A produção eo trabalho experimental aqui apresentados refletem a ajuda dedicado e entusiasta de Reynaldo Pareja. Financiado pelo Departamento Administrativo da Colômbia de Ciência, Tecnologia e Inovação (Colciencias) e por uma doação da Fundação Bill &amp; Melinda Gates através da Grande iniciativa Explorations Desafios.

1. Plantas <ol><li> Surface-esterilizar as sementes de feijão (cv. Calima) por imersão durante dois minutos em hipoclorito de sódio a 0,5%, e dois minutos em etanol a 70%. Enxaguar as sementes três vezes em água destilada estéril. </li><li> Avaliar o sucesso da sua esterilização através do plaqueamento de 100 ul de água de enxaguamento final em agar de batata dextroxe (PDA) meios de comunicação, e incubando a placa durante 10 dias a 25 ° C. Encerrar e reiniciar o experimento se algum crescimento é visto na placa. </li><li> Plantar as sementes, em grupos de três em vasos contendo uma mistura estéril de solo e areia numa proporção de 2:1. Transferir os vasos para uma câmara de crescimento a 25 ° C, ca. 50% UR e 12 horas de fotoperíodo. Uma semana após a germinação, eliminar os menos duas mudas vigorosas. De água cada 2-3 dias com água destilada estéril e fertilizar 10 e 20 dias após plantação, com uma solução de água de 6 g / L de fertilizante NPK 15-15-15. </li></ol> 2. Fungo <ol><li> Obter um commerformulação social de Beauveria bassiana cepa GHA (Mycotrol SE, Laverlam, Cali, Colômbia). </li><li> Para gerar uma cultura de um único esporo, suspender ca. um circuito de inoculação cheia de conídios em 1 ml de uma solução aquosa a 0,1% de Triton X-100 e vortex durante 10 seg. Em seguida, a placa 100 uL da suspensão em 2,5% de agar Noble e incubar durante 24 horas a 25 ° C. Transferir um único conídio germinando em um PDA placa contendo 100 milímetros e crescer até cobrir toda a placa (cerca de 3-4 semanas). </li><li> Sob condições estéreis, raspar o crescimento de fungos na superfície do meio e suspendê-lo em 10% de 0,1 ml estéril Triton X-100. Vortex durante um minuto. Em seguida, filtrar a suspensão através de uma gaze estéril para remover hifas e obter a suspensão de estoque. </li><li> Usar um hemocitómetro para estimar a concentração de conídios de a suspensão de estoque. Para facilitar a contagem de conídios, preparar uma diluição de 10 mil vezes em série das ações, cada vez que a transferência de 100 o ulf suspensão de conídios em 900 ul de 0,1% de Triton X-100, e vortex durante 10 segundos antes da diluição seguinte. </li><li> Para gerar o inóculo, ajustar a suspensão de pasta até uma concentração final de 10 8 conídios / ml, utilizando a fórmula: <img src="/files/ftp_upload/50360/50360eq1.jpg" alt="equação 1" fo:src="/files/ftp_upload/50360/50360eq1highres.jpg"/></li><li> Para avaliar a viabilidade de conídios, a placa 100 uL de uma diluição de 10.000 vezes em 2,5% de agar Noble e incubar durante 24 horas a 25 ° C. Então, inspecionar três grupos aleatórios de 100 conídios para estimar a germinação por cento. Considere um conídio germinado quando um tubo de germe visível superior a metade do diâmetro dos projectos de conídios a partir dele. Só use a suspensão quando a porcentagem de germinação média superior a 90%. </li></ol> 3. Inoculação <ol><li> Inocular plantas quando atingirem o estágio de primeiras folhas (cerca de 14 dias após o plantio). As plantas aquáticas para a capacidade do solo estéril com destilared água 24 horas antes da inoculação. </li><li> Para o método de pulverização da folhagem, utilizar um atomizador manual para aplicar a suspensão de conídios (tratamento) ou 0,1% de Triton X-100 (testemunha) para a superfície (superior) adaxial de folhas até atingirem a saturação. Cobrir a parte superior do vaso com folha de alumínio para evitar o escoamento de conídios ao solo. Após a pulverização, as plantas cobrir com um saco de plástico durante 24 horas para manter um elevado nível de humidade facilitando invasão de fungos. </li><li> Para o método de rega do solo, utilizar um cilindro graduado para aplicar 10 ml de suspensão de conídios (tratamento) ou 0,1% de Triton X-100 (testemunha) para a superfície do solo na base da planta. </li><li> Após a inoculação, as plantas retornar para as câmaras de crescimento organizando-os em um delineamento em blocos casualizados. Nada menos do que quatro blocos experimentais adicionais devem ser instalados para possibilitar a avaliação do crescimento das plantas, além de avaliações de colonização endofítica, no mesmo experimento. </li></ol> 4. Evaluations <ol><li> Avaliar a experiência um bloco de cada vez, a selecção dos blocos por ordem aleatória. Isto é particularmente importante para as experiências de grandes dimensões que não podem ser avaliados num único dia. </li><li> Antes de processamento de uma planta, medir e registar a sua altura a partir da base para o meristema apical. Então, arrancar com cuidado e lave em água corrente. </li><li> De cada planta amostra, dois folhetos, dois pedaços de raiz e dois pedaços de caule. Seleccionar amostras aleatoriamente a partir do folheto da primeira folha verdadeira da planta. Em seguida, obter duas amostras estaminais, 3 cm de comprimento cada, a partir do meio da planta e de perto da superfície do solo. Finalmente, obter duas amostras taproot, também 3 cm de comprimento cada, a partir do meio da raiz e a partir de 1 cm atrás da ponta da raiz. Colocar as amostras em três sacos de papel separados e etiqueta de forma adequada. </li><li> Depois de lavar e amostragem todas as plantas em um bloco, começar pelo processamento das folhas, raízes, em seguida, e, finalmente, as hastes. </li><li> Superfície esterilizar tquestões em um capuz de fluxo laminar estéril como em 1.1, acima. Lavar cada amostra três vezes por imersão em água destilada estéril e deixe secar em papel toalha estéril. Então, dissecar e descartar suas bordas exteriores, onde endófitos poderiam ter sido eliminado devido ao contato com desinfetantes. </li><li> Cortar a amostra cortada em seis seções, com média de 6x6 mm para as folhas e 6 mm de comprimento para caules e raízes. Placa das seis secções sobre uma placa de Petri 60 mm com meio BDA suplementado com o antibiótico tetraciclina, estreptomicina e penicilina a 2 mg / L de cada. Selar a placa com parafilme e incubadas no escuro a 25 ° C. Cada planta produz seis pratos, duas peças por planta. </li><li> Mude a água de enxágüe após o processamento de cada bloco de uma parte determinada planta. Antes de eliminar a água de lavagem utilizada chapa, uma amostra de 100 ul de meio BDA e incubar durante 10 dias a 25 ° C para avaliar o sucesso da esterilização. Se o crescimento de fungos se segue, não consideram as amostras correspondentes para análise. </li><li> Inspecionar as placas a cada 2-3 dias durante 20 dias para observar e registrar crescimento de fungos. Seções especiais sobre o consumo de plantas e transferência exibindo presença de endófitos fúngicos para placas contendo PDA fresco. Isto irá evitar a contaminação das secções de plantas vizinhas na placa original. </li><li> Registro B. bassiana crescimento das partes da instalação. Beauveria bassiana podem ser identificados por micélio branco característico denso tornando o creme a amarelo pálido na borda. Quando em dúvida, montar o espécime em uma gota de água e verifique sob um microscópio, procurando globosa conídios e em forma de ziguezague conidióforos, característica da espécie. </li><li> Use blocos experimentais adicionais para avaliar o impacto dos tratamentos sobre a biomassa da planta. Em primeiro lugar, mede a sua altura a partir da base para o topo do meristema apical. Então, cuidadosamente desenraizar e lavar as plantas em água da torneira e deixar secar a 45 ° C durante três dias, para determinar o seu peso seco. </li></ol>

