Agradecemos a todos os membros da Lenne e laboratórios Bertrand, em particular Olivier Blanc para desenvolvimento de software e Jérémie Capoulade para discussão. Agradecemos também a facilidade de imagem PICsL-IBDM, em particular Claude Moretti e Brice Detailleur para suporte técnico. Este trabalho foi apoiado por subsídios Atip do CNRS (a P.-FL e VB), o Labex INFORMAR concessão (para P.-FL e VB) e uma bolsa da Sanofi-Aventis (para VB). Reconhecemos infraestrutura France-BioImaging apoiado pela Agence Nationale de la Recherche (ANR-10-InSb-04-01, chamada &quot;Investissements d&#39;Avenir&quot;).

1. Configuração da Folha de Luz eo Caminho de Detecção A Figura 1 apresenta um esquema geral da configuração óptica. <ol><li> Coloque e fixe o microscópio e os lasers na mesa óptica. </li><li> Combine lasers 488 nm, 561 nm e 405 nm, com os correspondentes espelhos dicróicas. Após os espelhos dicróicos, os lasers têm de ser precisamente co-alinhadas. Note-se que a escolha dos comprimentos de onda de laser, os espelhos dicróicos, filtros ópticos e é determinada a partir dos espectros de absorção dos marcadores fluorescentes específicos utilizados nas experiências. </li><li> Coloque o filtro sintonizável acústico-ótico (AOTF). Use a folha de teste fornecido pelo fornecedor para ajustar a frequência ea potência do AOTF. Quando bem alinhada, cerca de 90% da energia do laser é transmitido a um máximo de ajuste tal como medido por um powermeter. Note que alguns lasers pode ser totalmente controlado por software, o que poderia tornar o AOTF desnecessário. </li><li> Coloque e fixeo telescópio. Note-se que o telescópio é composta por duas lentes que ampliam o feixe com uma largura igual ou maior do que o diâmetro da abertura da parte de trás da lente objectiva iluminação. A lente com distância focal menor deve vir em primeiro lugar. </li><li> Lugar, alinhar e fixar o periscópio trazendo para cima do percurso óptico mais perto da abertura da parte de trás da lente cilíndrica. Note-se que os dois espelhos do periscópio são montados de uma forma que o seu eixo longo está colocando na inclinação do espelho para refletir o feixe totalmente expandida. </li><li> Coloque a lente cilíndrica próxima da saída de periscópio. Note-se que a lente cilíndrica focaliza o feixe em um sentido e deixa colimada na outra direção, formando assim uma folha de luz. </li><li> Recentrar a folha de luz resultante usando a lente objetiva iluminação. Note-se que o ponto focal imagem da objectiva de iluminação deve coincidir com o ponto focal do objecto o objectivo de detecção. Projeto do feixeem uma tela (por exemplo, uma parede) em uma longa distância. Mova o objetivo de iluminação ao longo do eixo do feixe de iluminação para obter na tela contornos nítidos da folha de luz. </li><li> Coloque a linha quad (405/488/561/638) filtro de emissão no lugar reservado no microscópio (cubo). </li><li> Coloque a câmara EMCCD na porta de saída do microscópio. </li><li> Fixar o primeiro estágio de translação manual sobre o palco de microscópio por meio de parafusos em furos na platina do microscópio. Note-se que a borda da plataforma de translação tem de ser posicionado a cerca de 2 cm de distância a partir do centro da platina do microscópio, de modo a que a tina é centrado por baixo da lente objectiva de detecção. </li><li> Fixar o segundo estágio de translação manual sobre o primeiro. As direções das duas etapas tem que ser perpendicular (X e Y traduções). </li><li> Fixar a fase Z piezoeléctrico no topo das duas fases anteriores. Note-se que uma plataforma motorizada pode ser utilizado em vez do estágio piezeléctrico. </li><li> Fixe o holde tinar (ver Figura 2), na parte superior das fases. A cuvete irá, assim, ser colocado na intersecção do caminho de iluminação e o caminho de detecção, que são perpendiculares um ao outro. </li></ol> 2. Verificar a folha de luz <ol><li> Encha uma tina de vidro com solução fluorescente, e colocá-lo no porta-amostras no cruzamento dos dois caminhos ópticos. A folha de luz é assim visível. Tem de ser horizontal, e simétrico / centrada em relação à lente objectiva de detecção. </li><li> Retirar a lente cilíndrica e adquirir uma imagem para medir a espessura da folha de luz. Note-se que a espessura da folha de luz depende da abertura numérica (AN) da iluminação da lente objectiva (cerca de 3-4 mm para NA = 0,3). Note-se que para uma dada lente, a espessura da folha, a luz pode ser aumentada reduzindo o tamanho do feixe de entrar na abertura traseira, com uma fenda. Note-se que as microesferas fluorescentes pode ser utilizado para medir o machadoial e resolução lateral do microscópio. </li><li> Volte a colocar a lente cilíndrica antes de iniciar o experimento. </li></ol> 3. A montagem de C. elegans Embriões Os passos seguintes são apresentados na Figura 3. <ol><li> Use uma caneta de marcação de diamante para cortar um pedaço de uma lâmina de vidro de 10 x 20 x 1 mm. </li><li> Prepare 5% bacto-agar na água, fervê-lo e mantê-lo em um bloco de aquecimento a 60 ° C. </li><li> Adicionar 50 ul de poli-L-lisina sobre um lado da peça de corte da lâmina, deixá-lo secar. </li><li> Coloque uma lâmina de microscópio no banco e corrigi-lo. </li><li> Justapor a peça de corte de lâmina com a lâmina fixa e adicionar uma gota de agar derretido no topo. Esprema o agar usando outra lâmina de microscópio limpa para obter um bloco de ágar fina. </li><li> Permitir que o bloco de ágar para secar antes de retirar o top slide. </li><li> Cortar a almofada de ágar sobre o lado da lâmina fixa, de modo a deixar um excesso de cerca de 3 mm of agar e remova cuidadosamente a lâmina fixa. </li><li> Adicionar 50 mL de poli-L-lisina sobre o agar e deixe secar completamente. </li><li> Coloque vermes grávidas em meio M9 em um vidro de relógio. </li><li> Cortar os vermes ao nível da vulva com um bisturi para libertar os embriões. </li><li> Sob um binóculo identificar os embriões na fase de interesse e recolhê-las usando uma pipeta microcapilar. </li><li> Colocar os embriões na parte do agar revestidos com poli-L-lisina, que se projecta a partir da peça de corte da lâmina. Coloque os embriões apenas junto à fronteira do slide. Não posicione os embriões na fronteira do agar, porque não vai ser estável o suficiente. Remover cuidadosamente o líquido, de modo que os embriões vai ficar sobre a camada de poli-L-lisina. </li><li> Alinhar rapidamente os embriões para evitar a dessecação. </li><li> Colocar a lâmina de corte em um prato de plástico Petri e adicione delicadamente meio M9 para cobrir o slide. </li><li> Verifique sob um binóculo que os ovos ainda estão presos no ágar. </li&gt; </ol> 4. Gravação de C. Desenvolvimento elegans <ol><li> Fixar a preparação anterior (corte deslizante, além de embriões de agar) no suporte de amostra e coloca-se numa cuvete. Figura 4 descreve o titular caseiro e A Figura 5 mostra uma vista da tina em contexto de observação. </li><li> Fixar a cuvete na fase piezoeléctrico. </li><li> Identificar a posição dos embriões com iluminação de campo brilhante. </li><li> Inicie o software feito em casa controlando a AOTF, a câmera eo estágio piezoelétrico. Note-se que um software livre, tal como micromanager, também pode ser utilizado. </li><li> Selecione a linha de laser e de energia (AOTF). </li><li> Ajustar a posição da folha de luz utilizando a fase três instruções de suporte da lente cilíndrica e a lente de iluminação. Mover o palco ao longo da direcção lateral (X) para obter o sinal mais brilhante. Ajustar então a posição Z da folha de luz, e a posição longitudinal (Y) para obter the melhor relação sinal-ruído. Note-se que a posição do foco folha de luz pode ter de ser ajustada a partir de um embrião de um outro para corrigir as diferenças de comprimento de caminho de luz. </li><li> Para adquirir imagens de lapso de tempo, selecione o tempo de exposição, o ganho, o tempo entre duas imagens, bem como o número de imagens a serem adquiridas, eo poder do laser. Para 2 aquisição de cores, selecione uma segunda linha de laser. Duas imagens coloridas são adquiridos de forma consecutiva. </li><li> Para adquirir pilha az, selecione também a distância entre as duas fatias, eo início e fim posições do piezoelétrico. </li></ol>

