Os autores agradecem calorosamente Dr. KK Fenrich, Dr. MC. Amoureux, P. e A. Weber Jaouen para discussões úteis; M. Hocine, C. Meunier, M. Metwaly, S. Bensemmane, J. Bonnardel, o pessoal do biotério em IBDML eo pessoal da plataforma de imagem PicSIL em IBDML para suporte técnico. Este trabalho foi financiado por doações do Instituto Nacional do Câncer du (INCA-DGOS-INSERM6038) a GR, Agence Nationale de la Recherche (ANR JCJC PathoVisu3Dyn), pour la Recherche Fédération sur le Cerveau (FRC) para FD, por bolsas de estudo da Federação Recherche Médicale de la e Cancéropôle PACA ao CR.

Todos os procedimentos experimentais foram realizados de acordo com a legislação francesa e em conformidade com a directiva do Conselho da Comunidade Europeia de 24 de novembro de 1986 (86/609/CEE) para o cuidado e uso de animais de laboratório. A pesquisa em animais foi autorizada pela Direção Départementale des Serviços vétérinaires des Bouches-du-Rhône (licença D-13-055-21) e aprovado pelo comitê de ética da Provence Côte d&#39;Azur n ° 14 (Projeto 87-04122012) . 1. Esferóides Preparação <ol><li> Preparação das placas de Petri revestidas com agarose <ol><li> Mistura-se 1 g de agarose com 100 ml de meio de cultura de células não suplementadas com soro fetal bovino. Usar um forno de microondas (850 Watts durante 40 seg, depois 3 x 15 seg; agita-se a solução entre cada sessão de microondas) para ferver a solução e para dissolver completamente a agarose. Autoclave esta solução de agarose a 1% durante 20 minutos a 120 ° C para garantir Steri. dade Nota: Tome cuidado para dissolver completamente o agarose antes do protocolo autoclave. Falta de homogeneidade pode comprometer a formação de esferóides. </li><li> Uma vez recuperada a partir do autoclave, verter 10 ml da solução de agarose a 1% em 100 x 20 mm pratos Petri. Deixar a placas de Petri de 20 min à temperatura ambiente para permitir que a solução de agarose a 1% para solidificar. </li><li> Adicionar 10 ml de PBS acima da agarose para manter a humidade. Selar a tampa das placas de Petri revestidas com agarose enrolando-os com parafilme para evitar a evaporação. As placas de Petri podem ser armazenados durante 2 meses a 4 ° C, se adequadamente humidificado pela camada de PBS. </li></ol></li><li> Cultura esferóide <ol><li> Em de 75 cm 2 frascos, a cultura das células de glioma em seu meio recomendado como uma monocamada. </li><li> Substituir o PBS a partir de um dos 1% de agarose revestidas com uma placa de Petri com 1,5 ml de &quot;meio de pré-condicionado&quot; recolhidos a partir do recipiente que contém a monocamada de células de glioma de 2Ds. </li><li> Remover o meio do frasco contendo a monocamada de 2D de células de glioma. </li><li> Lave a monocamada com 10 ml de PBS. </li><li> Adicionar 2 ml de 0,05% de uma solução de tripsina / EDTA e incubar o balão de 4 min a 37 ° C. Nota: O tempo de incubação pode variar de acordo com a linha celular utilizada. </li><li> Adicione 8 ml de meio de cultura para impedir a ação da tripsina, lave delicadamente a suspensão de células Nota:. Tome cuidado para não lavar ar na suspensão de células à medida que aumenta a morte celular. </li><li> Coloque 6 ml da suspensão de células num frasco estéril. </li><li> Centrifuga-se o frasco de 4 minutos a 800 rpm. </li><li> Remover o sobrenadante e suspender suavemente o sedimento de células em 3 ml de meio de cultura. </li><li> Semente da suspensão de células no preparado revestida de agarose placa de Petri. </li><li> Colocar a placa de Petri, a 37 ° C numa atmosfera de CO2 a 5% durante 2 a 3 dias, até os esferóides de diâmetro desejado são formados. </li></ol></li></ol&gt; 2. Esferóide e Janela Implantação <ol><li> Preparação do sistema de injecção <ol><li> Capilares de vidro limpo (1 mm de diâmetro) por sonicação em etanol a 70% durante 10 min. Lavar duas vezes com água antes colocação dentro de uma incubadora até secar. </li><li> Puxe vários capilares de vidro limpo com um puxador de pipeta, a fim de preparar um pequeno estoque. </li><li> Quebrar a ponta do capilar puxado por raspagem sobre a extremidade de um pedaço de papel de seda para se obter um extremidade chanfrada do tamanho desejado: normalmente um diâmetro externo de 300-350 ^ m e um diâmetro interno de 250-300 mM. Durante este processo de conformação, controlar o diâmetro do capilar utilizando um macroscópio cuja ocular está equipado com uma mira graduada. </li><li> Ligue a extremidade não chanfrada do capilar para um colector de 3 vias utilizando um pedaço de tubo de plástico, cujo diâmetro interior se ajusta o diâmetro externo do tubo capilar. </li><li> Usando tubin plásticog, ligar as duas outras formas de colector para uma 25 ul microlitro seringa e uma seringa de 1 ml carregado com óleo mineral histo-compatibilidade. </li><li> Ajuste o seletor múltiplo para estabelecer um caminho entre a seringa microlitro ea seringa de 1ml. Remover o pistão da seringa microlitro e injetar óleo mineral para trás para dentro da seringa microlitro até que vaza, empurrando o êmbolo da seringa de 1ml. Substitua o pistão da seringa microlitro, enquanto tomando cuidado para não deixar bolhas