Hirschil Trust, Michael Saperstein médicos Scholars Fundos de Pesquisa, ea comunhão NYU Whitehead apoiaram este trabalho.

1. O revestimento das microplacas Poços Nota: O objectivo deste passo é o de revestir as superfícies de poliestireno com ICAM-1 e servem como ligandos para as células T LFA-1. <ol><li> Prepare as seguintes soluções: <ol><li> Preparar a solução de revestimento por ressuspensão recombinante de ICAM-1 com a solução (PBS) (NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, 10 mM de Na 2 HPO 4, 2 mM de KH 2 PO 4, pH 7,4) tampão fosfato salino enriquecido com cálcio (1 mM CaCl2) e magnésio (2 nM de MgCl 2). Certifique-se de que a concentração final de ICAM-1 é de 10 ug / ml, feito a partir de uma solução de estoque de 0,7 mg / ml e mantidas em um congelador a -80 ° C. </li><li> Preparar a solução de adesão, através do enriquecimento de PBS com 0,5% de humano (ou de bovino) de albumina sérica humana (HSA / BSA), MgCl2 2 mM, e 1 mM de CaCl2. </li><li> Preparar a solução de lavagem através da adição de 2 mM de MgCl2 e 1 mM de CaCl2 a PBS. Aqueça todas as soluções para 37° C antes do uso. </li></ol></li><li> Lavar as placas com 24 poços com 50 mL de solução de lavagem. Isso irá incluir poços não lavados, (PMA) trataram células positivas e (poços não revestidos) negativos controles. Para cada condição de definir pelo menos três poços (triplas). </li><li> Adicionar 50 ul de solução de revestimento, para cada poço. Não adicione aos poços de controlo não revestidos. Incubar durante uma hora a 37 ° C no interior da incubadora. </li><li> Aspirar suavemente a solução de revestimento, sem que a ponta para tocar no fundo dos poços. Lavar uma vez com 50 ul de solução de lavagem. </li><li> Adicionar 50 ul de solução de adesão e incubar a microplaca durante uma hora a 37 ° C no interior da incubadora. </li><li> Aspirar suavemente e lave uma vez com 50 mL de solução de lavagem. Usar a placa no mesmo dia, no entanto, é possível manter a 4 ° C durante a noite, e usá-lo no dia seguinte. </li></ol> 2. T o isolamento de células a partir de sangue <ol><li> Adicionar humano T enriquecimento célula coquetel em 50 ul / ml of sangue inteiro (por exemplo por 3 ml de anticoagulante (heparina, EDTA, ou citrato) de sangue total, adicionar 150 mL de cocktail). Misture bem. </li><li> Incubar 20 min a temperatura ambiente. </li><li> Para um tubo de centrífuga de 50 ml adicionar 3 ml de sangue tratado e um volume igual de PBS (sem cálcio e magnésio) enriquecido com 1% de D-glucose, à temperatura ambiente. Misture delicadamente com uma pipeta Pasteur. </li><li> Adicionar 15 ml de Ficoll-Paque PLUS para o tubo de centrífuga. </li><li> Camada cuidadosamente os 6 ml diluído amostra de sangue no meio de isolamento de linfócitos. </li><li> Centrifugar a 400 xg por 20 min a 20 ° C, com pausa fora. </li><li> Decantar a camada superior com uma pipeta de Pasteur limpa, deixando a camada de linfócitos não perturbada na interface. Se a camada superior de plasma pode ser guardado para uso posterior. Utilizando uma pipeta de Pasteur limpa transferir a camada de linfócitos para um tubo de centrífuga limpo. </li><li> Adicionar 3 volumes (9 ml) de PBS para os linfócitos. Suspender as células suavemente draala-los dentro e para fora de uma pipeta de Pasteur. </li><li> Centrifugar a 400 xg durante 5 min a 20 ° C. </li><li> Remover o sobrenadante. Os linfócitos deve agora ser suspensos no meio apropriado para a aplicação. Transferência das células para um balão de cultura T-75, em 20 ml de RPMI 1640 contendo 10% de FBS, 1% de penicilina / estreptomicina. </li></ol> 3. Preparação das Células Nota: Um pré-requisito é de que as células a ser marcado com um reagente fluorescente. Neste protocolo usar carboxi éster succinimidyl fluoresceína (CFSE), proteína fluorescente no entanto verde (GFP) são células que expressam uma alternativa aceitável. <ol><li> Contagem de 2,4 x 10 6 células T (1 x 10 5 para cada poço) usando um hemocitômetro. </li><li> Ressuspender as células em meio de cultura sem soro (privação de soro). Incubar as células durante 2 horas na incubadora a 37 ° C. </li><li> Centrifugar as células durante 5 min (400 xg). Aspirar a mídia eressuspender em 1 ml de PBS. </li><li> Adicionar CFSE em 1:1.000 diluição (estoque feito para 5 mM). Cubra de luz e incubar durante 8 minutos à temperatura ambiente. </li><li> Parar a reacção por adição de 10 ml de 37 ° C, PBS e girar a 400 xg durante 5 min. </li><li> Re-suspender a pelete de células com 1,2 ml de solução de adesão pré-aquecido (1 x 10 5 células por 50 pi). </li></ol> 4. Estimulação das células Nota: Para iniciar a adesão, as células devem ser estimuladas. Na experiência seguinte, as células são estimuladas através do TCR utilizando anticorpos anti-CD3 de reticulação, no entanto, solúveis SDF-1 pode servir como uma alternativa. Dependendo do objetivo dos experimentos, vários reagentes farmacológicos pode ser adicionado antes ou durante a estimulação para estudar o impacto na adesão celular. Forbol miristato acetato de forbol (PMA) é um éster de forbol que é estruturalmente semelhante ao do segundo mensageiro diacil glicerol (DAG) e, por conseguinte, activa quinase múltiplas a jusante do TCR (principalmente proteína cinase C); aqui é usado como um controlo positivo. <ol><li> Aquece-se a microplaca a 37 ° C. </li><li> Dividir as células em 8 vazios tubos de 1,5 ml (150 ul em cada tubo), um tubo para cada condição. </li><li> Tratar as células em conformidade: <ol><li> Estimular um tubo com PMA a 10 ng / ml para servir como controlo positivo. Mantenha três tubos sem tratamento, para servir como controle de estímulo (&quot;nenhum estímulo&quot;), controle de carga sujo (&quot;sem lavagem&quot;), e controle para ICAM-1 revestimento (&quot;sem revestimento&quot;). </li><li> Estimular quatro tubos com diferentes concentrações de anticorpos anti-CD3 (0,1, 1, 5, e 10 ug / ml). Continue para a próxima etapa, sem atrasos. </li></ol></li><li> Alíquota de 50 mL de mistura de células estimuladas em cada poço vazio. O número final de células por cavidade é de 1 x 10 5. </li><li> Coloque a microplaca na incubadora 37 ° C por 15 min. Nota: Algumas linhas de células T requerem menor estimulação<html> tempo ção. Durante este tempo, as células vão estabelecer-se para o fundo dos poços e aderir aos ligandos-alvo. </li></ol> 5. Lavar células não aderentes Nota: O objetivo deste passo é remover as células que não foram capazes de formar contactos estreitos com as superfícies recobertas pelo ligante. Usar uma pipeta de canais múltiplos para este passo, a fim de assegurar que as mesmas forças físicas são aplicados a todos os poços. É importante manter os poços de controlo indicados unwashed para auxiliar no cálculo da percentagem de células aderentes. <ol><li> Adicione 150 ml de solução de aderência quente para cada poços. Agitar a placa suavemente durante alguns segundos antes de remover o meio dos poços. Não toque no fundo dos poços com as pontas. </li><li> Repita este passo três vezes. Mude a direção da pipeta ao pipetar o buffer de entrada e saída. </li></ol> 6. Determinação da percentagem de células aderentes _content &quot;&gt; Nota: Neste passo um leitor de placas de fluorescência é usado para medir a intensidade de fluorescência dentro de cada poço a intensidade está em correlação directa com o número de células aderentes.. <ol><li> Ligue o leitor de placas. Abra o software leitor de placas, clicando no ícone de atalho na área de trabalho. <ol><li> No menu &quot;Tarefas&quot;, clique em &quot;Novo&quot; para criar um novo protocolo. </li><li> A partir do menu &quot;Ações&quot;, escolha a opção &quot;Read&quot;. Clique em &quot;A intensidade de fluorescência&quot; e clique na aba &quot;Ok&quot;. </li><li> A partir do menu drop-down selecione &quot;comprimento de onda de excitação 485&quot; e &quot;Emissão de comprimento de onda 528&quot;. Hit na guia &quot;Ok&quot;. </li><li> No menu de opções &quot;Óptica&quot;, selecione &quot;Bottom&quot; e clique na aba &quot;Ok&quot;. Volte ao menu &quot;Ações&quot; e definir a temperatura a 37 ° C e clique em &quot;Ok&quot;. </li><li> Insira a microplaca no leitor de placa eclique em &quot;Executar&quot;. O resultado será exportado para planilha excel. </li></ol></li><li> Calcula-se a percentagem de células aderentes utilizando a seguinte fórmula: Percentagem de células aderentes = (média intensidade de fluorescência lida em poços lavados) / (média intensidade de fluorescência lida em células não lavadas) x 100%. </li></ol>