<ol>
	<li>Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+sectioning+deep+inside+live+embryos+by+selective+plane+illumination+microscopy.">Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy.</a> Science. 305, 1007-1009 (2004).</li><li>Huisken, J., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+plane+illumination+microscopy+techniques+in+developmental+biology.">Selective plane illumination microscopy techniques in developmental biology.</a> Development. 136, 1963-1975 (2009).</li><li>Reynaud, E. G., Krzic, U., Greger, K., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+sheet-based+fluorescence+microscopy:+more+dimensions,+more+photons,+and+less+photodamage.">Light sheet-based fluorescence microscopy: more dimensions, more photons, and less photodamage.</a> HFSP J. 2, 266-275 (2008).</li><li>Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+embryonic+cell+lineage+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Dev Biol. 100, 64-119 (1983).</li><li>Hardin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+embryonic+morphogenesis+in+C.+elegans.">Imaging embryonic morphogenesis in C. elegans.</a> Methods Cell Biol. 106, 377-412 (2011).</li><li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inverted+selective+plane+illumination+microscopy+(iSPIM)+enables+coupled+cell+identity+lineaging+and+neurodevelopmental+imaging+in+Caenorhabditis+elegans.">Inverted selective plane illumination microscopy (iSPIM) enables coupled cell identity lineaging and neurodevelopmental imaging in Caenorhabditis elegans.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 17708-17713 (2011).</li><li>Giurumescu, C. A., Kang, S., Planchon, T. A., Betzig, E., Bloomekatz, J., Yelon, D., Cosman, P., Chisholm, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+semi-automated+analysis+of+morphogenesis+with+single-cell+resolution+in+complex+embryos.">Quantitative semi-automated analysis of morphogenesis with single-cell resolution in complex embryos.</a> Development. 139, 4271-4279 (2012).</li><li>Gao, L., Shao, L., Higgins, C. D., Poulton, J. S., Peifer, M., Davidson, M. W., Wu, X. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+Imaging+beyond+the+Diffraction+Limit+of+3D+Dynamics+in+Thickly+Fluorescent+Specimens.">Noninvasive Imaging beyond the Diffraction Limit of 3D Dynamics in Thickly Fluorescent Specimens.</a> Cell. 151, 1370-1385 (2012).</li><li>Krzic, U., Gunther, S., Saunders, T. E., Streichan, S. J., Hufnagel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiview+light-sheet+microscope+for+rapid+in+toto+imaging.">Multiview light-sheet microscope for rapid in toto imaging.</a> Nat Methods. 9, 730-733 (2012).</li><li>Tomer, R., Khairy, K., Amat, F., Keller, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+high-speed+imaging+of+entire+developing+embryos+with+simultaneous+multiview+light-sheet+microscopy.">Quantitative high-speed imaging of entire developing embryos with simultaneous multiview light-sheet microscopy.</a> Nat Methods. 9, 755-763 (2012).</li><li>Huisken, J., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Even+fluorescence+excitation+by+multidirectional+selective+plane+illumination+microscopy+(mSPIM).">Even fluorescence excitation by multidirectional selective plane illumination microscopy (mSPIM).</a> Opt Lett. 32, 2608-2610 (2007).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Este protocolo descreve uma configuração fácil de microscopia folha de luz para imagem in vivo de C. elegans embriões. Os elementos ópticos necessários para criar e alinhar a folha de luz, incluindo lasers, expansor de feixe, colimação e lentes de foco, pode ser facilmente montado em um banco óptico. Em combinação com um microscópio vertical para o caminho detecção ea câmera, este fornece uma solução simples de configurar uma folha de microscópio de luz. Essa geometria faz com que o ambiente de exemplo simples. O espécime vivo é colocado em uma cuba de vidro, que é realizada, posicionado e movido por um pequeno conjunto de peças mecânicas. Como microscopia iluminação folha é uma técnica de campo grande com capacidade de corte, apenas um único eixo motorizado movimento é necessário para imagens 3D. Isto limita o requisito de sincronização para um único elemento de varrimento e facilita o desenvolvimento do software. Comparado com ISPIM 6 nossa geomet verticalry permite o uso de elevados lente objectiva NA para detecção. Comparada com as configurações SPIM com lentes objectivas em relação ao plano horizontal da montagem da amostra e a imagem de uma série de embriões são mais fáceis. Ao todo, a implementação desta técnica é simples e pode ser alcançado com pouca experiência em ótica. Isto é uma alternativa mais barata a microscopia confocal, com as vantagens de uma maior velocidade e fototoxicidade reduzida, mas inconveniente de uma resolução axial inferior. Também desenvolvemos uma maneira fácil e reprodutível para montar C. embriões elegans para imagem in vivo utilizando este sistema. O procedimento de montagem é rápida (15 minutos) e é adequado para experiências diárias. Para C. elegans imagem, as vantagens desta configuração simples são pelo menos duas dobras: (i) em imagem toto é possível sem rotação e, portanto, a reconstrução 3D é simples; (Ii) a montagem da amostra é fácil e vários embriões podem ser visualizados sequencialmenteno mesmo slide. Nós mostramos exemplos de filmes de lapso de tempo com resolução temporal suficiente para observar as divisões celulares e alterações na forma celular. O poder de microscopia folha de luz para estudar C. desenvolvimento elegans também foi ilustrado recentemente por outros 6, 7, 8. Portanto, esta técnica vai ser muito útil para estudar a morfogénese e padronização da C. elegans embrião. Este sistema pode também ser utilizado para analisar o desenvolvimento de outros organismos modelo? É importante reconhecer que a implementação de microscopia de iluminação folha para pequenas e transparente organismo, como C. elegans é menos rigorosa do que para organismos maiores, como embriões de Drosophila. In toto imagens de Drosophila normalmente requer rotação e multi-view reconstruções 9, 10. Excitação de dois lados com lentes objetivas de excitação colineares também pode reduzir os efeitos de sombra causados ​​pela attenuatíon da luz 11. No entanto, a configuração aqui apresentada é ainda adaptado para a imagem de um lado dos embriões de Drosophila, com baixo branqueamento e baixo photoxicity. Esta configuração também pode ser útil para imagem pequenas e transparentes embriões como ascídias ou peixe-zebra.

