Os autores agradecem a V. Jayaraman, DS Kim, LL Looger e K. Svoboda do Projeto Indicador e Efeito Neuronal (GENIE) codificado genéticamente no Campus de Investigação Janelia do Instituto Médico Howard Hughes por sua generosa doação de AAV1-GCaMP6f Para o Núcleo do Vector da Universidade da Pensilvânia. Eles também gostariam de agradecer a A. Olson e Neuroscience Microscopy Core na Universidade de Stanford apoiada pelo NIH NS069375 para os seus serviços de microscopia confocal.

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Os autores leram a política da revista e têm os seguintes interesses concorrentes: SG, SO e VC são funcionários remunerados da Inscopix.

Compreender a atividade do circuito neural durante o comportamento desperto é um nível vital de investigação neurocientífica necessária para efetivamente dissecar a função cerebral na saúde e na doença. O córtex é uma região particularmente importante para estudar no contexto do comportamento desperto, pois desempenha um papel importante em muitas funções sensoriais, cognitivas e executivas vitais 28 , 29 . A coluna cortical é pensada para ser a unidade funcional básica no córtex e a atividade de nível populacional de células corticais é conhecida por diferir com base em sua localização física dentro da coluna. Por exemplo, neurônios excitatórios nas camadas 2/3 no córtex somatossensorial, principalmente para outras regiões neocorticais e modulam outras redes corticais 30 , enquanto que as células em camadas mais profundas são projetadas principalmente para regiões subcorticais como o tálamo 31 . Gravando a atividade de cemS de células corticais pré-especificadas simultaneamente e de forma confiável ao longo do tempo em diferentes lâminas em indivíduos que se comportam livremente, avançarão muito nossa compreensão do fluxo de informação cortical, permitindo uma dissecação funcional mais fina de colunas corticais informadas por informações comportamentais em tempo real e tempo- Escalas. A coleta deste nível de dados do circuito neural é possível com o uso de uma plataforma de microscopia miniaturizada eficiente e racionalizada para conduzir imagens de Ca 2+ em larga escala em indivíduos que se comportam livremente (ou assuntos fixos de cabeça, conforme desejado). Usado com indicadores de cálcio codificados geneticamente para permitir a segmentação específica do tipo celular e imaginar um campo de visão de camada múltipla fornecido por uma sonda de prisma implantada cronicamente, este protocolo explorou um caso entre muitas aplicações possíveis: observando diferenças laminares no processamento cortical somatossensorial quando os ratos Fisicamente envolvido com um novo objeto ( Figura 5 ).Esta é a primeira ilustração processual desse tipo de abordagem específica do tipo celular, in vivo , para estudar múltiplas camadas corticais em animais acordados e de comportamento livre, e amplia o espectro de métodos experimentais disponíveis para compreender as estruturas laminares no cérebro ativo. O campo de visão periscopico habilitado pela sonda de prisma nesta técnica pode ser aplicado de forma viável a outras estruturas cerebrais quando a preservação do tecido diretamente dorsal para uma região de interesse é desejada; Por exemplo, a imagem CA3 pode ser alcançada sem interrupção da função do hipocampo. A abordagem baseada em sonda de prisma para imaginar a atividade de Ca 2 + requer a inserção física e implantação permanente de um microprisma no córtex, o que equivale à criação de uma lesão cortical onde a sonda da lente está inserida. Isso pode resultar em interrupções nos circuitos neurais locais, incluindo a separação de dendritos e processos apical. TSeu procedimento também causará uma ativação inicial das células gliais na região, embora isso seja esperado para ser localizado no tecido a cerca de 150 μm do rosto do prisma e para diminuir após o cérebro curar 22 . É muito importante considerar se esta técnica afetará a anatomia do circuito normal e / ou o comportamento dos animais ao planejar experimentos. Os grupos de controle comportamental devem sempre ser conduzidos para garantir que não haja alterações significativas nos comportamentos basais que possam produzir resultados experimentais confusos. A utilização desta técnica de imagem móvel miniaturais, Ca 2 + com manipulação neurofarmacológica, vários paradigmas comportamentais cognitivos, sociais, motores ou intrínsecos e combinando-a com outras métricas fisiológicas pode aprofundar e enriquecer os estudos focados na compreensão dos papéis funcionais dos circuitos neurais no comportamento e no sinal Processamento 32 . Supressão ou ativaçãoAção de certos caminhos modulados por drogas pode influenciar os comportamentos associados, que podem ser facilmente estudados usando esta tecnologia 33 . Ramificar para diferentes tipos de células, modificando a segmentação do indicador de cálcio é outra aplicação poderosa e útil, e permite muitas combinações criativas de ferramentas experimentais para abordar diversas questões do circuito neural.