<ol>
	<li>Dustin, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membranes+as+messengers+in+T+cell+adhesion+signaling.">Membranes as messengers in T cell adhesion signaling.</a> Nat Immunol. 5 (4), 363-372 (2004).</li><li>Mor, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GTPases+and+LFA-1+reciprocally+modulate+adhesion+and+signaling.">GTPases and LFA-1 reciprocally modulate adhesion and signaling.</a> Immunol Rev. 218, 114-125 (2007).</li><li>Rose, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+modulation+and+signaling+in+leukocyte+adhesion+and+migration.">Integrin modulation and signaling in leukocyte adhesion and migration.</a> Immunol Rev. 218, 126-134 (2007).</li><li>Alon, R., Feigelson, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokine-triggered+leukocyte+arrest:+force-regulated+bi-directional+integrin+activation+in+quantal+adhesive+contacts.">Chemokine-triggered leukocyte arrest: force-regulated bi-directional integrin activation in quantal adhesive contacts.</a> Curr Opin Cell Biol. 24 (5), 670-676 (2012).</li><li>Griffith, J. W., Luster, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+cells+in+motion:+migrating+toward+improved+therapies.">Targeting cells in motion: migrating toward improved therapies.</a> Eur J Immunol. 43 (6), 1430-1435 (2013).</li><li>Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+adhesion+molecules+and+actin+cytoskeleton+at+immune+synapses+and+kinapses.">Cell adhesion molecules and actin cytoskeleton at immune synapses and kinapses.</a> Curr Opin Cell Biol. 19 (5), 529-533 (2007).</li><li>Springer, T. A., Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+inside-out+signaling+and+the+immunological+synapse.">Integrin inside-out signaling and the immunological synapse.</a> Curr Opin Cell Biol. 24 (1), 107-115 (2012).</li><li>Mor, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=D1+regulates+lymphocyte+adhesion+via+upregulation+of+Rap1+at+the+plasma+membrane.">D1 regulates lymphocyte adhesion via upregulation of Rap1 at the plasma membrane.</a> Mol Cell Biol. 29 (12), 3297-3306 (2009).</li><li>Bivona, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rap1+up-regulation+and+activation+on+plasma+membrane+regulates+T+cell+adhesion.">Rap1 up-regulation and activation on plasma membrane regulates T cell adhesion.</a> J Cell Biol. 164 (3), 461-470 (2004).</li><li>Zeltzer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diminished+adhesion+of+CD4++T+cells+from+dialysis+patients+to+extracellular+matrix+and+its+components+fibronectin+and+laminin.">Diminished adhesion of CD4+ T cells from dialysis patients to extracellular matrix and its components fibronectin and laminin.</a> Nephrol Dial Transplant. 12 (12), 2618-2622 (1997).</li><li>Bhattacharyya, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Both+adhesion+to+immobilized+vitronectin+and+Fc+epsilon+RI+cross-linking+cause+enhanced+focal+adhesion+kinase+phosphorylation+in+murine+mast+cells.">Both adhesion to immobilized vitronectin and Fc epsilon RI cross-linking cause enhanced focal adhesion kinase phosphorylation in murine mast cells.</a> Immunology. 98 (3), 357-362 (1999).</li><li>Dustin, M. L., Groves, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+signaling+clusters+in+the+immune+synapse.">Receptor signaling clusters in the immune synapse.</a> Annu Rev Biophys. 41, 543-556 (2012).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Existem diversos ensaios para estudar os sinais de LFA-1 a activação e a adesão de células T 12. A citometria de fluxo é utilizada para medir a LFA-1 estados de afinidade em células vivas, utilizando anticorpos monoclonais que se ligam selectivamente, quer dobrado ou estendido a LFA-1. Uma das limitações deste método é que ele não leva em conta a avidez dos integrinas. Ensaios de migração são ferramentas úteis, mas eles medem a migração, e não adesão desprezível em um ponto de tempo espec?...