de ar no tubo. </li><li> Ajuste o seletor múltiplo para estabelecer um caminho entre o capilar ea seringa de 1 ml. Encha o capilar com óleo mineral até que vaza da ponta, tendo o cuidado para não deixar bolhas de ar no tubo. </li><li> Ajustar o selector de colector para estabelecer uma ligação entre a seringa de microlitro e o capilar. Expelir a cerca de 10 ul de óleo mineral. </li><li> Mergulhe a ponta capilar em solução PBSe usando o calibre da seringa microlitro, aspirar 5 ul de PBS no capilar. Note-se que o menisco entre o óleo e PBS é claramente visível. </li><li> Fixar o capilar num micromanipulador 3 eixo encaixe sob o macroscópio cirurgia. Este sistema irá ser utilizado para orientar o capilar para o local da injecção sob controle visual. </li></ol></li><li> Implantação esferóide <ol><li> Levemente sedar o mouse por inalação de isoflurano em uma câmara de indução (1,5% em ar durante 1 a 1,5 min). </li><li> Anestesiar os animais com uma injecção intra-peritoneal de uma mistura de cetamina / xilazina (120 mg / kg, 12 mg / kg). Note-se que a anestesia frequentemente reduz a temperatura do corpo do animal. Recomenda-se a prosseguir com a cirurgia em uma sala a 26 ° C e manter o animal aquecido com uma almofada de aquecimento thermocontrolled subjacente. </li><li> Aplicar pomada para evitar a dessecação dos olhos. </li><li> Raspar o couro cabeludo do animal. </li><li> Lugaro animal em uma estrutura estereotáxica usando barras de ouvido e um bocal. </li><li> Limpar a pele com iodo povidona (3% de sabão, em seguida, solução a 10%). </li><li> Adicione a 1 cm de comprimento incisão longitudinal no meio do couro cabeludo com um bisturi. Com uma tesoura cortar e remover a pele acima dos ossos parietais. </li><li> Com uma lâmina de bisturi remover suavemente o periósteo acima do crânio. Generosamente aplicar cianoacrilato no topo do osso para gerar uma superfície áspera para mais tarde a aderência de cimento. </li><li> Perfurar o osso parietal sob uma macroscópio cirúrgico para gerar uma craniotomia, de 4 mm de diâmetro. Generosamente adicionar PBS gelado contendo penicilina (1000 U / ml) e estreptomicina (1 mg / ml) durante todo o processo para evitar um aquecimento. Retire os pequenos fragmentos de osso com uma pinça e uma gaze estéril molhado. Tome cuidado para perfurar pelo menos um milímetro de distância de suturas do crânio parietais para evitar hemorragias. </li><li> Fina osso na fronteira da craniotomia em que a janela de vidro será selado. Objetivo é eNsure posicionamento posterior plana da janela de vidro com superfície de contacto máxima entre o cérebro e o vidro. Lentamente, retire o osso usando uma pinça e limpar a dura-máter exposta com a solução de PBS. </li><li> Tome a 5 mm de diâmetro rodada lamela de vidro, limpe-o com álcool e seque-a com papel de seda. Tentar usar a lamela como uma tampa para a craniotomia e confirmar que uma grande superfície plana do cérebro fica em contacto com o vidro. Se for necessário retirar a lamela mais a densidade dos ossos laterais. Prossiga até que o cérebro pode ficar espremido plana se aplicar suavemente a pressão sobre a lamela uma vez no lugar. </li><li> Limpe novamente a lamela com o álcool, seque-a com papel de seda, e guardá-lo à parte. </li><li> Com uma agulha de calibre 26 fazer um buraco na dura-máter no centro da craniotomia ainda evitar vasos sanguíneos principais. Certifique-se de não danificar o parênquima cerebral como o objetivo desta etapa é apenas para abrir a dura-máter. </li><li> Limpe suavemente o wi dura-máterª solução PBS para remover sangue hemorrágico. Cubra com um pedaço de papel de seda enquanto prepara a injeção esferóide. </li><li> Com o sistema de injecção de esferóide, preparado no passo 2.1, chupar um esferóide rodada montagem do diâmetro interno capilar (aproximadamente 200-250 mm) a partir da placa de Petri, preparado no passo 1.2. Esferóide deve vir junto com cerca de 5 mL de meio de cultura. Ele deve cair para a ponta da capilaridade sob o seu peso. </li><li> Remover o papel de seda molhado utilizadas para cobrir a craniotomia e posicionar o animal sob o sistema de injecção. </li><li> Abaixe a pipeta de injeção até tocar no buraco feito na dura-máter. Em seguida, coloque-o novamente por 250 um. Espere 30 segundos. </li><li> Lentamente injectar o esferóide utilizando o êmbolo da seringa de microlitros (2-3 ul), enquanto bombeia para fora o excesso de líquido com um pequeno pedaço de papel de seda. Espere 30 segundos e, em seguida, levante cuidadosamente a pipeta de injeção de 50 mm em direção à superfície. Espere 30 segundos e novamente REPEAt o processo de elevação por passos de 50 mM até a superfície. Tempo de espera evita a extração do esferóide que iria ficar para a pipeta. </li><li> Confirmar a presença do esferóide no cérebro utilizando uma macroscópio fluorescência. </li><li> Misturar 100-300 diâmetro mM reticulados contas de gel dextrano com solução de PBS numa placa de Petri. Espere 1 minuto e pescar algumas contas hidratados. Colocá-los no osso adjacente ao craniotomia. </li><li> Sob o controlo macroscópica, escolher um cordão com um diâmetro semelhante ao