A formação ea formação de um organismo envolve movimentos celulares, mudanças no formato da célula, divisão celular e diferenciação celular. Compreender a progressão e coordenação destes processos exigem ferramentas de imagem rápidos com capacidade de três dimensões e resolução subcelular. Entre as técnicas com estes em recursos de imagem in vivo, microscopia de iluminação luz folha também chamada microscopia de iluminação avião single / seletiva tem a vantagem única de produzir efeitos de baixa phototoxic e baixa fotodegradação 1,2. Em microscopia de iluminação da folha, a amostra é iluminada a partir do lado de uma folha de luz, o qual executa o corte óptico. O caminho de iluminação e o caminho de detecção são perpendiculares uns aos outros e a folha leve está alinhado de forma a coincidir com o objecto plano focal da lente objectiva de detecção. A amostra é colocada na intersecção dos dois caminhos, umnd pode ser movido ao longo do eixo para permitir a detecção de imagem 3D. Apenas o plano de interesse é iluminado e todos os pontos deste plano são detectados ao mesmo tempo. Isto aumenta significativamente a velocidade de aquisição e reduz a fotodegradação, bem como fototoxicidade em comparação com microscopia confocal 3. Praticamente, microscopia de iluminação folha é fácil de configurar e align: para dois imagem dimensional, sem varredura é necessário nem para a parte de detecção, nem para a parte de iluminação; como uma técnica de campo largo com capacidade de corte, a imagem tridimensional pode ser obtida através de um único movimento do eixo da fase, com a amostra. Aqui apresentamos a criação de um microscópio simples folha de luz e sua implementação no toto imagens de C. elegans embriões. C. elegans embriões são bem adaptados para viver in vivo imaging devido a sua transparência, linhagem invariante e estereotipada célula posiciona 4,5. A configuração da folha de luz desenvolvido baseia-se num microscópio vertical padrão para a detecção. O protocolo apresentado abaixo detalha como construir e alinhar o módulo de excitação / caminho, testar e caracterizar a folha de luz e montar a amostra para geração de imagens 3D. Ele também fornece exemplos de filmes time-lapse adquiridos com a configuração em várias cepas expressando marcadores fluorescentes.