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	<li>Vega, F. E., Meyling, N. V., Luangsa-ard, J. J., Blackwell, M., Vega, F. E., Kaya, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fungal entomopathogens in Insect Pathology. , 171-220 (2012).</li><li>Vega, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect+pathology+and+fungal+endophytes.">Insect pathology and fungal endophytes.</a> Journal of invertebrate pathology. 98, 277-279 (2008).</li><li>Sasan, R. K., Bidochka, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+insect-pathogenic+fungus+Metarhizium+robertsii+(Clavicipitaceae)+is+also+an+endophyte+that+stimulates+plant+root+development.">The insect-pathogenic fungus Metarhizium robertsii (Clavicipitaceae) is also an endophyte that stimulates plant root development.</a> American journal of botany. 99, 101-107 (2012).</li><li>Elena, G. J., Beatriz, P. J., Alejandro, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metarhizium+anisopliae+(Metschnikoff)+Sorokin+promotes+growth+and+has+endophytic+activity+in+tomato+plants.">Metarhizium anisopliae (Metschnikoff) Sorokin promotes growth and has endophytic activity in tomato plants.</a> Advances in biological research. 5, 22-27 (2011).</li><li>Bing, L. A., Lewis, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+Ostrinia+nubilalis+(H&#252;bner)(Lepidoptera:+Pyralidae)+by+endophytic+Beauveria+bassiana+(Balsamo)+Vuillemin.">Suppression of Ostrinia nubilalis (H&#252;bner)(Lepidoptera: Pyralidae) by endophytic Beauveria bassiana (Balsamo) Vuillemin.</a> Environmental entomology. 20, 1207-1211 (1991).</li><li>Akello, J., Dubois, T., Coyne, D., Kyamanywa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endophytic+Beauveria+bassiana+in+banana+(Musa+spp.)+reduces+banana+weevil+(Cosmopolites+sordidus)+fitness+and+damage.">Endophytic Beauveria bassiana in banana (Musa spp.) reduces banana weevil (Cosmopolites sordidus) fitness and damage.</a> Crop protection. 27, 1437-1441 (2008).</li><li>Gurulingappa, P., Sword, G. A., Murdoch, G., McGee, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colonization+of+crop+plants+by+fungal+entomopathogens+and+their+effects+on+two+insect+pests+when+in+planta.">Colonization of crop plants by fungal entomopathogens and their effects on two insect pests when in planta.</a> Biological. 55, 34-41 (2010).</li><li>Akello, J., Dubois, T., Coyne, D., Kyamanywa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+endophytic+Beauveria+bassiana+on+populations+of+the+banana+weevil,+Cosmopolites+sordidus,+and+their+damage+in+tissue-cultured+banana+plants.">Effect of endophytic Beauveria bassiana on populations of the banana weevil, Cosmopolites sordidus, and their damage in tissue-cultured banana plants.</a> Entomologia experimentalis et applicata. 129, 157-165 (2008).</li><li>Ownley, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beauveria+bassiana:+Endophytic+colonization+and+plant+disease+control.">Beauveria bassiana: Endophytic colonization and plant disease control.</a> Journal of invertebrate pathology. 98, 267-270 (2008).</li><li>Ownley, B. H., Gwinn, K. D., Vega, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endophytic+fungal+entomopathogens+with+activity+against+plant+pathogens:+ecology+and+evolution.">Endophytic fungal entomopathogens with activity against plant pathogens: ecology and evolution.</a> BioControl. 55, 113-128 (2010).</li><li>Akello, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beauveria+bassiana+(Balsamo)+Vuillemin+as+an+endophyte+in+tissue+culture+banana+(Musa+spp.).">Beauveria bassiana (Balsamo) Vuillemin as an endophyte in tissue culture banana (Musa spp.).</a> Journal of invertebrate pathology. 96, 34-42 (2007).</li><li>G&#243;mez-Vidal, S., Lopez-Llorca, L. V., Jansson, H. B., Salinas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endophytic+colonization+of+date+palm+(Phoenix+dactylifera+L.)+leaves+by+entomopathogenic+fungi.">Endophytic colonization of date palm (Phoenix dactylifera L.) leaves by entomopathogenic fungi.</a> Micron. 37, 624-632 (2006).</li><li>Posada, F., Vega, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+the+fungal+entomopathogen+Beauveria+bassiana+(Ascomycota:+Hypocreales)+as+an+endophyte+in+cocoa+seedlings+(Theobroma+cacao).">Establishment of the fungal entomopathogen Beauveria bassiana (Ascomycota: Hypocreales) as an endophyte in cocoa seedlings (Theobroma cacao).</a> Mycologia. 97, 1195-1200 (2005).</li><li>Tefera, T., Vidal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+inoculation+method+and+plant+growth+medium+on+endophytic+colonization+of+sorghum+by+the+entomopathogenic+fungus+Beauveria+bassiana.">Effect of inoculation method and plant growth medium on endophytic colonization of sorghum by the entomopathogenic fungus Beauveria bassiana.</a> BioControl. 54, 663-669 (2009).</li><li>Posada, F., Vega, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inoculation+and+colonization+of+coffee+seedlings+(Coffea+arabica+L.)+with+the+fungal+entomopathogen+Beauveria+bassiana+(Ascomycota:+Hypocreales.">Inoculation and colonization of coffee seedlings (Coffea arabica L.) with the fungal entomopathogen Beauveria bassiana (Ascomycota: Hypocreales.</a> Mycoscience. 47, 284-289 (2006).</li><li>Akello, J., Dubois, T., Coyne, D., Kyamanywa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+Beauveria+bassiana+dose+and+exposure+duration+on+colonization+and+growth+of+tissue+cultured+banana+(Musa+sp.)+plants.">The effects of Beauveria bassiana dose and exposure duration on colonization and growth of tissue cultured banana (Musa sp.) plants.</a> Biological. 49, 6-10 (2009).</li><li>Posada, F., Aime, M. C., Peterson, S. W., Rehner, S. A., Vega, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inoculation+of+coffee+plants+with+the+fungal+entomopathogen+Beauveria+bassiana+(Ascomycota:+Hypocreales).">Inoculation of coffee plants with the fungal entomopathogen Beauveria bassiana (Ascomycota: Hypocreales).