tamanho da abertura da dura-máter. Cortar o talão de gel de dextrano reticulado em duas metades, utilizando fórceps. </li><li> Com cuidado, coloque um dextrano gel hemi-talão reticulado no orifício de injeção com a face convexa em direção ao esferóide. Tome cuidado para não remover o esferóide e pressione suavemente para baixo até a fronteira do côncavo entrar em contato com a dura-máter circundante. </li><li> Coloque uma gota de cola de cianoacrilato sobre uma lâmina de vidro; molhe a ponta de um palito no drop para levar uma pequena quantidade de cola. Rapidamente selar as bordas do gel de dextrano hemi-grânulo reticulado para a dura-máter adjacente por estampagem em torno de cola. Ter o cuidado de executar movimentos rápidos e precisos, a fim de evitar a colagem do dextrano reticulado em gel de hemi-grânulo para o palito. Evite o excesso de cola que pode se espalhar e impedir se não impedir imagem depois de secas. Espere 2 minutos para a cola secar e, em seguida, limpar a craniotomia e osso circundante com solução PBS. </li></ol></li><li> Implantação Janela <ol><li> Coloque a 5 mm de diâmetro rodada lamela acima da craniotomia (ver 2.2.12). As arestas da lamela deve ser diluído no crânio no exterior da craniotomia. A lamela deve estar em contato com a dura-máter eo osso diluído nas bordas. É muito importante ter um contato direto entre a dura-máter ea lamela de vidro de outra forma o tecido da cicatriz pode desenvolver e impedir a claridade óptica. </li><li> Com um lenço de papel, absorver o PBS no tharestas e de lamelas, de modo que solução não cobre totalmente a craniotomia, quando da aplicação de uma pequena pressão no centro da lamela. Isto irá garantir que o osso, de vidro e cérebro são coladas no lado da região de interesse. </li><li> Manter uma pequena pressão no centro da lamela com um fórceps enquanto aplicando suavemente cianoacrilato na fronteira entre o osso e a lamela. A cola vai espalhar-se espontaneamente até a interface com a solução de PBS. Solução vai agir como uma barreira dada a hidrofobicidade da cola. Vedação deve ser eficaz em menos de um minuto, mas tomar um extremo cuidado para não mover a lamela até que seja corrigido. Isso de outro modo resultar em fuga de cianoacrilato sobre a dura-máter, portanto, conduzir a uma falha da cirurgia. </li><li> Em caso de cola teriam se espalhado em cima do vidro, removê-lo usando uma lâmina de micro-bisturi, fazendo movimentos em espiral, uma vez que, de outra forma reduzir a claridade óptica. Cuidado para não quebrar a lamela de vidro during o processo, devido a pressão excessiva. </li><li> Consolidar a fixação de vidro, aplicando cimento dental nas bordas da lamínula em direção ao crânio adjacente. Certifique-se de cobrir todo o crânio exposto até o couro cabeludo. Usando cimento extra, construir paredes laterais ao redor da lamela para criar o pool necessário para a imersão do objetivo. O cimento dental vai curar em menos de 10 min. </li></ol></li></ol> 3. Cuidados pós-operatórios e Preparação for Imaging <ol><li> Cuidados pós-operatórios <ol><li> Retire o mouse do quadro estereotáxico, injetar Dexamethazon (0,2 mg / kg) e Rimadyl (5 mg / kg) sc sobre as regiões pélvica e deitá-la em uma jaula com um caloroso tecido-ninho. </li><li> Monitorar o animal até os efeitos da anestesia ter desaparecido. Em geral 2 a 3 horas após a cirurgia, os ratos são totalmente móvel. Certifique-se que o animal tem um fácil acesso a comida e água. Fornecer o animal com agarose contendo glicose (agarose3%, glicose a 3%). </li><li> Monitorizar o peso dos animais diariamente e injectar Dexamethazon (0,2 mg / kg) e Rimadyl (5 mg / kg) sc para o primeiro 10d após a cirurgia. Por considerações éticas, eutanásia os ratos quando a perda for superior a 15% do seu peso original. A pressão intracraniana aumenta com o tamanho do tumor levando a deficiências motoras para o animal. Esta é a linha de células tumorais dependente e ocorre em vários atrasos pós-cirurgia. Cuidados especiais devem ser tomados para caracterizar o ponto final do experimento com a linhagem celular utilizada. </li></ol></li><li> Preparação para a imagem latente <ol><li> Levemente sedar o ratinho por inalação de isoflurano numa câmara de indução (1,5% em ar durante 1 a 1,5 minutos). </li><li> Anestesiar os animais com uma injecção intra-peritoneal de uma mistura de cetamina / xilazina (100 mg / kg, 10 mg / kg). Tal permite que a anestesia tipicamente 45 minutos de observação. Para realizar as sessões de imagem mais longos, o mouse é colocado sob a inalação contínua de isoflurano emar (0,25-0,75%). </li><li> Aplicar pomada para evitar a dessecação dos olhos. </li><li> Coloque o animal em um quadro estereotáxico e bloquear o crânio com os earbars. </li><li> Para visualizar os vasos sanguíneos, um corante fluorescente pode ser injectado por via intravenosa. </li><li> Se a janela estiver suja, pode ser limpa, removendo delicadamente os escombros com uma lâmina fina e no canto de um tecido. Não use álcool para limpar a janela, uma vez que nem sempre é compatível com cimento dental e pode resfriar o cérebro abaixo da janela. </li></ol></li></ol>

