is an effective method to physically separate different cell types from a specimen section. The goal of this protocol is to show that RNA can be successfully isolated from LCM-collected human prostatic epithelium and used for downstream gene expression studies such as RT-qPCR and RNAseq.

The goal of this protocol is to use laser-capture micro-dissection as an effective method to isolate pure populations of cell types from heterogeneous prostate tissues for downstream RNA analysis.

As análises de expressão de miRNA no câncer de próstata tecidos clínicos

Resumo

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Detecção MicroRNA em tumores de próstata por Quantitative PCR em tempo real (qPCR)

Sequenciamento de RNA não codificador de tecidos reparados em formalina e exossomos derivados do soro de pacientes com câncer de próstata resistentes à castração

Identificação baseada em Microarray de Individual HERV Loci Expressão: Aplicação a descoberta de biomarcadores em câncer de próstata

Um Modelo murino de próstata humana Metástase Ortotópico

Profiling de MicroRNAs estrogênio regulados em células do cancro da mama

Análise Multiômica de TMEM200A como Biomarcador Pan-Câncer

Análise Multiômica de TMEM200A como Biomarcador Pan-Câncer

Análise Multiômica de TMEM200A como Biomarcador Pan-Câncer

Otimização de um ensaio de expressão baseada em RNA Multiplex usando Material de arquivo de câncer de mama

Captura de Laser Microdissection de Próstata Humano Epithelium para Análise de RNA