O córtex é um jogador essencial em muitas funções mentais e comportamentais complexas, desde a atenção, a percepção sensorial e o controle cognitivo de cima para baixo 1 , 2 , 3 para vias de motivação, recompensa e dependência 4 , 5 . Compreender os processos computacionais subjacentes à sua função é um objetivo importante para melhorar a compreensão clínica de muitas doenças mentais e comportamentais. Muitas teorias atuais da doença psiquiátrica se centram na idéia de que a disfunção ou a discordância do circuito neural cortical podem estar subjacentes a anormalidades cognitivas e comportamentais que são características de condições como esquizofrenia 6 , autismo 7 ou transtorno obsessivo-compulsivo 8 . Assim, obtendo dados de atividade neural de nível populacional de coOs circuitos físicos dentro do contexto adequado da informação comportamental simultânea são de grande importância e, idealmente, podem ser direcionados a tipos de células específicos para uma dissecação mais fina do circuito neural. Os microscópios miniaturizados, em conjunto com microfilmes de índice de refração de gradiente implantável (GRIN) permitem o acesso óptico a conjuntos neuronais sob condições de movimento livre de uma diversidade de possíveis regiões cerebrais 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , incluindo o córtex 14 , 15 , 16 . O uso de um sistema de microscopia móvel acoplado com indicadores de cálcio codificados geneticamente permite uma imagem consistente da mesma população celular que engloba centenas de neurônios ao longo de dias a semanas em muitas regiões cerebrais 9 e pode serGeneticamente direcionados para tipos de células específicas usando vetores virais ou técnicas transgênicas. Como o córtex é conhecido por suportar diferentes funções e se conectar a regiões cerebrais diferentes dependendo da localização das células dentro da lâmina cortical 17 , 18 , 19 , estamos interessados ​​em obter atividade neural multi-camada simultânea em indivíduos com comportamentos acordados. Aqui, demonstramos como a imagem de centenas de neurônios marcados fluorescentemente em ratos que se comportam livremente ao longo de dias, usando o microscópio de fluorescência miniaturizado 20 emparelhado com uma sonda de prisma implantada, que oferece uma visão multicamada do córtex ( Figura 1 ). A sonda de prisma utilizada aqui é composta por duas lentes GRIN separadas: um prisma e uma lente de relé cilíndrica ( Figura 1 ). A luz do microscópio excita a etiqueta fluorescenteCélulas localizadas ao longo da face de imagem da sonda de prisma, após refletir a hipotenusa da porção de prisma da sonda. A luz emitida das células também se reflete na hipotenusa do prisma, é coletada através do objetivo do microscópio e atinge o sensor no microscópio. A sonda de prisma utilizada neste procedimento é adaptada para fácil utilização com equipamentos estereotáxicos padrão. O microscópio de fluorescência miniaturizado 20 detecta transientes de Ca 2+ evocados por potencial de ação em populações neuronais com resolução de célula única, depois que essas células foram especificamente marcadas com indicadores fluorescentes sensíveis a c2 + sensíveis a genes. Neste protocolo, injetamos o indicador de Ca 2+ codificado em um vetor viral (AAV1.CaMKII.GCaMP6f.WPRE.SV40), implantamos uma sonda de prisma, instalamos o microscópio e, em seguida, obtemos vários dias de dados da atividade neuronal somatossensorial (membro do membro traseiro S1) De uma exposição animalD para novas superfícies de objetos durante a exploração livre ( Figura 2 ).