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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Esta abordagem permite a utilização de métodos de imagiologia óptica para monitorizar ao longo de dias e semanas, o crescimento de glioma ortotopicamente implantado. O mesmo animal pode ser subsequentemente submetido a virtualmente qualquer modalidade de imagem do cérebro durante o decorrer da patologia; no entanto, a preparação específica microscopia de dois fótons oferece a oportunidade única de alcançar resolução subcelular dentro do cérebro do animal vivo. Nosso protocolo apresenta a vantagem de fazer ...

Glioblastoma multiforme aparece como a forma mais agressiva de tumor cerebral em adultos com uma sobrevida média de 12 meses e uma taxa de sobrevida em 5 anos de 5%. O tratamento clínico depende de cirurgia, radioterapia e quimioterapia, muitas vezes utilizados em combinação. No entanto, os efeitos destes tratamentos paliativos permanecem 1-3. Até agora, a maioria dos estudos de neuro-oncologia contar com técnicas que só são capazes de fornecer uma visão estática e realizados em grandes grupos de animais portadores de tumor sacrificados em diferentes pontos temporais (ver, por exemplo, 4,5). O recente desenvolvimento de métodos de acompanhamento com base em imagens intravital permite estudar o crescimento de glioma e as interações entre as células tumorais e seu microambiente fisiopatológico no mesmo animal ao longo do tempo. Isso abre o caminho para a peça exclusiva de informação que foi até agora inatingível 6. Animais transgênicos expressando marcas fluorescentes em células de interesse pode ser usadod para estudar as interações específicas entre as células tumorais e ex neurônios neste papel. Ao longo da última década, a microscopia de dois fótons intravital 7 tornou-se um padrão-ouro em estudos neuro-oncologia fundamentais e ensaios pré-clínicos 8,9 por sua capacidade de realizar observação intravital profundo de cérebro do rato (&gt; 500 mm abaixo da dura-máter) com uma resolução espacial micrométrica 10. Utilizando microscopia de dois fotões intravital com modelos animais orthotopical implantados com uma janela craniana crónica 11, é possível seguir a progressão do tumor ao longo do tempo no mesmo 9,12 rato. Uma das principais desvantagens destes modelos animais anteriormente publicadas, no entanto, que eles não imitam as limitações físicas que governam o crescimento do tumor como a dura-máter não é selado após a injecção da suspensão celular 9,13,14. Células de glioma podem vazar noespaço extradural transformar um modelo de glioma ortotópico em um heterotópico. O modelo animal aqui apresentados consiste na injecção de um esferóide de células de glioma fluorescentes no córtex cerebral, a uma profundidade de 200 um, seguido pelo fecho da dura-máter com um gel de dextrano hemi-grânulo reticulado e cola de histo-compatibilidade . O crescimento do tumor é então restrito ao parênquima cerebral que mantém as restrições físicas fisiopatológicos. Uma janela de vidro crônica implantado acima do tumor permite um acesso óptico fácil para microscopia de dois fótons intravital. Usando animais transgênicos expressando marcas fluorescentes em células de interesse, é possível realizar um acompanhamento do crescimento glioma ao longo do tempo e estudar sua interação com seu microambiente (aqui com os neurônios e vasos destacados com dextrans fluorescentes).

