Este método pode ajudar a abordar questões importantes no campo cardiovascular sobre o impacto que a matriz extracelular tem durante diferentes estágios fisiológicos e de desenvolvimento do coração. A principal vantagem dessa técnica é que permite uma análise comparativa entre matrizes extracelulares fetais e adultas, aplicando um método de descelularização semelhante aos dois tipos de tecido. Assim, esse método tem sido bem sucedido aplicado a outros órgãos, como ressecções cirúrgicas de pacientes com câncer facilitando o estudo da matriz extracelular em diferentes contextos.
Comece enxaguando brevemente os corações de camundongos fetais e adultos com PBS gelado. Em seguida, coloque os tecidos sob um microscópio dissecando e use uma tesoura pequena reta para remover a atria, o ventrículo direito e o septo dos corações do rato adulto. Transfira o ventrículo esquerdo para uma nova placa de Petri e divida a parede livre do ventrículo esquerdo em tiras longitudinais de dois milímetros de espessura.
O uso de explants ventrículos esquerdos de camundongos adultos de tamanho homogêneo é essencial para uma eficiência consistente de descelularização. Use o bisturi e pinças serrilhadas com ponta curva para remover o músculo papilar antes de usar uma grade de dois por dois milímetros para cortar ainda mais as tiras em fragmentos de tecido menores. Quando todo o tecido tiver sido picado, enxágue brevemente as peças com PBS suficiente para cobrir as explantas.
E transfira os corações fetais e pedaços de tecido cardíaco adulto em tubos individuais de microcentrífugo de 1,5 mililitro contendo 250 microliters de temperatura de corte ideal ou composto oct por tubo. Em seguida, congele as amostras de tecido cardíaco em isócecia resfriada de gelo seco para armazenamento a 80 graus Celsius negativos. Para descelularizar os tecidos preservados crio-preservo coloque as amostras congeladas em uma placa de Petri contendo PBS suficiente para cobrir completamente as explantas.
Após o derretimento do OCT, submerse as amostras em uma nova placa de Petri da PBS e lave as amostras três vezes em um agitador por 10 a 15 minutos a 60 RPM por lavagem. Após a última lavagem, adicione um mililitro de tampão hipotônico de trabalho a cada poço de uma placa de cultura tecidual estéril de 24 poços e use fórceps finos para transferir um fragmento para cada poço. Incubar a placa a 25 graus Celsius durante 18 horas, a 165 RPM seguido de três lavagens de uma hora em um mililitro de PBS por poço, por lavagem.
Após a última lavagem, adicione um mililitro de sulfato de dodecyl de sódio recém-preparado ou solução de SDS para cada poço para uma incubação de 24 horas a 25 graus Celsius. No dia seguinte, enxágue as amostras com três lavagens de 20 minutos em um mililitro de tampão de lavagem hipotônica por lavagem seguido da adição de um mililitro de solução de tratamento DNase para cada poço para uma incubação de três horas, a 37 graus Celsius. No final da incubação, as amostras descelularizadas devem perder sua consistência semelhante à gelatina.
Em seguida, lave os fragmentos de tecido três vezes com um mililitro de PBS por 20 minutos por lavagem seguido de uma lavagem durante a noite em um mililitro de PBS fresco por poço em temperatura ambiente e 60 RPM. Para avaliar a remoção de restos celulares do tecido descelularizado, na manhã seguinte fixe as amostras em um mililitro de tampão neutro de fórmula recém-preparada complementada com 0,03% de eosina aquosa por poço por 2,5 a 3 horas à temperatura ambiente. No final da incubação, lave as amostras em um mililitro de PBS por poço.
E use um molde de espécime de vinil descartável para encapsular os fragmentos descelularizados em gel de processamento de histologia de acordo com as especificações do fabricante. Em seguida, transfira os fragmentos encapsulados para um processo de biópsia incorporando. E processe as amostras para parafinas incorporando através de sucessivas incubações de 30 minutos em concentrações ascendentes de etanol, solução de hidrocarbonetos alifáticos isoparafina e dois parafinas de 56 graus Celsius.
Após a segunda parafina emergente, monte amostras em um bloco de parafina e use um microtómeo para obter seções de três micrômetros de espessura. Em seguida, verifique a eficiência de descelularização colorindo as seções com hematoxilina e eosina e as manchas tricráticas de Masson de acordo com os protocolos padrão. Após a lavagem da PBS durante a noite com agitação, adicione 500 microliters de DPBS recém-preparados, complementados com 2,5 microgramas por mililitro de solução de anfotericina B 1% antibiótico para cada andaime.
E armazene as amostras por um a sete dias a quatro graus Celsius. Antes de acomodar as células, substitua a solução DPBS por 500 microliters de meio basal celular suplementados com antibióticos. E incubar os andaimes por uma hora a 37 graus Celsius.
No final da incubação, use um microscópio para adicionar uma queda de quatro microliter de DPBS ao centro de um poço de uma placa de 96 poços por andaime. E use pinças retas finas para transferir um andaime descelularizado para o topo de cada gota. Remova qualquer DPBS extra por aspiração e confirme que o andaime não está dobrado ou enrugado.
Quando os andaimes secaram nas bordas, assento lentamente uma única suspensão celular das células de interesse na parte superior de cada andaime. O dia embrionário 18 tecidos descelularizados são caracterizados por uma estrutura altamente translúcida, enquanto explantas adultas exibem uma aparência translúcida à aparência branca. Hematoxylin e eosina e as manchas de trichome de Masson confirmam uma eficiente remoção celular pela tela porosa presença.
O material nuclear é reduzido em aproximadamente 99,8% após a descelularização, em comparação com tecidos não manipulados, o que é essencial para evitar desencadear uma resposta inflamatória indesejada após a implantação. A viabilidade celular dentro de andaimes sentados pode ser monitorada durante a cultura in vitro por coloração de calcein. A análise terminal da repopulação e distribuição celular em andaimes, também pode ser realizada após o processamento da parafina, conforme observado nestas imagens representativas de uma seção central de bioscafados.
Assim, essa técnica abriu caminho para pesquisadores na exploração das propriedades bioativas da matriz extracelular a partir de corações de camundongos fetais e adultos, mas também de outros tecidos.