Linfócitos T aderência é um processo fundamental para a resposta imune 1. É necessário para a interacção das células T com as células endoteliais decoração nas paredes dos capilares, para o antigénio de células apresentadoras de varrimento (APC) dentro de nódulos linfáticos, e para a formação de sinapses imunológicas (IS), com células-alvo 2. Estes requisitos são funcionalmente e cineticamente distintas. O processo de linfócitos extravasamento consiste quimioatração, rolamento, adesão firme e transmigração. A transição a partir de rolamento para firmar aderência requer as células T de responder a um sinal de receptor acoplado a proteína G rapidamente. Esta resposta produz uma interação ligante integrina que retarda e prisões da célula de rolamento 3. Uma mudança imediata na avidez integrina medeia este processo. A migração requer interacções betweenTcells dinâmicos e células endoteliais com a formação de aderências no &#39;front end &quot;e quebra de aderências no&#39; extremidade traseira &#39;com um intervalo de cerca de um minuto entre a formação e quebra 4. O IS constitui inminutes, mas precisa permanecer intacta por horas 6. Curiosamente, uma molécula de adesão, a função de membro da família de linfócitos integrina antígeno associado (LFA) - 1, é essencial para todos estes processos 5. LFA-1 medeia a adesão através de interacções com vários membros da superfamília das imunoglobulinas. O ligando mais extensivamente estudado com a mais elevada afinidade para o LFA-1 é a molécula de adesão intercelular (ICAM) -1. Linfócitos circulantes não-activadas expressam baixa afinidade de LFA-1 na superfície das células, e, por conseguinte, não são capazes de aderir a superfícies revestidas de ICAM-1. LFA-1 é de afinidade variável e regulada por vários eventos de sinalização, tais como a proteína G acoplado a activação do receptor, estimulação de citoquinas, e os sinais mediados pelos receptores das células T (TCR). A forma de afinidade elevada, resultante da LFA-1 transmite activação intracelular para o espaço extracelular tinteracções hrough com ICAM-1. Este caminho é chamado de dentro para fora sinalização 7. Do mesmo modo, a sinalização através de LFA-1 a partir do espaço extracelular é chamado de fora para dentro de sinalização. O cascatas de sinalização intracelular envolvidas na de dentro para fora e de fora para dentro de sinalização são um grande foco de pesquisa atual. A pequena GTPase Rap1 surgiu recentemente como o componente chave de dentro para fora sinalizando que é comum a ambos ligadura TCR e citocina sinalização 8. O papel crítico da Rap1 na activação de integrina é realçada pela descoberta de que a sobre-expressão de Rap1 estimula a adesão dependente de integrina de células T, enquanto que a adesão de células T é bloqueada através da expressão de Rap1 dominante negativa 9. Esses avanços em nossa compreensão da regulação integrina por Rap1 ter sido realizado utilizando em ferramentas vitro. Entre elas, está o ensaio de adesão estático descrito aqui. O objetivo geral deste método é estudar Tadesividade de células a ICAM-1 as superfícies revestidas. Mais especificamente, é utilizado para medir e quantificar objectivamente LFA-1 de afinidade para com os seus ligandos de contador em células vivas em tempo real, sob diferentes condições. Esta técnica utiliza poços de poliestireno revestidas com ICAM-1, para imitar as superfícies celulares que as células T interagem com. Muitos ensaios de adesão de células T estático anteriormente descritos foram experimentalmente complexo. Estes ensaios frequentemente requeridos para as células T a ser marcado radioactivamente, utilizado células da córnea de bovino em cultura para criar uma matriz extracelular como o substrato para a aderência das células T, ou chamados para a estimulação não-fisiológico de células T durante um período prolongado para promover a adesão de células T 10. A utilização de medição fluorométrico para quantificar as células T após a incubação de adesão é um método mais sensível e precisa de quantificação, em comparação com a citometria de fluxo e microscopia, que são utilizados em muitos outros sistemas de ensaio 11. Além disso, uma única célula microscopic análise de integrina localização não permite a ampla, a análise da população com base na mesma maneira como a medição f luorométrica. Enquanto que os anticorpos específicos do Estado de LFA-1 de activação estão comercialmente disponíveis, estes anticorpos oferecer uma baixa sensibilidade em relação com o método descrito aqui. A principal vantagem sobre as técnicas alternativas é a sua simplicidade e a capacidade de analisar múltiplas condições experimentais simultaneamente. Ao considerar este método para uma aplicação específica, deve-se levar em conta que as células T devem ser selecionados de forma negativa, recentemente isolado, e marcadas com um marcador fluorescente.