<table><tbody><tr><td>Neurostar Motorized&lt;br/&gt; Ultra Precise Small Animal Stereotaxic Instrument</td><td>Kopf</td><td>Model 963SD</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Stereoscope</td><td>Labomed</td><td>Prima DNT</td><td>Surgery and Imaging</td></tr><tr><td>Mini Rectal Thermistor Probe (.062&quot;/1.6 mm diameter) - 1/4&quot; Jack</td><td>FHC</td><td>40-90-5D-02</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Heating Pad 5 X 12.5 cm&amp;nbsp;</td><td>FHC</td><td>40-90-2-07</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>DC Temperature Controller</td><td>FHC</td><td>40-90-8D</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Microsyringe Pump</td><td>World Precision Instruments</td><td>UMP3 model; serial 155788 F110</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>NanoFil 10 &amp;mu;L Syringe</td><td>World Precision Instruments</td><td>NANOFIL</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>35 G Beveled Tip Nanofil NDL 2PK</td><td>World Precision Instruments</td><td>NF35BV-2</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Omnidrill35, 115 - 230 V</td><td>World Precision Instruments</td><td>503598</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Burrs for Micro Drill</td><td>Fine Science Tools</td><td>19007-05</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>nVista</td><td>Inscopix</td><td>100-001048</td><td>Imaging</td></tr><tr><td>AAV1.CaMKII.GCaMP6f.WPRE.SV40</td><td>Penn Vector Core</td><td>AV-1-PV3435</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Ketoprofen</td><td>Victor Medical</td><td>5487</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Carprofen</td><td>Victor Medical</td><td>1699008&amp;nbsp;</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Victor Medical</td><td>1001054</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Gelfoam (Patterson Veterinary Supply Inc Gelfoam Sponge 12 cm x 7 mm)</td><td>Pfizer (Fisher Scientific)</td><td>NC9841478</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Dumont #5/45 forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-35</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Dumont #5 forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-30</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Dissecting knives</td><td>Fine Science Tools</td><td>10055-12</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>ProView Implant Kit</td><td>Inscopix</td><td>100-000756</td><td>Surgery and Imaging</td></tr><tr><td>ProView Prism Probe 1.0 mm-Dia. ~4.3 mm Length</td><td>Inscopix</td><td>100-000592</td><td>Surgery and Imaging</td></tr><tr><td>Kwik-Sil adhesive pack of 2</td><td>World Precision Instruments</td><td>KWIK-SIL</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Kwik-Cast Sealant</td><td>World Precision Instruments</td><td>KWIK-CAST</td><td>Surgery and Imaging</td></tr><tr><td>Miniature Optical Mounting Post</td><td>Newport</td><td>M-TSP-3</td><td>Imaging</td></tr><tr><td>Microscope Baseplate</td><td>Inscopix</td><td>BPL-2</td><td>Imaging</td></tr><tr><td>Microscope Baseplate Cover</td><td>Inscopix</td><td>BPC-2</td><td>Imaging</td></tr></tbody></table>

multi-layer cortical ca2+ imaging in freely moving mice with prism probes and miniaturized fluorescence microscopy

O circuito in vivo e a imagem funcional de nível celular é uma ferramenta crítica para a compreensão do cérebro em ação. A imagem em alta resolução de neurônios corticais de mouse com microscopia de dois fótons forneceu informações únicas sobre estrutura cortical, função e plasticidade. No entanto, esses estudos são limitados aos animais fixos de cabeça, reduzindo grandemente a complexidade comportamental disponível para estudo. Neste artigo, descrevemos um procedimento para a realização de microscopia de fluorescência crônica com resolução celular em múltiplas camadas corticais em ratos de comportamento livre. Utilizamos um microscópio de fluorescência miniaturizado integrado emparelhado com uma sonda de prisma implantada para visualizar simultaneamente e registrar a dinâmica de cálcio de centenas de neurônios em várias camadas do córtex somatossensorial, enquanto o mouse se envolveu em uma nova tarefa de exploração de objetos em vários dias. Esta técnica pode ser adaptada a outras regiões do cérebro em diferentes espécies animais para outros comportamentos pAradigmas.

