We are grateful to the past and present members of the laboratory, in particular Urszula Liwak, for critical discussion regarding polysome profiling protocols and sharing of data. This work was supported by operating grants from the Canadian institutes of Health Research, Cancer Research Society, and the National Science and Engineering Research Council of Canada to MH. MDF was supported by the Vanier Canada Graduate Scholarship Doctoral Award and the Ontario Graduate Scholarship, and this work forms part of her Ph.D. dissertation.

<ol>
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T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+profiling:+new+views+of+translation,+from+single+codons+to+genome+scale.">Ribosome profiling: new views of translation, from single codons to genome scale.</a> Nat Rev Genet. 15 (3), 205-213 (2014).</li><li>Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ribosome+profiling+strategy+for+monitoring+translation+in+vivo+by+deep+sequencing+of+ribosome-protected+mRNA+fragments.">The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments.</a> Nat Protoc. 7 (8), 1534-1550 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Perfilamento polissomal é uma técnica poderosa que permite a quantificação do estado da tradução de transcritos específicos sob diferentes condições de tratamento. É uma técnica muito simples, em princípio, no entanto, requer várias etapas de execução, alguns dos quais são críticos para produzir bons perfis de polissomas. Estes passos principais são: 1) uso de produtos químicos RNase e de plástico, 2) a preparar bons gradientes de sacarose (em nossa experiência de 10-50% gradientes de sacarose funcionar melhor para resolver de forma eficiente 40 / 60S subunidades e mRNAs com ribossomos ligadas), e 3 ) utilizando células que estão em crescimento exponencial e não confluentes mais do que 80%, a fim de capturar as maiores taxas de tradução. Este último passo deve ser tomado em consideração quando se faz tratamentos celulares longos, tais como o knockdown ou a sobre-expressão do gene, de modo que a quantidade de células a placa será uma função da quantidade de células vão ser confluentes no final do estudo. Nos resultados da presented aqui, polissoma análise do perfil era uma ferramenta importante para avaliar o papel de PDCD4 na regulação tradução dos IRES-abrigando mRNAs XIAP e Bcl-xL 12. O fato de que nós não observamos qualquer mudança nos perfis gerais polissomas sobre PDCD4 knock-down (Figura 1B) permitiu-nos concluir que PDCD4 não prejudicou tradução celular mundial nas condições do experimento. A seguir, utilizaram a análise de RT-qPCR para determinar a distribuição do XIAP e Bcl-xL ARNm em células tratadas com PDCD4 ou siRNAs de controlo. qPCR é um método de escolha para a análise de perfis de polissomas, em oposição ao padrão de RT-PCR ou Northern blotting, uma vez que permite uma análise quantitativa ao invés de semi-quantitativa da distribuição de ARNm e para a detecção de mudanças subtis na eficiência de translação entre os tratamentos. Usando esta técnica, fomos capazes de mostrar que a distribuição dos XIAP e Bcl-xL mRNAs (expresso como uma percentagem do total de mRNA-alvo em todo o gradient) foi significativamente deslocado para polirribossomas pesados ​​(mRNAs com um grande número de ribossomas associados com eles) após PDCD4 knock-down (Figura 1D, E), indicando, assim, um aumento na tradução destes mRNAs. Isto foi ainda confirmado por um aumento em XIAP e Bcl-xL, mas os níveis de proteína não nos seus níveis de ARN de estado estacionário (Figura 1F, G). É importante notar que a distribuição de polissoma a variante não-IRES de XIAP permaneceu inalterada entre as células tratadas e não tratadas (Figura 1C). Em alternativa, a eficiência de translação pode ser apresentada como uma proporção do teor de ARNm em polissomas (geralmente fracções 5 a 10) contra monosomes (geralmente frações 2-4) 14. O uso de controles durante todo o protocolo é importante para validar qualquer polissoma perfis resultado, como picos observados a partir de leituras de absorbância a 254 nm não pode em seu próprio ser atribuído ao RNA ribossomal (detergentes, tal como Triton X-100 absorvem fortemente nesta regi do espectro e pode obscurecer 40 / 60S picos no topo do gradiente). Gradientes em branco sem ligado e / ou com tampão de lisado precisa ser executado para determinar a contribuição relativa dos buffers para a absorvância a 254 nm. Artefactual estruturas de ordem superior também pode levar a interpretações errôneas dos polissomos onde há de fato nenhum (por exemplo, &quot;pseudo-polissomos&quot; 20). Sequestrar de magnésio (usado durante todo o procedimento para estabilizar ribossomas 80S) com o catião bivalente quelante EDTA adicionado ao lisados ​​e para o buffer de gradiente (20 mM durante 15 min) vai provocar a separação do ribossoma nos seus componentes pequenos (40S) e grandes (60S subunidades). Assim, se os picos de absorvância registados a 260 nm polissomas são, de facto, o tratamento com EDTA vai entrar em colapso o perfil de tal modo que uma única máxima vai ser observada perto do topo do gradiente que corresponde a libertar o ARNm e unidades ribossomais (dados não mostrados). Coincidentecom colapso induzido pelo EDTA do perfil, todos os alvos específicos analisados ​​por qPCR agora deve ser encontrada no topo do gradiente. O número de ribossomas associados a um ARNm não é sempre um indicador de quão eficiente de ARNm em particular que está a ser traduzida. Na