<table><tbody><tr><td>Plate reader</td><td>BioTek</td><td>Synergy H1 Hybrid</td><td></td></tr><tr><td>Multichannel pipette</td><td>Fisher</td><td>21-377-829</td><td></td></tr><tr><td>96-well microplate with optical bottom</td><td>Corning Costar</td><td>3603</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant ICAM-1</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>ADP4-050</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD3 antibodies</td><td>Ancell</td><td>144-020</td><td></td></tr><tr><td>PMA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>79346</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2058</td><td></td></tr><tr><td>CFSE</td><td>Molecular Probes</td><td>C1157</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Gibco</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>DPBS containing calcium and magnesium</td><td>Gibco</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>Peripheral lymphocytes</td><td>&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; mouse or human</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>499609</td><td></td></tr><tr><td>Open Gen 5 software</td><td>BioTek</td><td>Version 2.01</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>GE Healthcare</td><td>71-7167-00</td><td></td></tr><tr><td>15 and 50 ml centrifuge tubes</td><td>Fisher</td><td>352099, 352070</td><td></td></tr><tr><td>Disposable plastic Pasteur pipettes</td><td>Fisher</td><td>13-711-7M</td><td></td></tr><tr><td>T-75 culture flasks</td><td>Fisher</td><td>50-754-1366</td><td></td></tr><tr><td>RosetteSep T cell enricment kit</td><td>StemCell Technologies</td><td>15061</td><td></td></tr></tbody></table>