O protocolo descrito aqui descreve uma maneira efetiva e eficiente de realizar imagens longitudinais de Ca 2+ de várias camadas a partir de centenas de neurônios corticais em ratos de comportamento livre usando sondas de prisma ( Figura 1 ). As abordagens anteriores para a imagem cortical de várias camadas foram primariamente restritas aos animais fixos de cabeça 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 . Para adquirir esse nível de dados em um contexto de comportamento livre, utilizou-se uma plataforma de microscópio miniaturizado para flexibilidade comportamental; Um indicador de cálcio codificado geneticamente (GCaMP6f) foi usado para atingir uma população celular específica (células CAMKII + no córtex); E uma sonda de prisma foi escolhida para fornecer um campo de visão crônico e multicamadas. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; Demonstrou o fluxo de trabalho para a preparação do animal para imagens. Um vetor viral que codifica um indicador de cálcio apropriado foi injetado no córtex ( Figura 2 , Etapa 1), antes de implantar cronicamente uma sonda de prisma para habilitar o acesso óptico às células rotuladas ( Figura 2 , Etapa 2). Uma placa de base que serve como uma doca segura e temporária para o posicionamento do microscópio durante as sessões de imagem foi então instalada sobre a cabeça do animal ( Figura 2 , Etapa 3), permitindo a visualização da atividade cortical em múltiplas camadas de células em um experimento de comportamento acordado Configuração ( Figura 2 , Etapa 4). Para assegurar que a população celular desejada estivesse sendo alvo, uma seção de cérebro coronal pós mortem de um mouse representativo é mostrada na Figura 3 com o traço da sonda do prisma e o campo de visão marcado em relação ao laboratório GCaMP6fNeurônios em camadas 2/3 e 5 do córtex somatossensorial. Durante a imagem de comportamento acordado com o sistema, a atividade dos neurônios corticais somatossensoriais foi registrada quando o mouse foi exposto a três ambientes diferentes: Campo aberto (Dia 1), Familiarização com Objetos (Dia 2-4) e Objeto Novo (Dia 5) ( Figura 4 ). No dia 1, o mouse foi colocado em uma arena comportamental desprovida de qualquer objeto. No dia 2-4, o mouse foi colocado na arena com os mesmos dois objetos texturalmente diferentes (um bloco de gel e um bloco de madeira). No dia 5, um dos objetos foi substituído por um novo objeto. O animal foi fotografado em 5 dias por 20 minutos por dia. Após a extração celular usando o software de análise de dados de imagem do Ca 2+ , os filtros espaciais correspondentes aos locais das células foram sobrepostos na projeção de intensidade fluorescente média dos dados de gravação do microscópio( Figura 5) . Uma linha tracejada branca separa camadas 2/3 e 5 células. Os traços correspondentes de Ca 2+ de 5 células de cada uma das camadas mostram o padrão de disparo das células em dois contextos comportamentais diferentes: Object Familiarization e Novel Object Exposure. As células da camada 2/3 foram mais ativas em comparação com as células da camada 5 no dia em que o mouse foi exposto a um novo objeto. Isso também é evidente a partir das parcelas de quadriciclo que mostram a atividade de disparo limiar de todas as células fotográficas nos dias 1, 4 e 5. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/55579/55579fig1.jpg" /> Figura 1: In Vivo Ca 2 + Imaging através de múltiplas camadas corticais em ratos de movimento livre. ( A ) Especificações da sonda prisma e representação do plano de imagem. O revestimento reflexivo no interior da hipotenusa permite a formação de imagens de 90 ° a partir do plano de inserção da sonda prisma. O cuFf integra-se com o suporte da lente, que agiliza o procedimento de implantação e permite a visualização potencial da fluorescência do tecido ambiente durante a implantação ( B ) (i). Ilustração da colocação de craniotomia de sonda de prisma e incisão de faca em relação ao local de injeção de vírus, e (ii) ilustração da localização do lado plano da sonda de prisma em relação à incisão de faca e ao local de injeção de vírus. ( C ) Ilustração da instalação de imagem Ca 2+ in vivo mostrando o caminho da luz para uma pequena área dentro do campo de visão completo através da sonda de prisma implantada no córtex do mouse. ( D ) Exemplo de campo de visão durante a instalação da sonda prisma. O microscópio em miniatura está ligado ao suporte da lente, que contém a sonda de prisma permitindo verificar a expressão do vírus durante a instalação da sonda de prisma. ( E ) Integração de microscópio com sonda de prisma para imagens corticais de várias camadas de células S1 marcadas com GCaMP6f. F Exemplo de campo de visãoDurante a instalação da placa base. O padrão de vasos sanguíneos claros é visível no momento da instalação da placa base com algumas células na imagem em bruto. Mais células são claramente visíveis quando DF / F é ativado na janela do software de aquisição. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55579/55579fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55579/55579fig2.jpg" /> Figura 2: Esquema mostrando o cronograma dos eventos de fluxo de trabalho para implantação de implante de prisma e instalação de microscópio. O número de semanas é representado no eixo X e as etapas do fluxo de trabalho dos procedimentos ao longo do eixo Y. ( A ) Gráfico ilustrando a injeção viral (AAV1.CaMKII.GCaMP6f.WPRE.SV40) ao longo do mesmo eixo dorso-ventral, para rotular várias camadas do córtex somatossensorial do mouse. ( B ) 2 semanas após injeções de vírus, um problema de prismaE é implantado em um eixo paralelo aos sites de injeção de vírus. ( C ) Aproximadamente uma semana após a implantação da sonda do prisma, o animal é verificado para a expressão com o microscópio e uma placa de base é montada na cabeça se uma população de células estiver visível. ( D ) O animal está pronto para imagens crônicas durante tarefas comportamentais relevantes (clip art do mouse modificado após permissão de UW-Madison Biochemistry MediaLab). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55579/55579fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/55579/55579fig3.jpg" /> Figura 3: Validação histológica pós-mortem da localização da sonda prisma e expressão GCaMP. ( A ) Seção Coronal de um cérebro de mouse representativo que mostra o traço da sonda do prisma e com o lado da imagem voltadaAs células que expressam GCaMP6f (AAV1.CaMKII.GCaMP6f expressadas nos neurônios nas camadas 2/3 e 5). ( B ) Mesma seção do coração coronal após a coloração para DAPI. Barra de escala = 250 μm ( C ) Zoomed vista de GCaMP6f expressando células no córtex somatossensorial. Barra de escala = 100 μm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55579/55579fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/55579/55579fig4.jpg" /> Figura 4: A atividade do mouse durante a habituação, a familiarização e o teste de exposição de objetos novos foram rastreados por vídeo usando o software de vídeo. ( A ) No dia 1, o animal foi colocado em uma arena comportamental desprovida de qualquer objeto (campo aberto). ( B ) Nos dias 2-4, os mesmos dois objetos texturizados diferentes (gel pad e bloco de madeira) foram colocados na arena (Object FamiLiarização). ( C ) No dia 5, um dos objetos foi substituído por um novo objeto (bloco de madeira com papel de areia) (Novel Object Exposure). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55579/55579fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/55579/55579fig5.jpg" /> Figura 5: Dinâmica do cálcio de camadas superficiais e profundas do córtex somatossensorial de um mouse representado com o Microscópio. ( A ) Imagem mesclada de filtros espaciais neuronais (bolhas verdes) e projeção média de intensidade de fluorescência da gravação do microscópio através do campo de visão da sonda prisma. Borda entre camadas supragranular e infragranular indicadas por uma linha tracejada branca. Barra de escala = 100 μm. ( B ) Traços de cálcio de cinco exemplos de células superficiais e de camada profunda (cheio azul e vermelho cElls no painel A), indicando unidades de desvio padrão de fluorescência após análise de componente principal e independente. Barra de escala horizontal 50 s e barra de escala vertical 10 SD ( C ) Raster parcela de células de camadas superficiais (camadas 2/3) e profundas (camada 5) mostradas em campo aberto, Familiarização de objetos e exploração de novo objeto. Barra de escala = 100 s. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55579/55579fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Multi-layer Cortical Ca2+ Imaging in Freely Moving Mice with Prism Probes and Miniaturized Fluorescence Microscopy