verdade, existem contextos específicos em que a tradução se torna ativo em polissomos paralisadas 21,22 que o leitor deve estar ciente. Determinar se ou não transcritos estão activamente envolvidos com a maquinaria de tradução pode ser realizado por a) tratar a amostra com puromicina, que ao contrário de EDTA, faz com que &quot;run-off &#39;de ribossomas que estão activamente a translocação através de um mRNA, ou b) o tratamento da amostra com homoharringtonina que inibe a translocação de apenas a primeira ribossoma no codão de iniciação, de novo causando &#39;off-correr &quot;de quaisquer ribossomas translocar a jusante. O uso dos transcritos de controlo para análise qPCR também é crítico. A selecção de transcritos que não são afectados pelas diferentes condições de tratamento, tais como alguns genes de manutenção (GAPDH, actina, tubulina, nucleolina), ARNm ribossómicos, RPL13A (18S) ou, neste caso, a variante não-IRES do IRES de XIAP, é importante na verificar se o efeito do tratamento sobre a tradução é específica ou generalizada. Estes transcritos de controlo pode ser utilizado para normalizar a distribuição dos mRNAs analisada como foi feito aqui (XIAP e Bcl-xL mRNAs foram normalizadas para GAPDH mRNA e expresso como uma percentagem do conteúdo total de ARNm representado pela soma do teor de ARNm em cada fracção ) ou, alternativamente, os ARNm alvo e de controlo podem ser expressos como valores absolutos e mostrada separadamente. análise qPCR dos lisados ​​de entrada (geralmente 10% do volume total) é uma outra etapa que vai controlar a distribuição de mRNAs específicos. Idealmente, o conteúdo de um transcrito de ARNm específico no lisado de entrada deve ser comparável à soma do teor de ARNm em todas as 10 fracções analisadas. Finalmente, Um passo opcional para controlar o fenol: clorofórmio passo de extracção é a espiga cada fracção com um ARNm de polissoma repórter transcrito in vitro (tal como CAT, cloranfenicol acetil-transferase) que irá ser subsequentemente quantificados por qPCR e pode até mesmo ser utilizados para normalizar o dados 14. Como acontece com qualquer técnica, o profiling polissoma apresenta algumas limitações. O facto de normalmente um mínimo de 10 fracções (turnos de mais subtis em termos de eficiência de tradução podem exigir 20 ou mais) precisam de ser recolhido, a fim de ter distribuições de polissomas agradáveis ​​torna este passo limitante, no sentido de que apenas um máximo de 4 amostras pode ser analisados ​​de cada vez para ser capaz de lidar confortavelmente extracção de ARN e análise de qPCR de 40 amostras e os controlos de entrada 4 ao mesmo tempo. O tamanho da amostra pode facilmente adicionar até com quantos transcrições devem ser analisados ​​e quantos qPCR replica para fazer, e isso pode ser caro. Outra limitação de um polissomal profiling uma base-qPCRnálise é que ela só pode ser feito em uma abordagem baseada no candidato (onde os transcritos para serem analisados ​​são conhecidos de antemão) e não pode ser aplicado para a análise de todo o genoma de tradução. No entanto, no início do século 21, os investigadores começaram a interrogar o seu RNA polissomal em nível genômico usando DNA microarrays 15 e, mais recentemente, com a próxima geração de sequenciamento 16,17. Nesta abordagem poderosa, perfilamento polissomal é realizado como descrito no presente protocolo, excepto que em vez de efectuar a análise de qPCR de fracções individuais, monosomes fracções (geralmente de fracções 2-4) e polissomas fracções (normalmente fracções) são reunidas em conjunto e variações globais na tradução analisados por microarray de DNA ou todo o genoma RNA seqüenciamento. Assim, com esta abordagem, é possível avaliar todos os mRNAs cuja distribuição turnos de polissomos para monosomes (diminuição na tradução), ou vice-versa (aumento na tradução) após um tratamento específicomento. Validação e quantificação de ARNm específico polissomas distribuição pode, então, ser feito por qPCR. Um uso ainda mais poderoso do princípio da polissomal perfil é profiling ribossomo. Nova prorrogação alto rendimento desta técnica foi relatado recentemente que permite o monitoramento simultâneo de centenas de polissomas frações 23. Isso proporciona uma clara vantagem quando sondagem eficiência de translação de coleções mutantes ou em telas de RNAi em larga escala. Profiling ribossomo é uma técnica que aproveita a próxima geração de sequenciamento para mapear fragmentos de RNA protegidas por ribossomos (pegadas ribossomo) envolvidos na síntese de proteínas 24,25. Nesta técnica, a translocação do ribossoma pode ser inibida com ciclo-heximida (reversíveis) ou emetina (irreversível), seguida por lise celular e digestão de RNase para produzir uma população de pegadas ao ribossoma. Os ribossomas são enriquecidos, o ARN total é isolado, e contaminando ribossomal e RNA ribossomal mitocondrial é removido.Pegadas de RNA de aproximadamente 26-28 nucleotídeos são isolados, transcrição reversa, convertida em uma biblioteca de cDNA e seqüenciados 26. Ao contrário de perfis polissoma padrão, esta abordagem não só identifica mRNAs específicos que são regulados em translação, mas também fornece informações mRNA específico da resolução no códon tais como a ocupação exata e densidade dos ribossomos ao longo de uma transcrição específica. Isto é particularmente interessante para mRNAs com modos específicos de tradução, como mRNAs IRES-abrigam, como poderia dar mais informações sobre onde na transcrição ribossomo-recruitment está ocorrendo.