</a> Mycological research. 111, 748-757 (2007).</li><li>Brownbridge, M., Reay, S. D., Nelson, T. L., Glare, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistence+of+Beauveria+bassiana+(Ascomycota:+Hypocreales)+as+an+endophyte+following+inoculation+of+radiata+pine+seed+and+seedlings.">Persistence of Beauveria bassiana (Ascomycota: Hypocreales) as an endophyte following inoculation of radiata pine seed and seedlings.</a> Biological control. 61, 194-200 (2012).</li><li>Posada, F. J., Chaves, F. C., Gianfagna, T. J., Pava-Ripoll, M., Hebbar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+the+fungal+entomopathogen+Beauveria+bassiana+as+an+endophyte+in+cocoa+pods+(Theobroma+cacao+L.).">Establishment of the fungal entomopathogen Beauveria bassiana as an endophyte in cocoa pods (Theobroma cacao L.).</a> Revista U.D.C.A. actualidad &amp; divulgaci&#243;n cient&#237;fica. 13, 71-78 (2010).</li><li>Quesada-Moraga, E., Landa, B. B., Mu&#241;oz-Ledesma, J., Jim&#233;nez-D&#237;az, R. M., Santiago-Alvarez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endophytic+colonisation+of+opium+poppy,+Papaver+somniferum,+by+an+entomopathogenic+Beauveria+bassiana+strain.">Endophytic colonisation of opium poppy, Papaver somniferum, by an entomopathogenic Beauveria bassiana strain.</a> Mycopathologia. 161, 323-329 (2006).</li><li>Biswas, C., Dey, P., Satpathy, S., Satya, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+the+fungal+entomopathogen+Beauveria+bassiana+as+a+season+long+endophyte+in+jute+(Corchorus+olitorius)+and+its+rapid+detection+using+SCAR+marker.">Establishment of the fungal entomopathogen Beauveria bassiana as a season long endophyte in jute (Corchorus olitorius) and its rapid detection using SCAR marker.</a> BioControl. , 1-7 (2011).</li><li>Bing, L. A., Lewis, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Occurrence+of+the+entomopathogen+Beauveria+bassiana+(Balsamo)+Vuillemin+in+different+tillage+regimes+and+in+Zea+mays+L.+and+virulence+towards+Ostrinia+nubilalis+(H&#252;bner).">Occurrence of the entomopathogen Beauveria bassiana (Balsamo) Vuillemin in different tillage regimes and in Zea mays L. and virulence towards Ostrinia nubilalis (H&#252;bner).</a> Agriculture, ecosystems &amp; environment. 45, 147-156 (1993).</li><li>Akello, J., Sikora, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+acropedal+influence+of+endophyte+seed+treatment+on+Acyrthosiphon+pisum+and+Aphis+fabae+offspring+development+and+reproductive+fitness.">Systemic acropedal influence of endophyte seed treatment on Acyrthosiphon pisum and Aphis fabae offspring development and reproductive fitness.</a> Biological. 61, 215-221 (2012).</li><li>Reddy, N. P., Ali Khan, A. P., Devi, U. K., Sharma, H. C., Reineke, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+millet+crop+plant+(Sorghum+bicolor)+with+the+entomopathogenic+fungus+(Beauveria+bassiana)+to+combat+infestation+by+the+stem+borer,+Chilo+partellus+Swinhoe+(Lepidoptera:+Pyralidae.">Treatment of millet crop plant (Sorghum bicolor) with the entomopathogenic fungus (Beauveria bassiana) to combat infestation by the stem borer, Chilo partellus Swinhoe (Lepidoptera: Pyralidae.</a> Journal of Asia Pacific. 12, 221 (2009).</li><li>Quesada-Moraga, E., Mu&#241;oz-Ledesma, F. J., Santiago-Alvarez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+protection+of+Papaver+somniferum+L.+against+Iraella+luteipes+(Hymenoptera:+Cynipidae)+by+an+endophytic+strain+of+Beauveria+bassiana+(Ascomycota:+Hypocreales).">Systemic protection of Papaver somniferum L. against Iraella luteipes (Hymenoptera: Cynipidae) by an endophytic strain of Beauveria bassiana (Ascomycota: Hypocreales).</a> Environmental entomology. 38, 723-730 (2009).</li><li>Cherry, A. J., Banito, A., Djegui, D., Lomer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+the+stem-borer+Sesamia+calamistis+(Lepidoptera;+Noctuidae)+in+maize+following+seed+dressing,+topical+application+and+stem+injection+with+African+isolates+of+Beauveria+bassiana.">Suppression of the stem-borer Sesamia calamistis (Lepidoptera; Noctuidae) in maize following seed dressing, topical application and stem injection with African isolates of Beauveria bassiana.</a> International journal of pest management. 50, 67-73 (2004).</li><li>Gurulingappa, P., McGee, P. A., Sword, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endophytic+Lecanicillium+lecanii+and+Beauveria+bassiana+reduce+the+survival+and+fecundity+of+Aphis+gossypii+following+contact+with+conidia+and+secondary+metabolites.">Endophytic Lecanicillium lecanii and Beauveria bassiana reduce the survival and fecundity of Aphis gossypii following contact with conidia and secondary metabolites.</a> Crop protection. 30, 349-353 (2011).</li><li>van Schoonhoven, A., Voysest, O., Schwartz, H. F., Pastor-Corrales, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Common beans in Latin America and their constraints in Bean production problems in the tropics. , 33-57 (1989).</li><li>De Vos, M., Jander, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choice+and+no-choice+assays+for+testing+the+resistance+of+A.+thaliana+to+chewing+insects.">Choice and no-choice assays for testing the resistance of A. thaliana to chewing insects.</a> J. Vis. Exp. (15), e683 (2008).</li><li>Parsa, S., Sotelo, G., Cardona, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+herbivore+resistance+mechanisms:+spittlebugs+on+Brachiaria+spp.+as+an+example.">Characterizing herbivore resistance mechanisms: spittlebugs on Brachiaria spp. as an example.</a> J. Vis. Exp. (52), e3047 (2011).</li><li>Atamian, H., Roberts, P., Kaloshian, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+and+low+throughput+screens+with+root-knot+nematodes+Meloidogyne+spp.">High and low throughput screens with root-knot nematodes Meloidogyne spp.</a> J. Vis. Exp. (61), e3629 (2012).</li></ol>