Aqui, apresentamos um procedimento para a realização de imagens de Ca 2 + em larga escala com resolução celular em múltiplas camadas corticais em camundongos que se movem livremente. Centenas de células ativas podem ser observadas simultaneamente usando um microscópio em miniatura montado na cabeça acoplado com uma sonda de prisma implantada.

Multi-layer Cortical Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Imaging em ratos com movimento livre com sondas de prisma e microscopia de fluorescência miniaturizada

In vivo circuit and cellular level functional imaging is a critical tool for understanding the brain in action. High resolution imaging of mouse cortical ...

multi-layer-cortical-ca2-imaging-freely-moving-mice-with-prism-probes

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Behavior

Multi-layer Cortical Ca2+ Imaging in Freely Moving Mice with Prism Probes and Miniaturized Fluorescence Microscopy

30.9K visualizações.  Inscopix Inc..  Aqui, apresentamos um procedimento para a realização de imagens de Ca 2 + em larga escala com resolução celular em múltiplas camadas corticais em camundongos que se movem livremente. Centenas de células ativas podem ser observadas simultaneamente usando um microscópio em miniatura montado na cabeça acoplado com uma sonda de prisma implantada. 

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Two-photon Calcium Imaging in Mice Navigating a Virtual Reality Environment

In recent years, two-photon imaging has become an invaluable tool in neuroscience, as it allows for chronic measurement of the activity of genetically identified cells during behavior1-6. Here we describe methods to perform two-photon imaging in mouse cortex while the animal navigates a virtual reality environment. We focus on the aspects of the experimental procedures that are key to imaging in a behaving animal in a brightly lit virtual environment. The key problems that arise in this experimental setup that we here address are: minimizing brain motion related artifacts, minimizing light leak from the virtual reality projection system, and minimizing laser induced tissue damage. We also provide sample software to control the virtual reality environment and to do pupil tracking. With these procedures and resources it should be possible to convert a conventional two-photon microscope for use in behaving mice.

Here we describe the experimental procedures involved in two-photon imaging of mouse cortex during behavior in a virtual reality environment.