Regulação da síntese de proteína (tradução) é um processo celular fundamental que está intimamente ligada à sobrevivência celular. Dado que a tradução consome mais de 50% da energia da célula, não é de estranhar que a tradução é rigidamente controlado e que as perturbações na tradução não são bem tolerados. Por outro lado, muitos processos celulares aberrantes que requerem maquinaria de tradução e a saída da tradução (isto é, proteoma) tem de ser modificado. Este é frequentemente o caso em vários estados de resposta ao estresse e doenças, e é provavelmente o melhor exemplificado no câncer. Uma vantagem chave do controlo translacional é a capacidade das células para reprogramar a saída rápida de proteína em resposta a vários disparadores internos e externos, assim mecanismo de ajuste fino que inclina o equilíbrio entre morte celular e sobrevivência 1. Dois aspectos do controle de translação são particularmente interessantes; compreensão da natureza do mec regulamentarhanism (s) e elementos de controlo que permitem a tradução específico, bem como a identificação de mRNAs específicos e seus produtos proteicos que participam na resposta celular ao gatilho particular, que provocou a tradução selectiva em primeiro lugar. Perfilamento polissoma é uma técnica que permite o estudo eficaz de ambos os processos. O objetivo geral da técnica polissoma profiling é estudar e quantificar o estado de tradução de mRNAs específicos sob diferentes condições de celulares. O princípio da técnica é capturar tradução do mRNA por &#39;&#39; congelar &#39;&#39; traduzindo ativamente ribossomos em diferentes transcritos e separar os polirribossomas resultantes por ultracentrifugação em gradiente de sacarose, permitindo assim uma distinção entre as transcrições altamente traduzidos (ligado por vários ribossomos) e os mal traduzido (ligado por um ou dois ribossomos). Neste protocolo particular, o antibiótico ciclo-heximida que se liga ao60S da subunidade ribossômica e bloqueia a liberação de desacetilados tRNA do local E ribossomo 2, é usado para inibir a translocação ribossomo e parar ribossomos em mRNAs de tradução. No entanto, outros agentes bloqueadores, tais como emetina, que também bloqueia a tradução de alongamento 3, podem ser utilizados. Ao contrário da transferência western e 35 S-metionina técnicas de marcação que medem a saída final do processo de tradução, polissoma caracterização tem a vantagem de medir ribossomas associação com mRNAs activamente-traduzidas, permitindo, assim, para um estudo mais detalhado de mecanismos de tradução sob diferentes condições. Assim, a técnica pode ser facilmente adaptado especificamente para estudar a diferentes modos de tradução 4-6, factores de proteínas envolvidas na regulação de tradução 7-9, condições de stress que afectam a síntese de proteínas 1,10,11 ou os efeitos de estruturas de ARNm tais como IRES ou a montante quadros de leitura abertos no sintetizador de proteínasesis 12-14. Hoje em dia, polissomas aplicações de perfil são ainda mais ampla com o uso de microarranjos de DNA de 15 ou de próxima geração seqüenciamento 16,17 analisar polissomos-mRNAs associados.