Os autores declaram que não têm interesses conflitantes financeiros.

Muitos fatores podem influenciar o resultado de um experimento específico para estabelecer um entomopatógeno fungos como um endófito. Os nossos resultados demonstram o método de inoculação é um deles. Fatores biológicos para experimentar com incluem a colheita de espécies ou de cultivares selecionadas e do fungo entomopatogênico tensão espécies ou isolar usado. Outros factores a considerar incluem a manipulação da concentração do inoculo, a idade da planta durante a inoculação, e as condições de crescimento da planta. Seria ideal para um método de inoculação de resultar em colonização planta sistémica por um fungo entomopatógeno 14,17,18,21. Em vez disso, parece que os métodos de inoculação tendem a favorecer um padrão específico de colonização local. No café, por exemplo, pulverizações foliares, ao passo que favorecem a colonização folha poções solo favorecem a colonização de raiz 17. Encontramos o mesmo padrão do feijoeiro comum. Finalmente, a escolha do método de inoculação deve serguiado pelo local pretendido do endófito dentro de uma planta, provavelmente combinando o nicho do herbívoro alvo ou patógeno de planta. Embora comumente usado detecção, endófito e quantificação com base em meios de cultura pode ser caro, difícil e sujeito a erros. Por exemplo, um total de 10.800 partes de plantas (plaqueadas em placas de Petri 1800) foram avaliados num ensaio de optimizar B. inoculações bassiana em banana 16. Destes, 4.496 seções foram colonizados por um suposto B. bassiana, conforme identificado principalmente pela morfologia das colónias. Claramente, uma verificação microscópica das espécies para cada colônia teria sido um passo desejável, mas inacessível. Por outro lado, as secções 1176 foram colonizados por outros fungos e foram descartados e tratados como dados perdidos 16. A probabilidade de existir, no entanto, que a B. bassiana era um concorrente pobres ou mais lento a crescer, e poderia ter eventualmente emergiu dessas seções se umtempo suficiente llowed. Portanto, os métodos de detecção de endofíticos baseados em culturas de mídia estão sujeitos a falsos positivos e falsos negativos. Por conseguinte, o desenvolvimento de uma detecção mais fiável e quantificação de métodos, por exemplo aquelas baseadas em reacção em cadeia de polimerase (PCR) 20,21,24, é bem justificado. O objetivo final para experimentos de inoculação deve ser desenvolver um tratamento eficaz que proporciona resistência sistêmica durável contra herbivoria e / ou doença. Um plausível, mas ainda não testados, a hipótese é a de que a extensão da colonização endofítica deve correlacionar-se positivamente com o grau de resistência mediada endófita. Um próximo passo natural após o refino métodos de inoculação, portanto, poderia ser a de examinar essa correlação. Vários protocolos de vídeo pode ajudar os pesquisadores a desenvolver um ensaio de resistência adequada para uma praga ou patógeno alvo 29-31. Em última análise, este ensaio é o que vai determinar o sucesso da inóculosmétodo ção, e do potencial para o controle biológico associado endofítica.