static adhesion assay for the study of integrin activation in t lymphocytes

Adesão de linfócitos T é necessária para várias funções das células T, incluindo a migração para os locais de inflamação e formação de sinapses imunológicas com células apresentadoras de antigénios. As células T realizar adesão regulada através do controlo das propriedades adesivas de integrinas, uma classe de moléculas de adesão celular que consistem de pares heterodiméricas de proteínas transmembranares que interagem com moléculas-alvo de células parceiras ou matriz extracelular. O mais proeminente a integrina da célula T é a função dos linfócitos antigénio associado (LFA) -1, composta por subunidades aL e β2, cujo alvo é a molécula de adesão intracelular (ICAM) -1. A capacidade de uma célula T para controlar a aderência deriva da capacidade para regular os estados de afinidade de integrinas individuais. Sinalização dentro para fora descreve o processo pelo qual os sinais dentro de uma célula com que os domínios externos de integrinas para assumir um estado activado. Muito do nosso conhecimento destes fenómenos complexos é baseada na mecânicaEstudos realizados em simplificada em sistemas de modelo in vitro. O ensaio de adesão de linfócitos T descrito aqui é uma excelente ferramenta que permite que as células T para aderir a moléculas alvo, sob condições estáticas, e, em seguida, utiliza um leitor de placas fluorescente para quantificar a adesividade. Este ensaio tem sido útil na definição de substâncias de adesão-estimulador ou inibidor que actuam sobre os linfócitos, assim como a caracterização dos eventos de sinalização envolvidos. Embora descrito aqui para LFA-1 - ICAM-1 de adesão mediada; este ensaio pode ser facilmente adaptada para permitir o estudo de outras interacções adesivas (por exemplo, VLA-4 - fibronectina).

Abaixo está um exemplo de ensaio de adesão usando células T primárias estimuladas com várias concentrações de anticorpos anti-CD3. É útil saber a fluorescência das células não lavadas (isto é, a carga total). As células não estimuladas servir como um controle negativo e células tratadas com PMA são o controlo positivo para anticorpos anti-CD3. As células plaqueadas em poços não-revestidos servir como um controlo para a ICAM-1. Numa experiência típica, a percentagem de células tratadas com...

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Static Adhesion Assay for the Study of Integrin Activation in T Lymphocytes

Ensaio de adesão estático é uma ferramenta poderosa que pode ser utilizado para modelar as interacções entre linfócitos T e de outros tipos de células. Interacções são geradas por injecção de células T marcadas em poços revestidos com moléculas de adesão, enquanto que um leitor de placa é utilizada para quantificar o número de células aderentes a seguir lavagens em série.

Estática Adesão Ensaio para o Estudo da integrina Ativação em Linfócitos T

T lymphocyte adhesion is required for multiple T cell functions, including migration to sites of inflammation and formation of immunological synapses with ...

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15.9K visualizações.  New York University School of Medicine.  Ensaio de adesão estático é uma ferramenta poderosa que pode ser utilizado para modelar as interacções entre linfócitos T e de outros tipos de células. Interacções são geradas por injecção de células T marcadas em poços revestidos com moléculas de adesão, enquanto que um leitor de placa é utilizada para quantificar o número de células aderentes a seguir lavagens em série. 

Vídeo: Static Adhesion Assay for the Study of Integrin Activation in T Lymphocytes

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular matrix proteins. The precise spatiotemporal activation of integrins from a low affinity state to a high affinity state at the cell leading edge is important for T lymphocyte migration 1. Likewise, retraction of the cell trailing edge, or uropod, is a necessary step in maintaining persistent integrin-dependent T lymphocyte motility 2. Many therapeutic approaches to autoimmune or inflammatory diseases target integrins as a means to inhibit the excessive recruitment and migration of leukocytes 3. To study the molecular events that regulate human T lymphocyte migration, we have utilized an in vitro system to analyze cell migration on a two-dimensional substrate that mimics the environment that a T lymphocyte encounters during recruitment from the vasculature. T lymphocytes are first isolated from human donors and are then stimulated and cultured for seven to ten days. During the assay, T lymphocytes are allowed to adhere and migrate on a substrate coated with intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), a ligand for integrin LFA-1, and stromal cell-derived factor-1 (SDF-1). Our data show that T lymphocytes exhibit a migratory velocity of ~15 &mu;m/min. T lymphocyte migration can be inhibited by integrin blockade 1 or by inhibitors of the cellular actomyosin machinery that regulates cell migration 2.

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

T lymphocyte migration occurs during homing to lymphoid organs, exit from the vasculature, and entering into peripheral tissues. Here, we describe a protocol that can be used to analyze T lymphocyte migration in vitro.

Isolamento T de linfócitos humanos, Cultura e Análise da Migração In Vitro</em

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular ...