<table><tbody><tr><td>Gradient Master 108 automated gradient maker</td><td>BIOCOMP</td><td>107-201M</td><td></td></tr><tr><td>Auto Densi-Flow two-chamber gradient maker</td><td>LABCONCO</td><td>4517000</td><td></td></tr><tr><td>Beckman Ultracentrifuge&amp;nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>Model # L-100-XP</td><td></td></tr><tr><td>Density gradient fractionator</td><td>TELEDYNE ISCO</td><td>69-3873-246</td><td>Composed of: tube piercing system,&amp;nbsp; peristaltic pump, UA-6 Detector with 254 and 280 nm filters and Foxy R1 Fraction Collector</td></tr><tr><td>WinDaq data acquisition software</td><td>DATAQ INSTRUMENTS</td><td>WINDAQ/LITE</td><td>http://www.dataq.com/products/software/acquisition.htm</td></tr><tr><td>Pollyallomer ultracentrifuge tubes (for SW41, 14 x 89 mm)</td><td>Beckman Coulter</td><td>331372</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease-free 2-ml centrifuge tubes (dolphin nose)</td><td>DiaMed</td><td>PRE1900-N</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease-free 2-ml centrifuge tubes (flat bottom)</td><td>SafeSeal</td><td>12000</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose (nucleases-free)</td><td>Calbiochem</td><td>573113</td><td>MW = 342.3 g/mol</td></tr><tr><td>Cycloheximide</td><td>SIGMA</td><td>C7698</td><td>MW = 281.4 g/mol. Resuspend in DMSO and keep at -80C for long term sotrage. Caution: TOXIC! Can cause repiratory tracts and skin irritation. Wear mask when weighing.</td></tr><tr><td>Sodium chloride (nucleases-free)</td><td>OmniPur</td><td>7710</td><td>MW = 58.44 g/mol</td></tr><tr><td>MgCl2.6H2O (nucleases-free)</td><td>OmniPur</td><td>5980</td><td>MW = 203.3 g/mol</td></tr><tr><td>Tris Base (nucleases-free)</td><td>J.T. Baker</td><td>4109-01</td><td>MW = 121.14 g/mol</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>OmniPur</td><td>9400</td><td>Caution: TOXIC! Can cause repiratory tracts and skin irritation</td></tr><tr><td>Recombinant RNasin Ribonuclease Inhibitor</td><td>Promega</td><td>N2515</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap Rnase inactivation solution</td><td>Ambion, Life Technologies</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>GlycoBlue Coprecipitant (15 mg/ml)</td><td>Invitrogen, Life Technologies</td><td>AM9516</td><td></td></tr><tr><td>Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1)</td><td>Ambion, Life Technologies</td><td>AM9722</td><td>Caution: TOXIC ! Can cause repiratory tracts irritation as well as skin irritation and corrosion</td></tr></tbody></table>

assessment of selective mrna translation in mammalian cells by polysome profiling

Regulação da síntese de proteínas representa um ponto de controlo chave na resposta celular ao stress. Em particular, os elementos reguladores discreta de RNA foram mostrados para permitir a tradução de mRNAs específicos selectiva, que tipicamente codificam para as proteínas necessárias para uma resposta de stress particular. A identificação destes mRNAs, bem como a caracterização dos mecanismos reguladores responsáveis ​​pela tradução selectiva tem sido na vanguarda da biologia molecular, por algum tempo. Perfilamento polissoma é um método fundamental nestes estudos. O objetivo do polissoma profiling é capturar tradução do mRNA imobilizando ribossomos traduzindo ativamente em diferentes transcritos e separar os polirribossomas resultantes por ultracentrifugação em gradiente de sacarose, permitindo assim uma distinção entre as transcrições altamente traduzidos e aqueles mal traduzidas. Estes podem então ser ainda caracterizada por métodos tradicionais de biologia molecular e bioquímica. Importante, combinando polysome perfis com abordagens genómicas alto rendimento permite uma análise em larga escala de regulação de translação.