Dois fótons de imagem de cálcio em camundongos Navegando um ambiente da realidade virtual

In recent years, two-photon imaging has become an invaluable tool in neuroscience, as it allows for chronic measurement of the activity of genetically ...

Comportamento

In Vivo 2-Photon Calcium Imaging in Layer 2/3 of Mice

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons . In-vivo two-photon calcium imaging is the only method that allows one to record the activity of a dense neuronal population with single-cell resolution . The method consists in implanting a cranial imaging window, injecting a fluorescent calcium indicator dye that can be taken up by large numbers of neurons and finally recording the activity of neurons with time lapse calcium imaging using an in-vivo two photon microscope. Co-injection of astrocyte-specific dyes allows one to differentiate neurons from astrocytes. The technique can be performed in mice expressing fluorescent molecules in specific subpopulations of neurons to better understand the network interactions of different groups of cells.

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons . In-vivo two-photon calcium imaging is the only method that allows one to record the activity of a dense neuronal population with single-cell resolution .

Vivo em 2-Photon Imagens de cálcio na camada 2 / 3 dos Ratos

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons .  ...

Biologia

Functional Calcium Imaging in Developing Cortical Networks

A hallmark pattern of activity in developing nervous systems is spontaneous, synchronized network activity. Synchronized activity has been observed in intact spinal cord, brainstem, retina, cortex and dissociated neuronal culture preparations. During periods of spontaneous activity, neurons depolarize to fire single or bursts of action potentials, activating many ion channels. Depolarization activates voltage-gated calcium channels on dendrites and spines that mediate calcium influx. Highly synchronized electrical activity has been measured from local neuronal networks using field electrodes. This technique enables high temporal sampling rates but lower spatial resolution due to integrated read-out of multiple neurons at one electrode. Single cell resolution of neuronal activity is possible using patch-clamp electrophysiology on single neurons to measure firing activity. However, the ability to measure from a network is limited to the number of neurons patched simultaneously, and typically is only one or two neurons. The use of calcium-dependent fluorescent indicator dyes has enabled the measurement of synchronized activity across a network of cells. This technique gives both high spatial resolution and sufficient temporal sampling to record spontaneous activity of the developing network.
A key feature of newly-forming cortical and hippocampal networks during pre- and early postnatal development is spontaneous, synchronized neuronal activity (Katz &amp; Shatz, 1996; Khaziphov &amp; Luhmann, 2006). This correlated network activity is believed to be essential for the generation of functional circuits in the developing nervous system (Spitzer, 2006). In both primate and rodent brain, early electrical and calcium network waves are observed pre- and postnatally in vivo and in vitro (Adelsberger et al., 2005; Garaschuk et al., 2000; Lamblin et al., 1999). These early activity patterns, which are known to control several developmental processes including neuronal differentiation, synaptogenesis and plasticity (Rakic &amp; Komuro, 1995; Spitzer et al., 2004) are of critical importance for the correct development and maturation of the cortical circuitry.
In this JoVE video, we demonstrate the methods used to image spontaneous activity in developing cortical networks. Calcium-sensitive indicators, such as Fura 2-AM ester diffuse across the cell membrane where intracellular esterase activity cleaves the AM esters to leave the cell-impermeant form of indicator dye. The impermeant form of indicator has carboxylic acid groups which are able to then detect and bind calcium ions intracellularly.. The fluorescence of the calcium-sensitive dye is transiently altered upon binding to calcium. Single or multi-photon imaging techniques are used to measure the change in photons being emitted from the dye, and thus indicate an alteration in intracellular calcium. Furthermore, these calcium-dependent indicators can be combined with other fluorescent markers to investigate cell types within the active network.

Spontaneous activity of developing neuronal networks can be measured using AM-ester forms of calcium-sensitive indicator dyes. Changes in intracellular calcium, indicating neuronal activation, are detected as transient changes in indicator fluorescence with one- or two-photon imaging. This protocol can be adapted for a range of developmentally-dependent neuronal networks in vitro.

Imagem de cálcio funcional em desenvolvimento de redes Cortical

A hallmark pattern of activity in developing nervous systems is spontaneous, synchronized network activity. Synchronized activity has been observed in ...