Imunologia e Infecção

Adhesion Frequency Assay for In Situ Kinetics Analysis of Cross-Junctional Molecular Interactions at the Cell-Cell Interface

The micropipette adhesion assay was developed in 1998 to measure two-dimensional (2D) receptor-ligand binding kinetics1. The assay uses a human red blood cell (RBC) as adhesion sensor and presenting cell for one of the interacting molecules. It employs micromanipulation to bring the RBC into contact with another cell that expresses the other interacting molecule with precisely controlled area and time to enable bond formation. The adhesion event is detected as RBC elongation upon pulling the two cells apart. By controlling the density of the ligands immobilized on the RBC surface, the probability of adhesion is kept in mid-range between 0 and 1. The adhesion probability is estimated from the frequency of adhesion events in a sequence of repeated contact cycles between the two cells for a given contact time. Varying the contact time generates a binding curve. Fitting a probabilistic model for receptor-ligand reaction kinetics1 to the binding curve returns the 2D affinity and off-rate.
The assay has been validated using interactions of Fc&gamma; receptors with IgG Fc1-6, selectins with glycoconjugate ligands6-9, integrins with ligands10-13, homotypical cadherin binding14, T cell receptor and coreceptor with peptide-major histocompatibility complexes15-19.
The method has been used to quantify regulations of 2D kinetics by biophysical factors, such as the membrane microtopology5, membrane anchor2, molecular orientation and length6, carrier stiffness9, curvature20, and impingement force20, as well as biochemical factors, such as modulators of the cytoskeleton and membrane microenvironment where the interacting molecules reside and the surface organization of these molecules15,17,19.
The method has also been used to study the concurrent binding of dual receptor-ligand species3,4, and trimolecular interactions19 using a modified model21.
The major advantage of the method is that it allows study of receptors in their native membrane environment. The results could be very different from those obtained using purified receptors17. It also allows study of the receptor-ligand interactions in a sub-second timescale with temporal resolution well beyond the typical biochemical methods.
To illustrate the micropipette adhesion frequency method, we show kinetics measurement of intercellular adhesion molecule 1 (ICAM-1) functionalized on RBCs binding to integrin &alpha;L&beta;2 on neutrophils with dimeric E-selectin in the solution to activate &alpha;L&beta;2.

Adhesion Frequency Assay for In Situ Kinetics Analysis of Cross-Junctional Molecular Interactions at the Cell-Cell Interface

An adhesion frequency assay for measuring receptor-ligand interaction kinetics when both molecules are anchored on the surfaces of the interacting cells is described. This mechanically-based assay is exemplified using a micropipette-pressurized human red blood cell as adhesion sensor and integrin &alpha;L&beta;2 and intercellular adhesion molecule-1 as interacting receptors and ligands.

Ensaio de aderência de freqüência para In Situ Análise Cinética de Cross-juncional interações moleculares na interface célula-célula

The micropipette adhesion assay was developed in 1998 to measure two-dimensional (2D) receptor-ligand binding kinetics1. The assay uses a human red blood ...

Bioengenharia

Bead Aggregation Assays for the Characterization of Putative Cell Adhesion Molecules

Cell-cell adhesion is fundamental to multicellular life and is mediated by a diverse array of cell surface proteins. However, the adhesive interactions for many of these proteins are poorly understood. Here we present a simple, rapid method for characterizing the adhesive properties of putative homophilic cell adhesion molecules. Cultured HEK293 cells are transfected with DNA plasmid encoding a secreted, epitope-tagged ectodomain of a cell surface protein. Using functionalized beads specific for the epitope tag, the soluble, secreted fusion protein is captured from the culture medium. The coated beads can then be used directly in bead aggregation assays or in fluorescent bead sorting assays to test for homophilic adhesion. If desired, mutagenesis can then be used to elucidate the specific amino acids or domains required for adhesion. This assay requires only small amounts of expressed protein, does not require the production of stable cell lines, and can be accomplished in 4 days.

Here we present a simple, rapid method for characterizing the intrinsic adhesive properties of putative cell adhesion molecules. The secreted, epitope-tagged ectodomain of a cell adhesion molecule is captured from the culture medium on small, uniform functionalized beads. These beads can then be used immediately in simple bead aggregation assays.

Conta Agregação ensaios para a caracterização dos putativos Moléculas de Adesão Celular

Cell-cell adhesion is fundamental to multicellular life and is mediated by a diverse array of cell surface proteins. However, the adhesive interactions ...