<table><tbody><tr><td>SPIM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Detection</td></tr><tr><td>upright microscope</td><td>ZEISS</td><td>Axiophot 1</td><td></td></tr><tr><td>100x W objective (NA 1.1, W.D. 2.5mm)&amp;nbsp;</td><td>NIKON</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EMCCD back illuminated</td><td>ANDOR</td><td>DU-885K-CS0-#VP</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Illumination</td></tr><tr><td>LASER 488 nm / 60 mW</td><td>TOPTICA</td><td>iBeam smart</td><td></td></tr><tr><td>LASER 405 nm / 120 mW</td><td>TOPTICA</td><td>iBeam smart</td><td></td></tr><tr><td>LASER 561 nm / 500 mW</td><td>COBOLT</td><td>JIVE 500</td><td>&amp;nbsp;for time lapse imaging, 50 or 100mW is enough</td></tr><tr><td>filter Quad line laser rejectionband ZET 405/488/561/638</td><td>AHF</td><td>F57-405</td><td></td></tr><tr><td>Dichroic 405</td><td>AHF</td><td>F38-405</td><td></td></tr><tr><td>Dichroic 488</td><td>SEMROCK</td><td>Di01-R488</td><td></td></tr><tr><td>AOTF</td><td>AA</td><td>AOTFnC-400.650-TN</td><td></td></tr><tr><td>mirror</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>lens 50 mm</td><td>THORLABS</td><td></td><td>telescope 5X</td></tr><tr><td>lens 200 mm</td><td>THORLABS</td><td></td><td>telescope 5X</td></tr><tr><td>periscope</td><td>THORLABS</td><td>RS99/M</td><td></td></tr><tr><td>cylindrical lens f=100mm</td><td>THORLABS</td><td>ACY254-100-A</td><td></td></tr><tr><td>10X NA 0,3</td><td>NIKON</td><td></td><td></td></tr><tr><td>xyz stage</td><td>NEWPORT</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Sample</td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>Bectkton Dickinson</td><td>214010</td><td>5% in water</td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine solution&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>Capillaries GC100F-10, 1.0mm oD, 0,58mm ID, 100 mm L</td><td>Havard Appartus</td><td>30-0019</td><td></td></tr><tr><td>Aspiration tube (mouth pipette)</td><td>Dutsher</td><td>55005</td><td></td></tr><tr><td>M9 medium:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4 (3g/L)</td><td>Any supplier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4 (6g/L)</td><td>Any supplier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCL (5g/L)</td><td>Any supplier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgSO4 (1 mM final)</td><td>Any supplier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>cuvette holder</td><td>HOME MADE</td><td></td><td>made by Brice Detailleur&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>sample holder</td><td>HOME MADE</td><td></td><td>made by Claude Moretti&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>x stage</td><td>NEWPORT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>coverslip 50x20x1 mm</td><td>MARIENFELD</td><td></td><td>cut then in 10x20x1mm</td></tr><tr><td>piezo electric stage with amplifier/controller</td><td>PI</td><td>P-622.ZCD / E-625.CR</td><td></td></tr><tr><td>cuvette 40mmx40mmx10mm</td><td>HELLMA</td><td>704.002-OG.40 mm- 10mm high</td><td></td></tr><tr><td>Diamond Point Glass Marking Pencil</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Software</td></tr><tr><td>C++ (Qt) home made software</td><td></td><td></td><td>developed by Olivier Blanc and Claire Chard&amp;egrave;s, available on request. Alternative solutions: micromanager or labview&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

setting up a simple light sheet microscope for in toto imaging of c. elegans development

Técnicas rápidas e baixas de imagem phototoxic são pré-requisito para estudar o desenvolvimento de organismos in toto. Microscopia folha de luz com base reduz foto-branqueamento e ação fototóxica em comparação com a microscopia confocal, proporcionando imagens em 3D com resolução subcelular. Aqui apresentamos a configuração de um microscópio folha base de luz, que é composto por um microscópio vertical e um pequeno conjunto de elementos opto-mecânico para a geração da folha de luz. O protocolo descreve como construir, alinhar o microscópio e caracterizar a folha de luz. Além disso, ele detalha como implementar o método no toto imagens de C. elegans embriões utilizando uma câmara de observação simples. O método permite a captura de 3D e duas cores filmes time-lapse mais algumas horas de desenvolvimento. Isso deve facilitar o rastreamento de forma da célula, as divisões celulares e proteínas marcadas por longos períodos de tempo.