Neurociência

In vivo Imaging of Deep Cortical Layers using a Microprism

We present a protocol for in vivo imaging of cortical tissue using a deep-brain imaging probe in the shape of a microprism.  Microprisms are 1-mm in size and have a reflective coating on the hypotenuse to allow internal reflection of excitation and emission light.  The microprism probe simultaneously images multiple cortical layers with a perspective typically seen only in slice preparations.  Images are collected with a large field-of-view (~900 &mu;m).  In addition, we provide details on the non-survival surgical procedure and microscope setup.  Representative results include images of layer V pyramidal neurons from Thy-1 YFP-H mice showing their apical dendrites extending through the superficial cortical layer and extending into tufts.  Resolution was sufficient to image dendritic spines near the soma of layer V neurons.  A tail-vein injection of fluorescent dye reveals the intricate network of blood vessels in the cortex.  Line-scanning of red blood cells (RBCs) flowing through the capillaries reveals RBC velocity and flux rates can be obtained. This novel microprism probe is an elegant, yet powerful new method of visualizing deep cellular structures and cortical function in vivo.

In vivo Imaging of Deep Cortical Layers using a Microprism

Right-angle microprisms inserted into the mouse neocortex allows for deep imaging of multiple cortical layers with a viewpoint typically found in slice. One-millimeter microprisms offer a wide field-of-view (~900 &mu;m) and spatial resolutions sufficient to resolve dendritic spines. We demonstrate layer V neuronal imaging and neocortical vascular imaging using microprisms.

Em Imaging vivo do Deep camadas corticais usando um Microprisma

We present a protocol for in vivo imaging of cortical tissue using a deep-brain imaging probe in the shape of a microprism.  Microprisms are 1-mm in size ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the cerebellum. IO has long been proposed to be crucial for motor control and its activity is currently considered to be at the center of many hypotheses of both motor and cognitive functions of the cerebellum. While its physiology and function have been relatively well studied on single-cell level in vitro, presently there are no reports on the organization of the IO network activity in living animals. This is largely due to the extremely challenging anatomical location of the IO, making it difficult to subject to conventional fluorescent imaging methods, where an optic path must be created through the entire brain located dorsally to the region of interest.
Here we describe an alternative method for obtaining state-of-the-art -level calcium imaging data from the IO network. The method takes advantage of the extreme ventral location of the IO and involves a surgical procedure for inserting a gradient-refractive index (GRIN) lens through the neck viscera to come into contact with the ventral surface of the calcium sensor GCaMP6s-expressing IO in anesthetized mice. A representative calcium imaging recording is shown to demonstrate the feasibility to record IO neuron activity after the surgery. While this is a non-survival surgery and the recordings must be conducted under anesthesia, it avoids damage to life-critical brainstem nuclei and allows conducting large variety of experiments investigating spatiotemporal activity patterns and input integration in the IO. This procedure with modifications could be used for recordings in other, adjacent regions of the ventral brainstem.

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

We present a protocol to expose the brainstem of adult mouse from the ventral side. By using a gradient-refractive index lens with a miniature microscope, calcium imaging can be used to examine the activity of inferior olive neural somata in vivo.

In vivo Imagem de cálcio em rato de azeitona inferior

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the ...

Simultaneous Imaging of Microglial Dynamics and Neuronal Activity in Awake Mice

Since brain functions are under the continuous influence of the signals derived from peripheral tissues, it is critical to elucidate how glial cells in the brain sense various biological conditions in the periphery and transmit the signals to neurons. Microglia, immune cells in the brain, are involved in synaptic development and plasticity. Therefore, the contribution of microglia to neural circuit construction in response to the internal state of the body should be tested critically by intravital imaging of the relationship between microglial dynamics and neuronal activity.
Here, we describe a technique for the simultaneous imaging of microglial dynamics and neuronal activity in awake mice. Adeno-associated virus encoding R-CaMP, a gene-encoded calcium indicator of red fluorescence protein, was injected into layer 2/3 of the primary visual cortex in CX3CR1-EGFP transgenic mice expressing EGFP in microglia. After viral injection, a cranial window was installed onto the brain surface of the injected region. In vivo two-photon imaging in awake mice 4 weeks after the surgery demonstrated that neural activity and microglial dynamics could be recorded simultaneously at the sub-second temporal resolution. This technique can uncover the coordination between microglial dynamics and neuronal activity, with the former responding to peripheral immunological states and the latter encoding the internal brain states.

Here, we describe a protocol combining adeno-associated virus injection with cranial window implantation for simultaneous imaging of microglial dynamics and neuronal activity in awake mice.

Imagem Simultânea da Dinâmica Microglial e Atividade Neuronal em Camundongos Acordados

Since brain functions are under the continuous influence of the signals derived from peripheral tissues, it is critical to elucidate how glial cells in ...