Descrevemos recentemente um novo papel para o supressor de tumor PDCD4 como um inibidor selectivo de tradução de mRNAs que codificam inibidores apoptóticos XIAP e Bcl-xL 12 IRES-abrigando. Perfilamento polissoma foi uma técnica chave para demonstrar o envolvimento específico de PDCD4 na tradução IRES-mediada. As células HEK293 foram transfectadas transitoriamente para esgotar os níveis endógenos de PDCD4 (Figura 1A) e, em seguida, submetido a análise do perfil de polissoma. Observou-se que a redução dos níveis de PDCD4 não prejudicou tradução celular global, a julgar pela falta de mudanças no perfil polissoma quando comparando siCTRL e siPDCD4 células tratadas (Figura 1B). De modo semelhante, a distribuição de polissoma variante não-IRES de XIAP 19 permaneceu inalterada entre as células tratadas e não tratadas (Figura 1C). Em contraste, polissoma distribuição dos mRNAs dois IRES-albergando, XIAP e Bcl-xL, foi significativamente alterada. Na ausência de PDCD4 a distribuição destes dois mRNAs é deslocada para dentro ribopolysomes pesados ​​(Figura 1D, E). Uma vez que este não é acompanhada por alterações nos níveis de estado estacionário de XIAP e Bcl-xL de mRNA (Figura 1F), estes resultados demonstram tradução de XIAP e Bcl-xL reforçada em células com níveis PDCD4 reduzidas, que foi posteriormente confirmada por Western blot (Figura 1G). <img alt="A Figura 1" src="/files/ftp_upload/52295/52295fig1highres.jpg" /> Figura 1:. Perfilamento polissoma identifica PDCD4 como inibidor selectivo de XIAP e Bcl-xL tradução (A) HEK293 células foram tratadas com siRNA PDCD4 ou controlo (CTRL), não-alvo siRNA, lisadas e sujeitas a análise de Western blot com anti-PDCD4 e anticorpos anti-nucleolina para verificar a extensão da PDCD4 knock-down. (B) PDCD4 foi derrubado como em (A) eOs lisados ​​celulares foram sujeitos a polissoma perfilamento. Polissoma perfil representativo é mostrado no painel de topo; a distribuição de XIAP não-IRES (C), Bcl-xL (D), e XIAP IRES (E) em relação ao ARNm que de GAPDH é mostrada como a percentagem de ARNm total (ARNm%) em cada fracção. (F) Firme Os níveis de ARNm -State foram medidas por RT-qPCR em PDCD4 siRNA ou de controlo (CTRL) siRNA células tratadas. (G) Os lisados ​​a partir de (A) foram também submetidas à análise de Western blot com anti-XIAP, anti-Bcl-x, e Os anticorpos anti-nucleolina. (NB. Os dados apresentados na Figura 1 foram originalmente publicado em 12) <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52295/52295fig1large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Assessment of Selective mRNA Translation in Mammalian Cells by Polysome Profiling

The ability of cells to adapt to stress is crucial for their survival. Regulation of mRNA translation is one such adaptation strategy, providing for rapid regulation of the proteome. Here, we provide a standardized polysome profiling protocol to identify specific mRNAs that are selectively translated under stress conditions.

Avaliação da Seletiva mRNA Tradução em células de mamíferos por polissoma Profiling

Regulation of protein synthesis represents a key control point in cellular response to stress. In particular, discreet RNA regulatory elements were shown ...

assessment-selective-mrna-translation-mammalian-cells-polysome

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

28.1K visualizações.  University of Ottawa. The ability of cells to adapt to stress is crucial for their survival. Regulation of mRNA translation is one such adaptation strategy, providing for rapid regulation of the proteome. Here, we provide a standardized polysome profiling protocol to identify specific mRNAs that are selectively translated under stress conditions. 

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Quantitative Immunofluorescence to Measure Global Localized Translation

The mechanisms regulating mRNA translation are involved in various biological processes, such as germ line development, cell differentiation, and organogenesis, as well as in multiple diseases. Numerous publications have convincingly shown that specific mechanisms tightly regulate mRNA translation. Increased interest in the translation-induced regulation of protein expression has led to the development of novel methods to study and follow de novo protein synthesis in cellulo. However, most of these methods are complex, making them costly and often limiting the number of mRNA targets that can be studied. This manuscript proposes a method that requires only basic reagents and a confocal fluorescence imaging system to measure and visualize the changes in mRNA translation that occur in any cell line under various conditions. This method was recently used to show localized translation in the subcellular structures of adherent cells over a short period of time, thus offering the possibility of visualizing de novo translation for a short period during a variety of biological processes or of validating changes in translational activity in response to specific stimuli.

This manuscript describes a method to visualize and quantify localized translation events in subcellular compartments. The approach proposed in this manuscript requires a basic confocal imaging system and reagents and is rapid and cost-effective.

Imunofluorescência quantitativa a medida Global localizadas Tradução

The mechanisms regulating mRNA translation are involved in various biological processes, such as germ line development, cell differentiation, and ...