Entomopatógenos fungos são importantes reguladores das populações de insetos com potencial considerável como mycopesticides 1. Apenas recentemente, contudo, tem sido mostrado por fungos entomopatógenos a ocorrer como endófitos, ambos naturalmente e, em resposta a vários métodos de inoculação 2. A função ecológica da endofíticas entomopatógenos fúngicas permanece em grande parte desconhecida, mas alguns estudos têm implicado los no crescimento de plantas 3,4, resistência herbívoro 5-8, e resistência a doenças 9,10. O objetivo geral dos métodos apresentados aqui é a introdução de um entomopatógeno fungos como um endófito, em preparação para avaliações subseqüentes de controle biológico endofítica. Beauveria bassiana (Balsamo) Vullemin (Ascomycota: Hypocreales) é a mais estudada entomopatógeno fúngica endofítica 5-9,11-19, e está disponível como uma mycopesticide comercial. Métodos de inoculação testados para estabelecer <em&gt; B. bassiana como um endófito incluem poções solo 14,17, revestimentos de sementes 18 e 14 imersões, curativos radícula 13,15, de raiz e imersões rizoma, caule 11,16,18 injeções 17, pulverizações foliares 14,17,20 e sprays de flores 19. Utilizando estes métodos, os investigadores introduziram B. bassiana em 11 de banana, feijão 7, 13 cacau, café, 17, 7 milho, algodão 7, tamareira 12, juta 21, 20 papoula, abóbora 7, pinheiros radiata 18, 14 de sorgo, tomate e trigo 7 7. Evidências recentes sugerem que B. endofítica bassiana tem o potencial para proteger as plantas, não só a partir de pestes artrópodes 5-7,22-27, mas também de alguns agentes patogénicos de plantas 9. O feijão comum (Phaseolus vulgaris L.) está entre as culturas mais vulneráveis ​​a pragase doenças. Ele pode ser afetada por mais de 400 pragas e patógenos 200, cujo ataque é pensado para ser o fator mais limitante da produção de feijão em todas as regiões 28. Por conseguinte, o feijão comum pode ser uma colheita excelente modelo para estudar o espectro de controlo biológico endofítica por B. bassiana. Como um primeiro passo nesta direção, este artigo descreve pulverizações foliares e poções do solo como métodos de inoculação para introduzir B.bassiana como um endófito em feijoeiro.