In Vivo Wide-Field and Two-Photon Calcium Imaging from a Mouse Using a Large Cranial Window

Wide-field calcium imaging from the mouse&#39;s neocortex allows one to observe cortex-wide neural activity related to various brain functions. On the other hand, two-photon imaging can resolve the activity of local neural circuits at the single-cell level. It is critical to make a large cranial window to perform multiple-scale analysis using both imaging techniques in the same mouse. To achieve this, one must remove a large section of the skull and cover the exposed cortical surface with transparent materials. Previously, glass skulls and polymer-based cranial windows have been developed for this purpose, but these materials are not easily fabricated. The present protocol describes a simple method for making a large cranial window consisting of commercially available polyvinylidene chloride (PVDC) wrapping film, a transparent silicone plug, and a cover glass. For imaging the dorsal surface of an entire hemisphere, the window size was approximately 6 x 3 mm2. Severe brain vibrations were not observed regardless of such a large window. Importantly, the condition of the brain surface did not deteriorate for more than one month. Wide-field imaging of a mouse expressing a genetically-encoded calcium indicator (GECI), GCaMP6f, specifically in astrocytes, revealed synchronized responses in a few millimeters. Two-photon imaging of the same mouse showed prominent calcium responses in individual astrocytes over several seconds. Furthermore, a thin layer of an adeno-associated virus was applied to the PVDC film and successfully expressed GECI in cortical neurons over the cranial window. This technique is reliable and cost-effective for making a large cranial window and facilitates the investigation of the neural and glial dynamics and their interactions during behavior at the macroscopic and microscopic levels.

In Vivo Wide-Field and Two-Photon Calcium Imaging from a Mouse Using a Large Cranial Window

The present protocol describes making a large (6 x 3 mm2) cranial window using food wrap, transparent silicone, and cover glass. This cranial window allows in vivo wide-field and two-photon calcium imaging experiments in the same mouse.

In vivo Imagem de cálcio de campo amplo e de dois fótons de um rato usando uma grande janela craniana

Wide-field calcium imaging from the mouse&#39;s neocortex allows one to observe cortex-wide neural activity related to various brain functions. On the ...

Imagem de cálcio de dois fótons e campo amplo no colículo superior

Calcium Imaging in Mouse Superior Colliculus

The superior colliculus (SC), an evolutionarily conserved midbrain structure in all vertebrates, is the most sophisticated visual center before the emergence of the cerebral cortex. It receives direct inputs from ~30 types of retinal ganglion cells (RGCs), with each encoding a specific visual feature. It remains elusive whether the SC simply inherits retinal features or if additional and potentially de novo processing occurs in the SC. To reveal the neural coding of visual information in the SC, we provide here a detailed protocol to optically record visual responses with two complementary methods in awake mice. One method uses two-photon microscopy to image calcium activity at single-cell resolution without ablating the overlaying cortex, while the other uses wide-field microscopy to image the whole SC of a mutant mouse whose cortex is largely undeveloped. This protocol details these two methods, including animal preparation, viral injection, headplate implantation, plug implantation, data acquisition, and data analysis. The representative results show that the two-photon calcium imaging reveals visually evoked neuronal responses at single-cell resolution, and the wide-field calcium imaging reveals&#160;neural activity across the entire SC. By combining these two methods, one can reveal the neural coding in the SC at different scales, and such combination can also be applied to other brain regions.

Autor em destaque: Revelando a codificação neural e os mecanismos de processamento visual no colículo superior 

This protocol details the procedure for imaging calcium responses in the superior colliculus (SC) of awake mice, including imaging single-neuron activity with two-photon microscopy while leaving the cortex intact in wild-type mice, and imaging the entire SC with wide-field microscopy in partial-cortex mutant mice.

Imagem de cálcio no colículo superior de camundongos

The superior colliculus (SC), an evolutionarily conserved midbrain structure in all vertebrates, is the most sophisticated visual center before the ...

Multi-layer Cortical Ca

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Dois fótons de imagem de cálcio em camundongos Navegando um ambiente da realidade virtual

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Imagem de cálcio funcional em desenvolvimento de redes Cortical

Em Imaging vivo do Deep camadas corticais usando um Microprisma

In vivo Imagem de cálcio em rato de azeitona inferior

Imagem Simultânea da Dinâmica Microglial e Atividade Neuronal em Camundongos Acordados

In vivo Imagem de cálcio de campo amplo e de dois fótons de um rato usando uma grande janela craniana

Imagem de cálcio no colículo superior de camundongos

Imagem de cálcio no colículo superior de camundongos

Imagem de cálcio no colículo superior de camundongos