<table><tbody><tr><td>Drill</td><td>Dremel (Germany)</td><td>398</td><td>any high quality surgical bone drill would suffice</td></tr><tr><td>Drill burr (#1/4 Carbide Round Burr)</td><td>World Precision Instruments (USA)</td><td>501860 (#1/4)</td><td>also sold by Harvard Apparatus</td></tr><tr><td>Tissue scissors</td><td>World Precision Instruments (USA)</td><td>14395</td><td></td></tr><tr><td>Dumont tweezers M5S</td><td>World Precision Instruments (USA)</td><td>501764</td><td></td></tr><tr><td>Dental cement</td><td>GACD (USA)</td><td>12-565 &amp;amp; 12-568</td><td></td></tr><tr><td>Cyanoacrylate</td><td>Eleco-EFD (France)</td><td>Cyanolit 201</td><td></td></tr><tr><td>Glass capillaries without filament</td><td>Clark Electromedical Instruments (UK)</td><td>GC100-15</td><td></td></tr><tr><td>Microliter syringe (25 &amp;micro;l)</td><td>Hamilton (USA)</td><td>702</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>World Precision Instruments (USA)</td><td>Kite-R</td><td></td></tr><tr><td>T derivation (3-way stopcock - Luer lock)</td><td>World Precision Instruments (USA)</td><td>14035-10</td><td></td></tr><tr><td>Stereotactic frame (mouse adaptor)</td><td>World Precision Instruments (USA)</td><td>502063</td><td></td></tr><tr><td>Glass coverslips</td><td>Warner Instruments (USA)</td><td>CS-5R (64-0700)</td><td></td></tr><tr><td>Cross-linked dextran gel (Sephadex) G50 Coarse 100-300 &amp;micro;m beads</td><td>Available from various suppliers including Sigma (Germany)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eye ointment</td><td>TVM (France)</td><td>Ocry-gel</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence macroscope</td><td>Leica MZFLIII (Germany)</td><td></td><td>also sold by other companies</td></tr><tr><td>Two-photon microscope</td><td>Zeiss LSM 7MP (Germany)</td><td></td><td>also sold by other companies (Nikon, &amp;hellip;)</td></tr><tr><td>Infrared tunable femtosecond laser (Ma&amp;iuml;-Ta&amp;iuml;)</td><td>Spectra Physics (USA)</td><td></td><td>also sold by other companies</td></tr></tbody></table>

an orthotopic glioblastoma mouse model maintaining brain parenchymal physical constraints and suitable for intravital two-photon microscopy

Glioblastoma multiforme (GBM) é a forma mais agressiva de tumores cerebrais sem tratamentos curativos disponíveis até o momento. Modelos murinos desta patologia contar com a injecção de uma suspensão de células de glioma no parênquima cerebral após a incisão da dura-máter. Considerando que as células têm de ser injetada superficialmente para ser acessível a microscopia de dois fótons intravital, as injeções superficiais deixam de recapitular as condições fisiopatológicas. Na verdade, escapando através do trato injeção maioria das células tumorais alcançar o espaço extra-dural onde expandir anormalmente rápido na ausência de restrições mecânicas do parênquima. Nossos melhorias não consistem apenas em focalmente a implantação de um esferóide de glioma em vez de injecção de uma suspensão de células de glioma nas camadas superficiais do córtex cerebral, mas também no entupimento do local de injecção por um gel de dextrano hemi-cordão de ligação cruzada que é colada à surrounding parênquima e selou a dura-máter com cianoacrilato. Todas estas medidas aplicar a expansão fisiológica e infiltração de células tumorais no interior do parênquima cerebral. Craniotomia foi finalmente fechada com uma janela de vidro cimentados ao crânio para permitir imagens crônica ao longo de semanas, na ausência de desenvolvimento do tecido da cicatriz. Aproveitando-se de animais transgênicos fluorescentes enxertados com células tumorais fluorescentes Nós mostramos que a dinâmica das interações que ocorrem entre as células de glioma, neurônios (ex-PCP Thy1 ratos) e vascularização (destacado por uma injeção intravenosa de um corante fluorescente) pode ser visualizado por intravital microscopia de dois fotões durante a progressão da doença. A possibilidade de uma imagem de tumor com resolução microscópica em um ambiente cerebral minimamente comprometido representa uma melhoria de modelos animais atuais GBM que deve beneficiar o campo da neuro-oncologia e testes de drogas. </p&gt;

Uma vez que o protocolo cirúrgico é realizado (Figura 1), os animais podem ser observados por meio de microscopia de fluorescência ao longo de semanas até ao sacrifício. Uma reação inflamatória pode ser observada após a cirurgia, que desaparece dentro de uma ou duas semanas. O crescimento do tumor pode ser observada através de várias técnicas de microscopia, incluindo a microscopia de fluorescência e análise macroscópica de dois fotões (Figura 2). Imagens de exemplo desc...

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An Orthotopic Glioblastoma Mouse Model Maintaining Brain Parenchymal Physical Constraints and Suitable for Intravital Two-photon Microscopy

Nós estabelecemos um modelo de glioblastoma ortotópico cortical em camundongos para microscopia de dois fótons intravital que recapitula as restrições biofísicas normalmente no jogo durante o crescimento do tumor. Uma janela de vidro crônica substituir o crânio acima do tumor permite o acompanhamento da progressão do tumor ao longo do tempo por meio de microscopia de dois fótons.

Um Glioblastoma Rato modelo ortotópico Manter restrições Cérebro parênquima físicas e Adequado para intravital dois fótons Microscopia

Glioblastoma multiforme (GBM) is the most aggressive form of brain tumors with no curative treatments available to date.
Murine models of this pathology ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Medicine

19.6K visualizações.  Aix Marseille University.  Nós estabelecemos um modelo de glioblastoma ortotópico cortical em camundongos para microscopia de dois fótons intravital que recapitula as restrições biofísicas normalmente no jogo durante o crescimento do tumor. Uma janela de vidro crônica substituir o crânio acima do tumor permite o acompanhamento da progressão do tumor ao longo do tempo por meio de microscopia de dois fótons. 