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;REAGENTS&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Name of Reagent/Material</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td></td></tr><tr><td>Mycotrol SE </td><td>Laverlam</td><td>4167</td><td></td></tr><tr><td>Noble agar</td><td>Sigma</td><td>A5431-250G</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin G sodium salt</td><td>Sigma</td><td>P3032-25MU</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish (100 x 15 mm)</td><td>Fisher</td><td>08-757-12</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish (60 x 15 mm)</td><td>Fisher</td><td>08-757-13A</td><td></td></tr><tr><td>Potato dextrose agar</td><td>Difco</td><td>213400</td><td></td></tr><tr><td>Regular bleach (NaOCl)</td><td>CLOROX</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Streptomycin sulfate salt</td><td>Sigma</td><td>S6501-25G</td><td></td></tr><tr><td>Tetracycline</td><td>Sigma</td><td>T3258-25G</td><td></td></tr><tr><td>Triple quince (NPK)</td><td>ABOCOL</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X-100</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;EQUIPMENT&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Biological safety cabinet</td><td>NuAire</td><td>NU-425-600</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>Fisher</td><td>02-671-10</td><td></td></tr><tr><td>Leica DM LB microscope</td><td>Leica</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

establishing fungal entomopathogens as endophytes: towards endophytic biological control