Bioquímica

Genome-wide Quantification of Translation in Budding Yeast by Ribosome Profiling

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription reflect changes in protein synthesis, but many exceptions have been observed. Recently, a technique called ribosome profiling (or Ribo-Seq) has emerged as a powerful method that allows identification, with high accuracy, which regions of mRNA are translated into proteins and quantification of translation at the genome-wide level. Here, we present a generalized protocol for genome-wide quantification of translation using Ribo-Seq in budding yeast. In addition, combining Ribo-Seq data with mRNA abundance measurements allows us to simultaneously quantify translation efficiency of thousands of mRNA transcripts in the same sample and compare changes in these parameters in response to experimental manipulations or in different physiological states. We describe a detailed protocol for generation of ribosome footprints using nuclease digestion, isolation of intact ribosome-footprint complexes via sucrose gradient fractionation, and preparation of DNA libraries for deep sequencing along with appropriate quality controls necessary to ensure accurate analysis of in vivo translation.

Translational regulation plays an important role in the control of protein abundance. Here, we describe a high-throughput method for quantitative analysis of translation in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.

Quantificação de todo o genoma de tradução no fermento Budding pelo Ribossoma perfilamento

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription ...

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Proper protein expression at the right time and in the right amounts is the basis of normal cell function and survival in a fast-changing environment. For a long time, the gene expression studies were dominated by research on the transcriptional level. However, the steady-state levels of mRNAs do not correlate well with protein production, and the translatability of mRNAs varies greatly depending on the conditions. In some organisms, like the parasite Leishmania, the protein expression is regulated mostly at the translational level. Recent studies demonstrated that protein translation dysregulation is associated with cancer, metabolic, neurodegenerative and other human diseases. Polysome profiling is a powerful method to study protein translation regulation. It allows to measure the translational status of individual mRNAs or examine translation on a genome-wide scale. The basis of this technique is the separation of polysomes, ribosomes, their subunits and free mRNAs during centrifugation of a cytoplasmic lysate through a sucrose gradient. Here, we present a universal polysome profiling protocol used on three different models - parasite Leishmania major, cultured human cells and animal tissues. Leishmania cells freely grow in suspension and cultured human cells grow in adherent monolayer, while mouse testis represents an animal tissue sample. Thus, the technique is adapted to all of these sources. The protocol for the analysis of polysomal fractions includes detection of individual mRNA levels by RT-qPCR, proteins by Western blot and analysis of ribosomal RNAs by electrophoresis. The method can be further extended by examination of mRNAs association with the ribosome on a transcriptome level by deep RNA-seq and analysis of ribosome-associated proteins by mass spectroscopy of the fractions. The method can be easily adjusted to other biological models.

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

The overall goal of polysome profiling technique is analysis of translational activity of individual mRNAs or transcriptome mRNAs during protein synthesis. The method is important for studies of protein synthesis regulation, translation activation and repression in health and multiple human diseases.

Polysome de criação de perfil em Leishmania, células humanas e testículo de rato

Proper protein expression at the right time and in the right amounts is the basis of normal cell function and survival in a fast-changing environment. For ...

Dynamic Proteomic and miRNA Analysis of Polysomes from Isolated Mouse Heart After Langendorff Perfusion

Studies in dynamic changes in protein translation require specialized methods. Here we examined changes in newly-synthesized proteins in response to ischemia and reperfusion using the isolated perfused mouse heart coupled with polysome profiling. To further understand the dynamic changes in protein translation, we characterized the mRNAs that were loaded with cytosolic ribosomes (polyribosomes or polysomes) and also recovered mitochondrial polysomes and compared mRNA and protein distribution in the high-efficiency fractions (numerous ribosomes attached to mRNA), low-efficiency (fewer ribosomes attached) which also included mitochondrial polysomes, and the non-translating fractions. miRNAs can also associate with mRNAs that are being translated, thereby reducing the efficiency of translation, we examined the distribution of miRNAs across the fractions. The distribution of mRNAs, miRNAs, and proteins was examined under basal perfused conditions, at the end of 30 min of global no-flow ischemia, and after 30 min of reperfusion. Here we present the methods used to accomplish this analysis&#8212;in particular, the approach to optimization of protein extraction from the sucrose gradient, as this has not been described before&#8212;and provide some representative results.

Here we present a protocol to perform polysome profiling on the isolated perfused mouse heart. We describe methods for heart perfusion, polysome profiling, and analysis of the polysome fractions with respect to mRNAs, miRNAs, and the polysome proteome.

Dinâmica proteómica e miRNA análise de polissomos de coração de rato isolado após Langendorff perfusão

Studies in dynamic changes in protein translation require specialized methods. Here we examined changes in newly-synthesized proteins in response to ...