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Combination Radiotherapy in an Orthotopic Mouse Brain Tumor Model

Glioblastoma multiforme (GBM) are the most common and aggressive adult primary brain tumors1. In recent years there has been substantial progress in the understanding of the mechanics of tumor invasion, and direct intracerebral inoculation of tumor provides the opportunity of observing the invasive process in a physiologically appropriate environment2. As far as human brain tumors are concerned, the orthotopic models currently available are established either by stereotaxic injection of cell suspensions or implantation of a solid piece of tumor through a complicated craniotomy procedure3. In our technique we harvest cells from tissue culture to create a cell suspension used to implant directly into the brain. The duration of the surgery is approximately 30 minutes, and as the mouse needs to be in a constant surgical plane, an injectable anesthetic is used. The mouse is placed in a stereotaxic jig made by Stoetling (figure 1). After the surgical area is cleaned and prepared, an incision is made; and the bregma is located to determine the location of the craniotomy. The location of the craniotomy is 2 mm to the right and 1 mm rostral to the bregma. The depth is 3 mm from the surface of the skull, and cells are injected at a rate of 2 &mu;l every 2 minutes. The skin is sutured with 5-0 PDS, and the mouse is allowed to wake up on a heating pad. From our experience, depending on the cell line, treatment can take place from 7-10 days after surgery. Drug delivery is dependent on the drug composition. For radiation treatment the mice are anesthetized, and put into a custom made jig. Lead covers the mouse's body and exposes only the brain of the mouse. The study of tumorigenesis and the evaluation of new therapies for GBM require accurate and reproducible brain tumor animal models. Thus we use this orthotopic brain model to study the interaction of the microenvironment of the brain and the tumor, to test the effectiveness of different therapeutic agents with and without radiation.

The purpose of this article is to describe the use of an orthotopic glioblastoma model for chemoradiation studies. This article will go though cell processing, implanting, and radiotherapy of the mouse using an intracranial model.

Radioterapia em uma combinação ortotópico modelo de tumor de cérebro de camundongos

Glioblastoma multiforme (GBM) are the most common and aggressive adult primary brain tumors1. In recent years there has been substantial progress in the ...

Medicina

Longitudinal Intravital Imaging of Brain Tumor Cell Behavior in Response to an Invasive Surgical Biopsy

Biopsies are standard of care for cancer treatment and are clinically beneficial as they allow solid tumor diagnosis, prognosis, and personalized treatment determination. However, perturbation of the tumor architecture by biopsy and other invasive procedures has been associated with undesired effects on tumor progression, which need to be studied in depth to further improve the clinical benefit of these procedures. Conventional static approaches, which only provide a snapshot of the tumor, are limited in their ability to reveal the impact of biopsy on tumor cell behavior such as migration, a process closely related to tumor malignancy. In particular, tumor cell migration is the key in highly aggressive brain tumors, where local tumor dissemination makes total tumor resection virtually impossible. The development of multiphoton imaging and chronic imaging windows allows scientists to study this dynamic process in living animals over time. Here, we describe a method for the high-resolution longitudinal imaging of brain tumor cells before and after a biopsy in the same living animal. This approach makes it possible to study the impact of this procedure on tumor cell behavior (migration, invasion, and proliferation). Furthermore, we discuss the advantages and limitations of this technique, as well as the ability of this methodology to study changes in the cancer cell behavior for other surgical interventions, including tumor resection or the implantation of chemotherapy wafers.

Here we describe a method for high-resolution time-lapse multiphoton imaging of brain tumor cells before and after invasive surgical intervention (e.g., biopsy) within the same living animal. This method allows studying the impact of these invasive surgical procedures on tumor cells&#39; migratory, invasive, and proliferative behavior at a single cell level.

Imagem latente longitudinal de intravital do comportamento da pilha do tumor cerebral em resposta a uma biópsia cirúrgica invasora

Biopsies are standard of care for cancer treatment and are clinically beneficial as they allow solid tumor diagnosis, prognosis, and personalized ...

Pesquisa do câncer

Imaging Glioma Initiation In Vivo Through a Polished and Reinforced Thin-skull Cranial Window