Assay of Adhesion Under Shear Stress for the Study of T Lymphocyte-Adhesion Molecule Interactions

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and interaction with antigen presenting cells (APC) in the formation of immunological synapses. These two contexts of T cell adhesion differ in that T cell-APC interactions can be considered static, while T cell-blood vessel interactions are challenged by the shear stress generated by circulation itself. T cell-APC interactions are classified as static in that the two cellular partners are static relative to each other. Usually, this interaction occurs within the lymph nodes. As a T cell interacts with the blood vessel wall, the cells arrest and must resist the generated shear stress.1,2 These differences highlight the need to better understand static adhesion and adhesion under flow conditions as two distinct regulatory processes. The regulation of T cell adhesion can be most succinctly described as controlling the affinity state of integrin molecules expressed on the cell surface, and thereby regulating the interaction of integrins with the adhesion molecule ligands expressed on the surface of the interacting cell. Our current understanding of the regulation of integrin affinity states comes from often simplistic in vitro model systems. The assay of adhesion using flow conditions described here allows for the visualization and accurate quantification of T cell-epithelial cell interactions in real time following a stimulus. An adhesion under flow assay can be applied to studies of adhesion signaling within T cells following treatment with inhibitory or stimulatory substances. Additionally, this assay can be expanded beyond T cell signaling to any adhesive leukocyte population and any integrin-adhesion molecule pair.

This flow adhesion assay provides a simple, high impact model of T cell-epithelial cell interactions. A syringe pump is used to generate shear stress, and confocal microscopy captures images for quantification. The goal of these studies is to effectively quantify T cell adhesion using flow conditions.

Ensaio de Adesão Sob tensão de cisalhamento para o Estudo da Linfócitos T-Molécula de adesão de Interações

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and ...

Imaging Integrin Tension and Cellular Force at Submicron Resolution with an Integrative Tension Sensor

Molecular tension transmitted by integrin-ligand bonds is the fundamental mechanical signal in the integrin pathway that plays significant roles in many cell functions and behaviors. To calibrate and image integrin tension with high force sensitivity and spatial resolution, we developed an integrative tension sensor (ITS), a DNA-based fluorescent tension sensor. The ITS is activated to fluoresce if sustaining a molecular tension, thus converting force to fluorescent signal at the molecular level. The tension threshold for ITS activation is tunable in the range of 10&#8211;60 pN that well covers the dynamic range of integrin tension in cells. On a substrate grafted with an ITS, the integrin tension of adherent cells is visualized by fluorescence and imaged at submicron resolution. The ITS is also compatible with cell structural imaging in both live cells and fixed cells. The ITS has been successfully applied to the study of platelet contraction and cell migration. This paper details the procedure for the synthesis and application of the ITS in the study of integrin-transmitted cellular force.

Integrin tension plays important roles in various cell functions. With an integrative tension sensor, integrin tension is calibrated with picoNewton (pN) sensitivity and imaged at submicron resolution.

Imagem latente integrina tensão e força celular com resolução de Submicron com um Sensor de tensão Integrativa

Molecular tension transmitted by integrin-ligand bonds is the fundamental mechanical signal in the integrin pathway that plays significant roles in many ...

Dynamic Adhesion Assay for the Functional Analysis of Anti-adhesion Therapies in Inflammatory Bowel Disease

Gut homing of immune cells is important for the pathogenesis of inflammatory bowel diseases (IBD). Integrin-dependent cell adhesion to addressins is a crucial step in this process and therapeutic strategies interfering with adhesion have been successfully established. The anti-&#945;4&#946;7 integrin antibody, vedolizumab, is used for the clinical treatment of Crohn&#39;s disease (CD) and ulcerative colitis (UC) and further compounds are likely to follow.
The details of the adhesion procedure and the action mechanisms of anti-integrin antibodies are still unclear in many regards due to the limited available techniques for the functional research in this field.
Here, we present a dynamic adhesion assay for the functional analysis of human cell adhesion under flow conditions and the impact of anti-integrin therapies in the context of IBD. It is based on the perfusion of primary human cells through addressin-coated ultrathin glass capillaries with real-time microscopic analysis. The assay offers a variety of opportunities for refinements and modifications and holds potentials for mechanistic discoveries and translational applications.

Dynamic adhesion of immune cells to the vessel wall is a prerequisite for gut homing. Here, we present a protocol for a functional in vitro assay for the impact analysis of anti-integrin antibodies, chemokines or other factors on the dynamic cell adhesion of human cells using addressin-coated capillaries.

Ensaio de adesão dinâmico para a análise funcional das terapias antiaderência na doença inflamatória intestinal

Gut homing of immune cells is important for the pathogenesis of inflammatory bowel diseases (IBD). Integrin-dependent cell adhesion to addressins is a ...