Beauveria bassiana é um entomopatógeno fúngico com a capacidade de colonizar plantas endofíticamente. Como um endófito, B. bassiana podem desempenhar um papel na protecção de plantas a partir de herbivoria e doença. Este protocolo demonstra dois métodos de inoculação para estabelecer B. bassiana endofíticamente no feijão comum (Phaseolus vulgaris), em preparação para avaliações subseqüentes de controle biológico endofítica. As plantas são cultivadas a partir de sementes esterilizadas na superfície, durante duas semanas antes de receberem a B. bassiana tratamento de 10 8 conídios / ml (ou água) aplicado quer como uma pulverização foliar ou uma rega do solo. Duas semanas depois, as plantas são colhidas e suas folhas, caules e raízes são colhidas amostras para avaliar a colonização de fungos endofíticos. Para isso, as amostras foram individualmente superfície esterilizada, cortadas em secções múltiplas, e incubados em meio de batata dextrose ágar durante 20 dias. A mídia é inspecionado a cada 2-3 dias para observar o crescimento de fungos comoassociada com seções de plantas e registrar a ocorrência de B. bassiana para estimar a extensão da sua colonização endofítica. As análises de sucesso inoculação comparar a ocorrência de B. bassiana dentro de uma parte determinada planta (folhas, caules ou seja, ou raízes) entre os tratamentos e controles. Para além do método de inoculação, o resultado específico da experiência pode depender da espécie alvo ou variedade de culturas, as espécies de fungos entomopatógenos estirpe ou isolar utilizado, e as condições de crescimento da planta.

B. bassiana foi capaz de colonizar endofíticamente-p vulgaris, em resposta aos tratamentos com inoculação demonstrado (Figura 1). Ambas as pulverizações foliares e de solo poções resultou na colonização endofítica por B. bassiana, em mais de 80% das plantas tratadas (Figura 2). No entanto, a extensão da colonização depende da parte da planta avaliada eo método de inoculação utilizado. Folhas respondem melhor a inoculações de pulverização. Raízes, por outro lado, respondeu apenas a inoculações rega. Finalmente, caules responderam de forma semelhante para ambos os métodos de inoculação. B. bassiana não foi detectada em qualquer uma das secções de controlo de plantas. Independente do tratamento, outros endófitos que B. bassiana cresceu de 15% das secções de plantas avaliadas, mas eles foram dissecados a partir de placas de meios antes que pudessem invadir secções vizinhas e influenciar os resultados. Estações de tratamento e controle foram visivelmente indistinguíveis duas semanas após a inoculação. Não foram detectadas diferenças em seu peso seco e na sua altura. <img src="/files/ftp_upload/50360/50360fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Os resultados representativos de inoculação sobre a colonização endofítica de plantas de feijão (Phaseolus vulgaris cv Calima.) Por Beauveria bassiana superior esquerdo:. Controle de placas com nenhum crescimento. Superior direito: endófito fúngica de uma seção planta contaminando placa inteira. Canto inferior esquerdo: B. bassiana crescente a partir de duas partes da instalação. Inferior direito: endofítico B. bassiana e conidióforos como visto sob um microscópio. <img src="/files/ftp_upload/50360/50360fig2.jpg" alt="Figura 2" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50360/50360fig2highres.jpg"/> Figura 2. Efeito da inoculação na colonização endofítica de beaplantas n (Phaseolus vulgaris cv. Calima) por Beauveria bassiana, duas semanas após a inoculação com a estirpe. GHA colonização por cento representa o número de secções de plantas colonizadas, dividido pelo número de secções de cultura.

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Establishing Fungal Entomopathogens as Endophytes: Towards Endophytic Biological Control

Este protocolo demonstra dois métodos de inoculação de introduzir o entomopatógeno fungos<em&gt; Beauveria bassiana</em&gt; Como um endófito em feijoeiro (<em&gt; Phaseolus vulgaris</em&gt;), Em preparação para avaliações subseqüentes de controle biológico endofítica.