Glioma is the one of the most lethal forms of human cancer. The most effective glioma therapy to date-surgery followed by radiation treatment-offers patients only modest benefits, as most patients do not survive more than five years following diagnosis due to glioma relapse 1,2. The discovery of cancer stem cells in human brain tumors holds promise for having an enormous impact on the development of novel therapeutic strategies for glioma 3. Cancer stem cells are defined by their ability both to self-renew and to differentiate, and are thought to be the only cells in a tumor that have the capacity to initiate new tumors 4. Glioma relapse following radiation therapy is thought to arise from resistance of glioma stem cells (GSCs) to therapy 5-10. In vivo, GSCs are shown to reside in a perivascular niche that is important for maintaining their stem cell-like characteristics 11-14. Central to the organization of the GSC niche are vascular endothelial cells 12. Existing evidence suggests that GSCs and their interaction with the vascular endothelial cells are important for tumor development, and identify GSCs and their interaction with endothelial cells as important therapeutic targets for glioma. The presence of GSCs is determined experimentally by their capability to initiate new tumors upon orthotopic transplantation 15. This is typically achieved by injecting a specific number of GBM cells isolated from human tumors into the brains of severely immuno-deficient mice, or of mouse GBM cells into the brains of congenic host mice. Assays for tumor growth are then performed following sufficient time to allow GSCs among the injected GBM cells to give rise to new tumors-typically several weeks or months. Hence, existing assays do not allow examination of the important pathological process of tumor initiation from single GSCs in vivo. Consequently, essential insights into the specific roles of GSCs and their interaction with the vascular endothelial cells in the early stages of tumor initiation are lacking. Such insights are critical for developing novel therapeutic strategies for glioma, and will have great implications for preventing glioma relapse in patients. Here we have adapted the PoRTS cranial window procedure 16and in vivo two-photon microscopy to allow visualization of tumor initiation from injected GBM cells in the brain of a live mouse. Our technique will pave the way for future efforts to elucidate the key signaling mechanisms between GSCs and vascular endothelial cells during glioma initiation.

Imaging Glioma Initiation In Vivo Through a Polished and Reinforced Thin-skull Cranial Window

By combining a polished and reinforced thin-skull (PoRTS) cranial window and glioblastoma (GBM) cell injection, we can observe glioma initiation and growth from injected GBM cells in the brain of a live mouse longitudinally.

Imagem Glioma Iniciação<em&gt; Em Vivo</em&gt; Através de um polido e reforçado Janela crânio-Thin craniana

Glioma is the one of the most lethal forms of human cancer. The most effective glioma therapy to date-surgery followed by radiation treatment-offers ...

A Polished and Reinforced Thinned-skull Window for Long-term Imaging of the Mouse Brain

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form a polished and reinforced thinned skull (PoRTS) window in the mouse skull that spans several millimeters in diameter and is stable for months. The skull is thinned to 10 to 15 &mu;m in thickness with a hand held drill to achieve optical clarity, and is then overlaid with cyanoacrylate glue and a cover glass to: 1) provide rigidity, 2) inhibit bone regrowth and 3) reduce light scattering from irregularities on the bone surface. Since the skull is not breached, any inflammation that could affect the process being studied is greatly reduced. Imaging depths of up to 250 &mu;m below the cortical surface can be achieved using two-photon laser scanning microscopy. This window is well suited to study cerebral blood flow and cellular function in both anesthetized and awake preparations. It further offers the opportunity to manipulate cell activity using optogenetics or to disrupt blood flow in targeted vessels by irradiation of circulating photosensitizers.

We present a method to form an imaging window in the mouse skull that spans millimeters and is stable for months without inflammation of the brain. This method is well suited for longitudinal studies of blood flow, cellular dynamics, and cell/vascular structure using two-photon microscopy.

A polido e reforçado Janela afinado crânio para longo prazo de imagens do cérebro de camundongo

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form ...

Neurociência

Translational Orthotopic Models of Glioblastoma Multiforme

Genetically engineered mouse (GEM) models for human glioblastoma multiforme (GBM) are critical to understanding the development and progression of brain tumors. Unlike xenograft tumors, in GEMs, tumors arise in the native microenvironment in an immunocompetent mouse. However, the use of GBM GEMs in preclinical treatment studies is challenging due to long tumor latencies, heterogeneity in neoplasm frequency, and the timing of advanced grade tumor development. Mice induced via intracranial orthotopic injection are more tractable for preclinical studies, and retain features of the GEM tumors. We generated an orthotopic brain tumor model derived from a GEM model with Rb, Kras, and p53 aberrations (TRP), which develops GBM tumors&#160;displaying linear foci of necrosis by neoplastic cells, and dense vascularization analogous to human GBM. Cells derived from GEM GBM tumors are injected intracranially into wild-type, strain-matched recipient mice and reproduce grade IV tumors, therefore bypassing the long tumor latency period in GEM mice and allowing for the creation of large and reproducible cohorts for preclinical studies. The highly proliferative, invasive, and vascular features of the TRP GEM model for GBM are recapitulated in the orthotopic tumors, and histopathology markers reflect human GBM subgroups. Tumor growth is monitored by serial MRI scans. Due to the invasive nature of the intracranial tumors in immunocompetent models, carefully following the injection procedure outlined here is essential to prevent extracranial tumor growth.

Here, we describe a preclinical orthotopic mouse model for GBM, established by intracranial injection of cells derived from genetically engineered mouse model tumors. This model displays the disease hallmarks of human GBM. For translational studies, the mouse brain tumor is tracked by in vivo MRI and histopathology.

Modelos Ortotópicos Translacionais de Glioblastoma Multiforme

Genetically engineered mouse (GEM) models for human glioblastoma multiforme (GBM) are critical to understanding the development and progression of brain ...