Polysome Profiling without Gradient Makers or Fractionation Systems

Polysome fractionation by sucrose density gradient centrifugation is a powerful tool that can be used to create ribosome profiles, identify specific mRNAs being translated by ribosomes, and analyze polysome associated factors. While automated gradient makers and gradient fractionation systems are commonly used with this technique, these systems are generally expensive and can be cost-prohibitive for laboratories that have limited resources or cannot justify the expense due to their infrequent or occasional need to perform this method for their research. Here, a protocol is presented to reproducibly generate polysome profiles using standard equipment available in most molecular biology laboratories without specialized fractionation instruments. Moreover, a comparison of polysome profiles generated with and without a gradient fractionation system is provided. Strategies to optimize and produce reproducible polysome profiles are discussed. Saccharomyces cerevisiae is utilized as a model organism in this protocol. However, this protocol can be easily modified and adapted to generate ribosome profiles for many different organisms and cell types.

This protocol describes how to generate a polysome profile without using automated gradient makers or gradient fractionation systems.

Perfil de polissomas sem fabricantes de gradientes ou sistemas de fracionamento

Polysome fractionation by sucrose density gradient centrifugation is a powerful tool that can be used to create ribosome profiles, identify specific mRNAs ...

RiboTag Immunoprecipitation in the Germ Cells of the Male Mouse

Quantifying differences in mRNA abundance is a classic approach to understand the impact of a given gene mutation on cell physiology. However, characterizing differences in the translatome (the whole of translated mRNAs) provides an additional layer of information particularly useful when trying to understand the function of RNA regulating or binding proteins. A number of methods for accomplishing this have been developed, including ribosome profiling and polysome analysis. However, both methods carry significant technical challenges and cannot be applied to specific cell populations within a tissue unless combined with additional sorting methods. In contrast, the RiboTag method is a genetic-based, efficient, and technically straightforward alternative that allows the identification of ribosome associated RNAs from specific cell populations without added sorting steps, provided an applicable cell-specific Cre driver is available. This method consists of breeding to generate the genetic models, sample collection, immunoprecipitation, and downstream RNA analyses. Here, we outline this process in adult male mouse germ cells mutant for an RNA binding protein required for male fertility. Special attention is paid to considerations for breeding with a focus on efficient colony management and the generation of correct genetic backgrounds and immunoprecipitation in order to reduce background and optimize output. Discussion of troubleshooting options, additional confirmatory experiments, and potential downstream applications is also included. The presented genetic tools and molecular protocols represent a powerful way to describe the ribosome-associated RNAs of specific cell populations in complex tissues or in systems with aberrant mRNA storage and translation with the goal of informing on the molecular drivers of mutant phenotypes.

Here, we describe the immunoprecipitation of ribosomes and associated RNA from select populations of adult male mouse germ cells using the RiboTag system. Strategic breeding and careful immunoprecipitation result in clean, reproducible results that inform on the germ cell translatome and provide insight into the mechanisms of mutant phenotypes.

Imunoprecipitação ribotag nas células germinativas do rato macho

Quantifying differences in mRNA abundance is a classic approach to understand the impact of a given gene mutation on cell physiology. However, ...

Biologia do Desenvolvimento

Eukaryotic Polyribosome Profile Analysis

Protein synthesis is a complex cellular process that is regulated at many levels. For example, global translation can be inhibited at the initiation phase or the elongation phase by a variety of cellular stresses such as amino acid starvation or growth factor withdrawal. Alternatively, translation of individual mRNAs can be regulated by mRNA localization or the presence of cognate microRNAs. Studies of protein synthesis frequently utilize polyribosome analysis to shed light on the mechanisms of translation regulation or defects in protein synthesis. In this assay, mRNA/ribosome complexes are isolated from eukaryotic cells.  A sucrose density gradient separates mRNAs bound to multiple ribosomes known as polyribosomes from mRNAs bound to a single ribosome or monosome. Fractionation of the gradients allows isolation and quantification of the different ribosomal populations and their associated mRNAs or proteins. Differences in the ratio of polyribosomes to monosomes under defined conditions can be indicative of defects in either translation initiation or elongation/termination. Examination of the mRNAs present in the polyribosome fractions can reveal whether the cohort of individual mRNAs being translated changes with experimental conditions. In addition, ribosome assembly can be monitored by analysis of the small and large ribosomal subunit peaks which are also separated by the gradient. In this video, we present a method for the preparation of crude ribosomal extracts from yeast cells, separation of the extract by sucrose gradient and interpretation of the results.  This procedure is readily adaptable to mammalian cells.