Três experimentos de gravação de lapso de tempo 3D a partir de três diferentes C. elegans estirpes ilustrar o tipo de dados que podem ser obtidos usando a configuração do microscópio folha de luz descrita acima. Nós verificamos que, nestas condições, os embriões se desenvolvem em velocidade normal e sobreviver a imagem, de acordo com relatórios anteriores, indicando que a imagem SPIM provoca apenas baixos níveis de fototoxicidade em C. elegans embriões 6,7. A primeira linhagem expressa uma histona fundida a GFP (zuIs178; stIs10024). A gravação foi realizada durante 2 horas, com uma pilha de fatias 20 (distância entre fatias de 1 um) feita a cada 37 seg. Figura 6 ilustra um plano da pilha em diferentes pontos de tempo. Ambos os núcleos interphasic (seta) e cromatina condensada mitótico (cabeça de seta) são claramente visíveis. A segunda estirpe expressa um tubulina fundido a GFP (ruIs57) e uma histonafundido com mCherry (itIs37; stIs10226). A gravação foi realizada durante 16 min, com uma pilha de fatias 20 (distância entre fatias de 1 um) feita a cada 105 s. Figura 7 ilustra diferentes planos da pilha e diferentes pontos de tempo. O filme associado 1 apresenta reconstruções 3D em três momentos sucessivos. Durante a divisão, o fuso mitótico (verde) e cromossomos condensados ​​(vermelho) são claramente visíveis, permitindo o acompanhamento das orientações de divisão celular durante o desenvolvimento. A terceira estirpe expressa a apolipoproteína VIT-2 fundido a GFP (pwIs23) e uma membrana ligada mCherry (ltIs44). O registo foi feito durante 25 minutos, com uma pilha de fatias 10 (distância entre fatias de 1 um) feita a cada 30 seg. Figura 8 ilustra diferentes planos da pilha e diferentes pontos de tempo. Os movimentos rápidos das partículas de gema de lipoproteínas (verde) no interior das células podem ser facilmenteseguido. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1: configuração óptica SPIM composto da iluminação e detecção de unidades, frente e vista para o fundo. Na unidade de iluminação, os lasers combinados pelos espelhos dicróicos entrar AOTF, o qual controla a potência de cada laser independentemente. Em seguida, o telescópio aumenta o tamanho do feixe por 4 vezes e a periscópio traz para a altura do microscópio. A lente cilíndrica forma a folha de luz, que é reorientada pelo objectivo iluminação. A unidade de detecção é integrado no microscópio vertical e é composta principalmente por a lente de detecção, o filtro, o tubo de lente e o EMCCD. A amostra é colocada na intersecção entre os caminhos de iluminação e detecção. A fase piezoeléctrico permite vertical (Z) deslocamentos de amostrapara a aquisição 3D. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig2highres.jpg" width="500" /> Figura 2:. Titular Cuvette O portador consiste em três placas de alumínio e é enroscado sobre a fase piezoeléctrico. A cuba de vidro é realizado por uma mola (em vermelho). <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig3highres.jpg" width="500" /> Figura 3: Montagem protocolo de C. elegans embriões para experiências SPIM. A peça cortada de vidro é revestido com poli-L-lisina. Uma almofada de ágar é posicionada sobre a superfície revestida. Poli-L-lisina Adiciona-se então para a almofada de ágar. Finalmente, C. elegans embriões são alinhados na almofada de ágar revestidos com poli-L-lisina. Figura 4: Exemplo de titular. O detentor encaixa às dimensões interiores da tina de vidro. Duas molas (em vermelho) manter a lâmina de vidro (descrito na Figura 3). Este suporte é então colocado dentro da tina de vidro. <img alt="Figura 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig5highres.jpg" width="500" /> Figura 5:... Suporte da amostra no contexto observação embriões são imobilizadas sobre a lâmina de vidro de acordo com o protocolo resumido na Figura 3 A corrediça é mantida pelo suporte de amostras descrito na Figura 4 O suporte de amostra é inserida na cuvete de vidro, detida pelo titular descrito na Figura 2. A folha de luz é horizontal e illuminates os embriões a partir do lado. A lente da objectiva de detecção esteja na vertical, por cima da amostra. <img alt="Figura 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig6highres.jpg" width="500" /> Figura 6: a gravação de um C. elegans embrião expressar uma fusão histona :: GFP imagens individuais de um embrião transgênico avião expressar uma histona :: fusão GFP (zuIs178; stIs10024) em momentos diferentes imagens extraídas de uma gravação de lapso de tempo 3D:.. pilhas feitas de 20 fatias ( distância entre fatias de 1 mm); tempo de exposição por fatia: 30 ms; intervalo de tempo entre as pilhas: 37 seg; tempo de aquisição total: 2 horas. Arrow: núcleo interphasic, cabeça da seta: cromatina condensada mitótico. No instante t = 0 min, o embrião está na fase de 2 células-e a t = 120 min, o embrião contém cerca de 70 células como esperado sob s normais de desenvolvimentoxixi (notar que apenas as células contidas num mesmo plano são visíveis nas imagens e não todas as células do embrião). O poder de iluminação foi de 30 μW a 488 nm (medido na saída do objectivo de iluminação). <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/51342/51342_LenneBertrand_Figure6.avi" target="_blank">Clique aqui para ver este vídeo.</a> <img alt="Figura 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig7highres.jpg" width="500" /> Figura 7: A gravação de um C. elegans embrião expressando um Tubulin :: fusão GFP e uma histona :: fusão mCherry. Imagens extraídas de uma gravação de lapso de tempo 3D de um C. elegans embrião expressando um Tubulin :: fusão GFP (ruIs57) e um Histone :: fusão mCherry (itIs37; stIs10226). Condições de gravação: a aquisição de uma pilha de 20 fatias (distância entre fatias 1mm) a cada 105 seg; tempo de aquisição total: 16 min; tempo de exposição: 200 ms para cada canal. O painel A mostra 10 fatias da mesma pilha. O painel B mostra a mesma fatia cada 210 seg. O poder de iluminação foi de 30 μW e 300 μW, para 488 e 561 nm, respectivamente lasers (medido na saída do objectivo de iluminação). <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/51342/51342_LenneBertrand_Figure7.avi" target="_blank">Clique aqui para ver este vídeo.</a> <img alt="Figura 8" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig8highres.jpg" width="500" /> Figura 8: a gravação de um C. elegans embrião expressando uma VIT-2 :: GFP Fusion e um alvo a membrana mCherry. Imagens extraídas de uma gravação de lapso de tempo 3D de um C. elegans embrião expressando uma fusão VIT-2 :: GFP (PWIs23) e um mCherry direcionados à membrana (ltIs44). Condições de gravação: aquisição de uma pilha de 10 fatias (distância entre fatias 1 mícron) a cada 30 seg; tempo de aquisição total: 25 min; tempo de exposição por canal: 200 ms. O painel A mostra as 5 primeiras fatias da mesma pilha. O painel B mostra a mesma fatia cada 30seg. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/51342/51342_LenneBertrand_Figure8.avi" target="_blank">Clique aqui para ver este vídeo.</a>

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Setting Up a Simple Light Sheet Microscope for In Toto Imaging of C. elegans Development

Este protocolo descreve a configuração de uma folha de microscópio de luz e sua implementação para imagem in vivo de C. elegans embriões.