Creating Anatomically Accurate and Reproducible Intracranial Xenografts of Human Brain Tumors

Orthotopic tumor models are currently the best way to study the characteristics of a tumor type, with and without intervention, in the context of a live animal &#8211;&#160;particularly in sites with unique physiological and architectural qualities such as the brain. In vitro and ectopic models cannot account for features such as vasculature, blood brain barrier, metabolism, drug delivery and toxicity, and a host of other relevant factors. Orthotopic models have their limitations too, but with proper technique tumor cells of interest can be accurately engrafted into tissue that most closely mimics conditions in the human brain. By employing methods that deliver precisely measured volumes to accurately defined locations at a consistent rate and pressure, mouse models of human brain tumors with predictable growth rates can be reproducibly created and are suitable for reliable analysis of various interventions. The protocol described here focuses on the technical details of designing and preparing for an intracranial injection, performing the surgery, and ensuring successful and reproducible tumor growth and provides starting points for a variety of conditions that can be customized for a range of different brain tumor models.

The brain is a unique site with qualities that are not well represented by in vitro or ectopic analyses. Orthotopic mouse models with reproducible location and growth characteristics can be reliably created with intracranial injections using a stereotaxic fixation instrument and a low pressure syringe pump.

Criando anatomicamente precisos e reprodutíveis intracraniana Xenoenxertos de tumores cerebrais humanos

Orthotopic tumor models are currently the best way to study the characteristics of a tumor type, with and without intervention, in the context of a live ...

Rastreamento em tempo real de nanopartículas em tumores cerebrais usando 2P-IVM em camundongos

Two-Photon Intravital Microscopy of Glioblastoma in a Murine Model

The delivery of intravenously administered cancer therapeutics to brain tumors is limited by the blood-brain barrier. A method to directly image the accumulation and distribution of macromolecules in brain tumors in vivo would greatly enhance our ability to understand and optimize drug delivery in preclinical models. This protocol describes a method for real-time in vivo tracking of intravenously administered fluorescent-labeled nanoparticles with two-photon intravital microscopy (2P-IVM) in a mouse model of glioblastoma (GBM).
The protocol contains a multi-step description of the procedure, including anesthesia and analgesia of experimental animals, creating a cranial window, GBM cell implantation, placing a head bar, conducting 2P-IVM studies, and post-surgical care for long-term follow-up studies. We show representative 2P-IVM imaging sessions and image analysis, examine the advantages and disadvantages of this technology, and discuss potential applications.
This method can be easily modified and adapted for different research questions in the field of in vivo preclinical brain imaging.

Autor em destaque: Estratégias de imagem multimodal para otimizar a administração de medicamentos e a detecção precoce no tratamento do glioblastoma

We present a novel approach for two-photon microscopy of the tumor delivery of fluorescent-labeled iron oxide nanoparticles to glioblastoma in a mouse model.

Microscopia Intravital de Dois Fótons de Glioblastoma em Modelo Murino

The delivery of intravenously administered cancer therapeutics to brain tumors is limited by the blood-brain barrier. A method to directly image the ...

An Immunocompetent Murine Model for Laser Interstitial Thermal Therapy of Glioblastoma

Glioblastoma (GB), the most aggressive form of primary brain cancer, accounts for approximately half of all high-grade primary brain tumors in adults and has no cure. Laser interstitial thermal therapy (LITT) is a Food and Drug Administration (FDA)-approved treatment for GB and is used in patients who may not be candidates for conventional surgical resection. While the clinical efficacy of LITT has been established, research beyond clinical case studies and case series is limited and hindered by the lack of an established animal model. This protocol uses C57BL/6 mice and syngeneic CT2A glioma cancer cell line to closely recapitulate human GB&#160;while also using a 1064 nm Neodymium-doped Yttrium Aluminum Garnet (Nd:YAG) laser, such as is used in one of the two FDA-approved LITT systems, providing excellent pre-clinical relevance. The successful establishment of this LITT murine model will provide a valuable platform for investigating the unique features of LITT ablation and its effects on the tumor microenvironment, potentially leading to improved therapeutic strategies.

Glioblastoma is a devastating form of primary brain cancer, and laser interstitial thermal therapy is emerging as a promising alternative to conventional surgical resection for inoperable glioblastoma. This protocol describes an optimized pre-clinical mouse model that can be used to study treatment effects or adjuvant and combinatorial treatments.

Glioblastoma (GB), the most aggressive form of primary brain cancer, accounts for approximately half of all high-grade primary brain tumors in adults and ...

Um Glioblastoma Rato modelo ortotópico Manter restrições Cérebro parênquima físicas e Adequado para intravital dois fótons Microscopia

Resumo

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Radioterapia em uma combinação ortotópico modelo de tumor de cérebro de camundongos

Imagem latente longitudinal de intravital do comportamento da pilha do tumor cerebral em resposta a uma biópsia cirúrgica invasora

Imagem Glioma Iniciação

A polido e reforçado Janela afinado crânio para longo prazo de imagens do cérebro de camundongo

Modelos Ortotópicos Translacionais de Glioblastoma Multiforme

Criando anatomicamente precisos e reprodutíveis intracraniana Xenoenxertos de tumores cerebrais humanos

Microscopia Intravital de Dois Fótons de Glioblastoma em Modelo Murino

Microscopia Intravital de Dois Fótons de Glioblastoma em Modelo Murino

Microscopia Intravital de Dois Fótons de Glioblastoma em Modelo Murino

An Immunocompetent Murine Model for Laser Interstitial Thermal Therapy of Glioblastoma