This article describes a protocol for the extraction of translating ribosomes from eukaryotic cells. Once extracted, ribosomes are separated into monosomes and polyribosomes by sucrose gradient fractionation to allow different ribosomal populations to be analyzed. As such, this method is the gold standard for examining the regulation of translation.

Análise de Perfil eucarióticas Polyribosome

Protein synthesis is a complex cellular process that is regulated at many levels. For example, global translation can be inhibited at the initiation phase ...

Biologia

Analysis of Translation Initiation During Stress Conditions by Polysome Profiling

Precise control of mRNA translation is fundamental for eukaryotic cell homeostasis, particularly in response to physiological and pathological stress. Alterations of this program can lead to the growth of damaged cells, a hallmark of cancer development, or to premature cell death such as seen in neurodegenerative diseases. Much of what is known concerning the molecular basis for translational control has been obtained from polysome analysis using a density gradient fractionation system. This technique relies on ultracentrifugation of cytoplasmic extracts on a linear sucrose gradient. Once the spin is completed, the system allows fractionation and quantification of centrifuged zones corresponding to different translating ribosomes populations, thus resulting in a polysome profile. Changes in the polysome profile are indicative of changes or defects in translation initiation that occur in response to various types of stress. This technique also allows to assess the role of specific proteins on translation initiation, and to measure translational activity of specific mRNAs. Here we describe our protocol to perform polysome profiles in order to assess translation initiation of eukaryotic cells and tissues under either normal or stress growth conditions.

Here, we describe a method to analyze changes in the initiation of mRNA translation of eukaryotic cells in response to stress conditions. This method is based on the velocity separation on sucrose gradients of translating ribosomes from non-translating ribosomes.

Análise da Tradução Iniciação Durante condições de estresse por polysome Profiling

Precise control of mRNA translation is fundamental for eukaryotic cell homeostasis, particularly in response to physiological and pathological stress. ...

Polysome Fractionation and Analysis of Mammalian Translatomes on a Genome-wide Scale

mRNA translation plays a central role in the regulation of gene expression and represents the most energy consuming process in mammalian cells. Accordingly, dysregulation of mRNA translation is considered to play a major role in a variety of pathological states including cancer. Ribosomes also host chaperones, which facilitate folding of nascent polypeptides, thereby modulating function and stability of newly synthesized polypeptides. In addition, emerging data indicate that ribosomes serve as a platform for a repertoire of signaling molecules, which are implicated in a variety of post-translational modifications of newly synthesized polypeptides as they emerge from the ribosome, and/or components of translational machinery. Herein, a well-established method of ribosome fractionation using sucrose density gradient centrifugation is described. In conjunction with the in-house developed &#8220;anota&#8221; algorithm this method allows direct determination of differential translation of individual mRNAs on a genome-wide scale. Moreover, this versatile protocol can be used for a variety of biochemical studies aiming to dissect the function of ribosome-associated protein complexes, including those that play a central role in folding and degradation of newly synthesized polypeptides.

Ribosomes play a central role in protein synthesis. Polyribosome (polysome) fractionation by sucrose density gradient centrifugation allows direct determination of translation efficiencies of individual mRNAs on a genome-wide scale. In addition, this method can be used for biochemical analysis of ribosome- and polysome-associated factors such as chaperones and signaling molecules.

Polysome Fracionamento e Análise de mamíferos Translatomes em uma escala genômica

mRNA translation plays a central role in the regulation of gene expression and represents the most energy consuming process in mammalian cells. ...

Analysis of Translation in the Developing Mouse Brain using Polysome Profiling

The proper development of the mammalian brain relies on a fine balance of neural stem cell proliferation and differentiation into different neural cell types. This balance is tightly controlled by gene expression that is fine-tuned at multiple levels, including transcription, post-transcription and translation. In this regard, a growing body of evidence highlights a critical role of translational regulation in coordinating neural stem cell fate decisions. Polysome fractionation is a powerful tool for the assessment of mRNA translational status at both global and individual gene levels. Here, we present an in-house polysome profiling pipeline to assess translational efficiency in cells from the developing mouse cerebral cortex. We describe the protocols for sucrose gradient preparation, tissue lysis, ultracentrifugation and fractionation-based analysis of mRNA translational status.

The development of the mammalian brain requires proper control of gene expression at the level of translation. Here, we describe a polysome profiling system with an easy-to-assemble sucrose gradient-making and fractionation platform to assess the translational status of mRNAs in the developing brain.

Análise da tradução no cérebro do rato em desenvolvimento usando perfil polino

The proper development of the mammalian brain relies on a fine balance of neural stem cell proliferation and differentiation into different neural cell ...