Configurando um Microscópio folha de luz simples para<em&gt; Em Toto</em&gt; Imagem de<em&gt; C. elegans</em&gt; Desenvolvimento

Fast and low phototoxic imaging techniques are pre-requisite to study the development of organisms in toto. Light sheet based microscopy reduces ...

setting-up-simple-light-sheet-microscope-for-toto-imaging-c-elegans

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

Setting Up a Simple Light Sheet Microscope for In Toto Imaging of C. elegans Development

23.1K visualizações.  UMR7288 CNRS, Aix-Marseille Université.  Este protocolo descreve a configuração de uma folha de microscópio de luz e sua implementação para imagem in vivo de C. elegans embriões. 

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The C. elegans Intestine As a Model for Intercellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis at the Single-cell Level: Labeling by Antibody Staining, RNAi Loss-of-function Analysis and Imaging

Multicellular tubes, fundamental units of all internal organs, are composed of polarized epithelial or endothelial cells, with apical membranes lining the lumen and basolateral membranes contacting each other and/or the extracellular matrix. How this distinctive membrane asymmetry is established and maintained during organ morphogenesis is still an unresolved question of cell biology. This protocol describes the C. elegans intestine as a&#160;model for the analysis of polarized membrane biogenesis during tube morphogenesis, with emphasis on apical membrane and lumen biogenesis. The C. elegans twenty-cell single-layered intestinal epithelium is arranged into a simple bilaterally symmetrical tube, permitting analysis on a single-cell level. Membrane polarization occurs concomitantly with polarized cell division and migration during early embryogenesis, but de novo polarized membrane biogenesis continues throughout larval growth, when cells no longer proliferate and move. The latter setting allows one to separate subcellular changes that simultaneously mediate these different polarizing processes, difficult to distinguish in most polarity models. Apical-, basolateral membrane-, junctional-, cytoskeletal- and endomembrane components can be labeled and tracked throughout development by GFP fusion proteins, or assessed by in situ antibody staining. Together with the organism&#39;s genetic versatility, the C. elegans intestine thus provides a unique in vivo model for the visual, developmental, and molecular genetic analysis of polarized membrane and tube biogenesis. The specific methods (all standard) described here include how to: label intestinal subcellular components by antibody staining; analyze genes involved in polarized membrane biogenesis by loss-of-function studies adapted to the typically essential tubulogenesis genes; assess polarity defects during different developmental stages; interpret phenotypes by epifluorescence, differential interference contrast (DIC) and confocal microscopy; quantify visual defects. This protocol can be adapted to analyze any of the often highly conserved molecules involved in epithelial polarity, membrane biogenesis, tube and lumen morphogenesis.

The C. elegans Intestine As a Model for Intercellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis at the Single-cell Level: Labeling by Antibody Staining, RNAi Loss-of-function Analy

The transparent C. elegans intestine can serve as an "in vivo tissue chamber" for studying apicobasal membrane and lumen biogenesis at the single-cell and subcellular level during multicellular tubulogenesis. This protocol describes how to combine standard labeling, loss-of-function genetic/RNAi and microscopic approaches to dissect these processes on a molecular level.

O c. elegans intestino como um modelo para intercelular Lumen morfogênese e In Vivo biogênese de membrana polarizada no nível de célula única: rotulagem por anticorpos, RNAi perda--função de análise e de imagem

Multicellular tubes, fundamental units of all internal organs, are composed of polarized epithelial or endothelial cells, with apical membranes lining the ...

Biologia do Desenvolvimento

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, well-characterized nervous system allows identification and fluorescence imaging of any neuron within the intact animal. Simple immobilization techniques with minimal impact on the animal's physiology allow extended time-lapse imaging. The development of genetically-encoded calcium sensitive fluorophores such as cameleon 1 and GCaMP 2 allow in vivo imaging of neuronal calcium relating both cell physiology and neuronal activity. Numerous transgenic strains expressing these fluorophores in specific neurons are readily available or can be constructed using well-established techniques. Here, we describe detailed procedures for measuring calcium dynamics within a single neuron in vivo using both GCaMP and cameleon. We discuss advantages and disadvantages of both as well as various methods of sample preparation (animal immobilization) and image analysis. Finally, we present results from two experiments: 1) Using GCaMP to measure the sensory response of a specific neuron to an external electrical field and 2) Using cameleon to measure the physiological calcium response of a neuron to traumatic laser damage. Calcium imaging techniques such as these are used extensively in C. elegans and have been extended to measurements in freely moving animals, multiple neurons simultaneously and comparison across genetic backgrounds. C. elegans presents a robust and flexible system for in vivo neuronal imaging with advantages over other model systems in technical simplicity and cost.

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

With its small transparent body, well-documented neuroanatomy and a host of amenable genetic techniques and reagents, C. elegans makes an ideal model organism for in vivo neuronal imaging using relatively simple, low-cost techniques. Here we describe single neuron imaging within intact adult animals using genetically encoded fluorescent calcium indicators.