Triagem de inibidores de ativação da integrina β2 em neutrófilos humanos

A Flow Cytometry-Based High-Throughput Technique for Screening Integrin-Inhibitory Drugs

This protocol aims to establish a method for identifying small molecular antagonists of &#946;2 integrin activation, utilizing conformational-change-reporting antibodies and high-throughput flow cytometry. The method can also serve as a guide for other antibody-based high-throughput screening methods. &#946;2 integrins are leukocyte-specific adhesion molecules that are crucial in immune responses. Neutrophils rely on integrin activation to exit the bloodstream, not only to fight infections but also to be involved in multiple inflammatory diseases. Controlling &#946;2 integrin activation presents a viable approach for treating neutrophil-associated inflammatory diseases. In this protocol, a monoclonal antibody, mAb24, which specifically binds to the high-affinity headpiece of &#946;2 integrins, is utilized to quantify &#946;2 integrin activation on isolated primary human neutrophils. N-formylmethionyl-leucyl-phenylalanine (fMLP) is used as a stimulus to activate neutrophil &#946;2 integrins. A high-throughput flow cytometer capable of automatically running 384-well plate samples was used in this study. The effects of 320 chemicals on &#946;2 integrin inhibition are assessed within 3 h. Molecules that directly target &#946;2 integrins or target molecules in the G protein-coupled receptor-initiated integrin inside-out activation signaling pathway can be identified through this approach.

Autor em destaque: Desenvolvimento de um método para identificar pequenos antagonistas moleculares da ativação da integrina β2 

This protocol describes a flow cytometry-based, high-throughput screening method to identify small-molecule drugs that inhibit &#946;2 integrin activation on human neutrophils.

Uma Técnica de Alto Rendimento Baseada em Citometria de Fluxo para Triagem de Drogas Inibidoras de Integrinas

This protocol aims to establish a method for identifying small molecular antagonists of &#946;2 integrin activation, utilizing ...

Tension Gauge Tether Probes for Quantifying Growth Factor Mediated Integrin Mechanics and Adhesion

Multicellular organisms rely on interactions between membrane receptors and cognate ligands in the surrounding extracellular matrix (ECM) to orchestrate multiple functions, including adhesion, proliferation, migration, and differentiation. Mechanical forces can be transmitted from the cell via the adhesion receptor integrin to ligands in the ECM. The amount and spatial organization of these cell-generated forces can be modulated by growth factor receptors, including epidermal growth factor receptor (EGFR). The tools currently available to quantify crosstalk-mediated changes in cell mechanics and relate them to&#160;focal adhesions, cellular morphology, and signaling are limited. DNA-based molecular force sensors known as tension gauge tethers (TGTs) have been employed to quantify these changes. TGT probes are unique in their ability to both modulate the underlying force threshold and report piconewton scale receptor forces across the entire adherent cell surface at diffraction-limited spatial resolution. The TGT probes used here rely on the irreversible dissociation of a DNA duplex by receptor-ligand forces that generate a fluorescent signal. This allows quantification of the cumulative integrin tension (force history) of the cell. This article describes a protocol employing TGTs to study the impact of EGFR on integrin mechanics and adhesion formation. The assembly of&#160;the TGT mechanical sensing platform is systematically detailed and the procedure to image forces, focal adhesions, and cell spreading is outlined. Overall, the ability to modulate the underlying force threshold of the probe, the adhesion ligand, and the type and concentration of growth factor employed for stimulation make this a robust platform for studying the interplay of diverse membrane receptors in regulating integrin-mediated forces.

TGT surface is an innovative platform to study growth factor-integrin crosstalk. The flexible probe design, specificity of the adhesion ligand, and precise modulation of stimulation conditions allow robust quantitative assessments of EGFR-integrin interplay. The results highlight EGFR as a 'mechano-organizer' tuning integrin mechanics, influencing focal adhesion assembly and cell spreading.

Sondas de tether medidor de tensão para quantificar fator de crescimento mediado mecânica integrin e adesão

Multicellular organisms rely on interactions between membrane receptors and cognate ligands in the surrounding extracellular matrix (ECM) to orchestrate ...

Estática Adesão Ensaio para o Estudo da integrina Ativação em Linfócitos T

Resumo

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Isolamento T de linfócitos humanos, Cultura e Análise da Migração In Vitro

Ensaio de aderência de freqüência para In Situ Análise Cinética de Cross-juncional interações moleculares na interface célula-célula

Conta Agregação ensaios para a caracterização dos putativos Moléculas de Adesão Celular

Ensaio de Adesão Sob tensão de cisalhamento para o Estudo da Linfócitos T-Molécula de adesão de Interações

Imagem latente integrina tensão e força celular com resolução de Submicron com um Sensor de tensão Integrativa

Ensaio de adesão dinâmico para a análise funcional das terapias antiaderência na doença inflamatória intestinal

Uma Técnica de Alto Rendimento Baseada em Citometria de Fluxo para Triagem de Drogas Inibidoras de Integrinas

Uma Técnica de Alto Rendimento Baseada em Citometria de Fluxo para Triagem de Drogas Inibidoras de Integrinas

Uma Técnica de Alto Rendimento Baseada em Citometria de Fluxo para Triagem de Drogas Inibidoras de Integrinas

Sondas de tether medidor de tensão para quantificar fator de crescimento mediado mecânica integrin e adesão