Na imagem cálcio vivo Neuronal em C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Neurociência

Isotropic Light-Sheet Microscopy and Automated Cell Lineage Analyses to Catalogue Caenorhabditis elegans Embryogenesis with Subcellular Resolution

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous system can be observed, with single cell resolution, in vivo. Here, we present an integrated protocol for the examination of neurodevelopment in C. elegans embryos. Our protocol combines imaging, lineaging and neuroanatomical tracing of single cells in developing embryos. We achieve long-term, four-dimensional (4D) imaging of living C. elegans&#160;embryos with nearly isotropic spatial resolution through the use of Dual-view Inverted Selective Plane Illumination Microscopy (diSPIM). Nuclei and neuronal structures in the nematode embryos are imaged and isotropically fused to yield images with resolution of ~330 nm in all three dimensions. These minute-by-minute high-resolution 4D data sets are then analyzed to correlate definitive cell-lineage identities with gene expression and morphological dynamics at single-cell and subcellular levels of detail. Our protocol is structured to enable modular implementation of each of the described steps and enhance studies on embryogenesis, gene expression, or neurodevelopment.

Here, we present a combinatorial approach using high-resolution microscopy, computational tools, and single-cell labeling in living C. elegans embryos to understand single cell dynamics during neurodevelopment.

Microscopia de folha de luz isotrópica e análise de linhagem de células automatizadas para catalogar Caenorhabditis elegans Embryogenesis com resolução subcelular

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous ...

A Semi-high-throughput Imaging Method and Data Visualization Toolkit to Analyze C. elegans Embryonic Development

C. elegans is the premier system for the systematic analysis of cell fate specification and morphogenetic events during embryonic development. One challenge is that embryogenesis dynamically unfolds over a period of about 13 h; this half day-long timescale has constrained the scope of experiments by limiting the number of embryos that can be imaged. Here, we describe a semi-high-throughput protocol that allows for the simultaneous 3D time-lapse imaging of development in 80&#8211;100 embryos at moderate time resolution, from up to 14 different conditions, in a single overnight run. The protocol is straightforward and can be implemented by any laboratory with access to a microscope with point visiting capacity. The utility of this protocol is demonstrated by using it to image two custom-built strains expressing fluorescent markers optimized to visualize key aspects of germ-layer specification and morphogenesis. To analyze the data, a custom program that crops individual embryos out of a broader field of view in all channels, z-steps, and timepoints and saves the sequences for each embryo into a separate tiff stack was built. The program, which includes a user-friendly graphical user interface (GUI), streamlines data processing by isolating, pre-processing, and uniformly orienting individual embryos in preparation for visualization or automated analysis. Also supplied is an ImageJ macro that compiles individual embryo data into a multi-panel file that displays maximum intensity fluorescence projection and brightfield images for each embryo at each time point. The protocols and tools described herein were validated by using them to characterize embryonic development following knock-down of 40 previously described developmental genes; this analysis visualized previously annotated developmental phenotypes and revealed new ones. In summary, this work details a semi-high-throughput imaging method coupled with a cropping program and ImageJ visualization tool that, when combined with strains expressing informative fluorescent markers, greatly accelerates experiments to analyze embryonic development.

A Semi-high-throughput Imaging Method and Data Visualization Toolkit to Analyze C. elegans Embryonic Development

This work describes a semi-high-throughput protocol that allows simultaneous 3D time-lapse imaging of embryogenesis in 80&#8211;100 C. elegans embryos in a single overnight run. Additionally, image processing and visualization tools are included to streamline data analysis. The combination of these methods with custom reporter strains enables detailed monitoring of embryogenesis.

Um método de imagem semi-alta-fonte e um kit de ferramentas de visualização de dados para analisar o desenvolvimento embrionário de C. elegans

C. elegans is the premier system for the systematic analysis of cell fate specification and morphogenetic events during embryonic development. One ...

Imagem baseada em smartphone para ensaio de prevenção de gramado de C. elegans

A Smartphone-Based Imaging Method for C. elegans Lawn Avoidance Assay

When exposed to toxic or pathogenic bacteria, the nematode Caenorhabditis elegans displays a learned lawn avoidance behavior, in which the worms gradually leave their food source and prefer to remain outside the bacterial lawn. The assay is an easy way to test the worms' ability to sense external or internal cues to properly respond to harmful conditions. Though a simple assay, counting is time consuming, particularly with multiple samples, and assay durations that span overnight are inconvenient for researchers. An imaging system that can image many plates over a long period is useful but costly. Here, we describe a smartphone-based imaging method to record lawn avoidance in C. elegans. The method requires only a smartphone and a light emitting diode (LED) light box, to serve as a transmitted light source. Using free time-lapse camera applications, each phone can image up to six plates, with sufficient sharpness and contrast to manually count worms outside the lawn. The resulting movies are processed into 10 s audio video interleave (AVI) files for every hourly time point, then cropped to show each single plate to make them more amenable for counting. This method is a cost-effective way for those looking to examine avoidance defects and can potentially be extended to other C. elegans assays.

Autor em destaque: um método de imagem baseado em smartphone para ensaio de prevenção de gramado de C. elegans  

This article describes a simple, low-cost method of recording the lawn avoidance behavior of Caenorhabditis elegans, using readily available items such as a smartphone and a light emitting diode (LED) light box. We also provide a Python script to process the video file into a format more amenable for counting.

Um método de imagem baseado em smartphone para C. elegans Lawn Avoidance Assay

When exposed to toxic or pathogenic bacteria, the nematode Caenorhabditis elegans displays a learned lawn avoidance behavior, in which the worms gradually ...

Comportamento

4D Microscopy: Unraveling Caenorhabditis elegans Embryonic Development Using Nomarski Microscopy

4D microscopy is an invaluable tool for unraveling the embryonic developmental process in different animals. Over the last decades, Caenorhabditis elegans has emerged as one of the best models for studying development. From an optical point of view, its size and transparent body make this nematode an ideal specimen for DIC (Differential Interference Contrast or Nomarski) microscopy. This article illustrates a protocol for growing C. elegans nematodes, preparing and mounting their embryos, performing 4D microscopy and cell lineage tracing. The method is based on multifocal time-lapse records of Nomarski images and analysis with specific software. This technique reveals embryonic developmental dynamics at the cellular level. Any embryonic defect in mutants, such as problems in spindle orientation, cell migration, apoptosis or cell fate specification, can be efficiently detected and scored. Virtually every single cell of the embryo can be followed up to the moment the embryo begins to move. Tracing the complete cell lineage of a C. elegans embryo by 4D DIC microscopy is laborious, but the use of specific software greatly facilitates this task. In addition, this technique is easy to implement in the lab. 4D microscopy is a versatile tool and opens the possibility of performing an unparalleled analysis of embryonic development.

4D Microscopy: Unraveling Caenorhabditis elegans Embryonic Development Using Nomarski Microscopy

Here, we present a protocol for preparing and mounting Caenorhabditis elegans embryos, recording development under a 4D microscope and tracing cell lineage.

Microscopia 4D: Desvendando caenorhabditis elegans Desenvolvimento Embrionário usando Microscopia Nomarski

4D microscopy is an invaluable tool for unraveling the embryonic developmental process in different animals. Over the last decades, Caenorhabditis elegans ...

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using fluorescent-labeled reporter proteins or differential interference contrast (DIC) microscopy, allows for the examination of the temporal progression of these dynamic events which is otherwise inferred from analysis of fixed samples1,2. Moreover, the study of the developmental regulations of cellular processes necessitates conducting time-lapse experiments on an intact organism during development. The Caenorhabiditis elegans embryo is light-transparent and has a rapid, invariant developmental program with a known cell lineage3, thus providing an ideal experiment model for studying questions in cell biology4,5and development6-9. C. elegans is amendable to genetic manipulation by forward genetics (based on random mutagenesis10,11) and reverse genetics to target specific genes (based on RNAi-mediated interference and targeted mutagenesis12-15). In addition, transgenic animals can be readily created to express fluorescently tagged proteins or reporters16,17. These traits combine to make it easy to identify the genetic pathways regulating fundamental cellular and developmental processes in vivo18-21. In this protocol we present methods for live imaging of C. elegans embryos using DIC optics or GFP fluorescence on a compound epifluorescent microscope. We demonstrate the ease with which readily available microscopes, typically used for fixed sample imaging, can also be applied for time-lapse analysis using open-source software to automate the imaging process.

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

The C. elegans embryo is a powerful system for studying cell biology and development. We present a protocol for live imaging of C. elegans embryos utilizing DIC optics or fluorescence using readily available epifluorescent microscopes and open-source software.

Imagem C. elegans Os embriões utilizando um microscópio de epifluorescência e Software de Código Aberto

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using ...

Biologia

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes. The transparency of the 
embryos, the genetic resources, and the relative ease of transformation are qualities that make C. elegans an excellent model for early embryogenesis. Laser-based 
confocal microscopy and fluorescently labeled tags allow researchers to follow specific cellular structures and proteins in the developing embryo. For example, 
one can follow specific organelles, such as lysosomes or mitochondria, using fluorescently labeled dyes. These dyes can be delivered to the early embryo by means 
of microinjection into the adult gonad. Also, the localization of specific proteins can be followed using fluorescent protein tags. Examples are presented here 
demonstrating the use of a fluorescent lysosomal dye as well as fluorescently tagged histone and ubiquitin proteins. The labeled histone is used to visualize 
the DNA and thus identify the stage of the cell cycle. GFP-tagged ubiquitin reveals the dynamics of ubiquitinated vesicles in the early embryo. Observations 
of labeled lysosomes and GFP:: ubiquitin can be used to determine if there is colocalization between ubiquitinated vesicles and lysosomes. A technique for 
the microinjection of the lysosomal dye is presented. Techniques for generating transgenenic strains are presented elsewhere (1, 2). For imaging, embryos 
are cut out of adult hermaphrodite nematodes and mounted onto 2% agarose pads followed by time-lapse microscopy on a standard laser scanning confocal 
microscope or a spinning disk confocal microscope. This methodology provides for the high resolution visualization of early embryogenesis.

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

This article describes a technique for the visualization of the early events of embryogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans.

Lapso de tempo Microscopia de embriogênese inicial em Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Configurando um Microscópio folha de luz simples para

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O c. elegans intestino como um modelo para intercelular Lumen morfogênese e In Vivo biogênese de membrana polarizada no nível de célula única: rotulagem por anticorpos, RNAi perda--função de análise e de imagem

Na imagem cálcio vivo Neuronal em C. elegans

Microscopia de folha de luz isotrópica e análise de linhagem de células automatizadas para catalogar Caenorhabditis elegans Embryogenesis com resolução subcelular

Um método de imagem semi-alta-fonte e um kit de ferramentas de visualização de dados para analisar o desenvolvimento embrionário de C. elegans

Um método de imagem baseado em smartphone para C. elegans Lawn Avoidance Assay

Um método de imagem baseado em smartphone para C. elegans Lawn Avoidance Assay

Um método de imagem baseado em smartphone para C. elegans Lawn Avoidance Assay

Microscopia 4D: Desvendando caenorhabditis elegans Desenvolvimento Embrionário usando Microscopia Nomarski

Imagem C. elegans Os embriões utilizando um microscópio de epifluorescência e Software de Código Aberto

Lapso de tempo Microscopia de embriogênese inicial em Caenorhabditis elegans