Estabelecer Entomopatógenos fúngicas como endófitos: Rumo Controle Biológico endofítico

 Beauveria bassiana is a fungal entomopathogen with the ability to colonize plants endophytically. As an endophyte, B. bassiana may play a role in ...

establishing-fungal-entomopathogens-as-endophytes-towards-endophytic

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Bioengineering

34.5K visualizações.  International Center for Tropical Agriculture (CIAT), Cali, Colombia. Este protocolo demonstra dois métodos de inoculação de introduzir o entomopatógeno fungos Beauveria bassiana Como um endófito em feijoeiro ( Phaseolus vulgaris), Em preparação para avaliações subseqüentes de controle biológico endofítica.

Vídeo: Establishing Fungal Entomopathogens as Endophytes: Towards Endophytic Biological Control

Engineering Biological-Based Vascular Grafts Using a Pulsatile Bioreactor

Much effort has been devoted to develop and advance the methodology to regenerate functional small-diameter arterial bypasses. In the physiological environment, both mechanical and chemical stimulation are required to maintain the proper development and functionality of arterial vessels1,2.
Bioreactor culture systems developed by our group are designed to support vessel regeneration within a precisely controlled chemo-mechanical environment mimicking that of native vessels. Our bioreactor assembly and maintenance procedures are fairly simple and highly repeatable3,4. Smooth muscle cells (SMCs) are seeded onto a tubular polyglycolic acid (PGA) mesh that is threaded over compliant silicone tubing and cultured in the bioreactor with or without pulsatile stimulation for up to 12 weeks. There are four main attributes that distinguish our bioreactor from some predecessors. 1) Unlike other culture systems that simulate only the biochemical surrounding of native blood vessels, our bioreactor also creates a physiological pulsatile environment by applying cyclic radial strain to the vessels in culture. 2) Multiple engineered vessels can be cultured simultaneously under different mechanical conditions within a controlled chemical environment. 3) The bioreactor allows a mono layer of endothelial cells (EC) to be easily coated onto the luminal side of engineered vessels for animal implantation models. 4) Our bioreactor can also culture engineered vessels with different diameter size ranged from 1 mm to 3 mm, saving the effort to tailor each individual bioreactor to fit a specific diameter size. 
The engineered vessels cultured in our bioreactor resemble native blood vessels histologically to some degree. Cells in the vessel walls express mature SMC contractile markers such as smooth muscle myosin heavy chain (SMMHC)3. A substantial amount of collagen is deposited within the extracellular matrix, which is responsible for ultimate mechanical strength of the engineered vessels5. Biochemical analysis also indicates that collagen content of engineered vessels is comparable to that of native arteries6. Importantly, the pulsatile bioreactor has consistently regenerated vessels that exhibit mechanical properties that permit successful implantation experiments in animal models3,7. Additionally, this bioreactor can be further modified to allow real-time assessment and tracking of collagen remodeling over time, non-invasively, using a non-linear optical microscopy (NLOM)8. To conclude, this bioreactor should serve as an excellent platform to study the fundamental mechanisms that regulate the regeneration of functional small-diameter vascular grafts.

Our group has developed a bioreactor culture system that mimics the physiological pulsatile stresses of the cardiovascular system to regenerate implantable small-diameter vascular grafts.

Engenharia Biológica Baseado em enxertos vasculares Usando um biorreator pulsátil

Much effort has been devoted to develop and advance the methodology to regenerate functional small-diameter arterial bypasses. In the physiological ...

Bioengenharia

Development of Metarhizium anisopliae as a Mycoinsecticide: From Isolation to Field Performance

A major concern when developing commercial mycoinsecticides is the kill speed compared to that of chemical insecticides. Therefore, isolation and screening for the selection of a fast-acting, highly virulent entomopathogenic fungus are important steps. Entomopathogenic fungi, such as Metarhizium, Beauveria, and Nomurea, which act by contact, are better suited than Bacillus thuringiensis or nucleopolyhedrosis virus (NPV), which must be ingested by the insect pest. In the present work, we isolated 68 Metarhizium strains from infected insects using a soil dilution and bait method. The isolates were identified by the amplification and sequencing of the ITS1-5.8S-ITS2 and 26S rDNA region. The most virulent strain of Metarhizium anisopliae was selected based on the median lethal concentration (LC50) and time (LT50) obtained in insect bioassays against III-instar larvae of Helicoverpa armigera. The mass production of spores by the selected strain was carried out with solid-state fermentation (SSF) using rice as a substrate for 14 days. Spores were extracted from the sporulated biomass using 0.1% tween-80, and different formulations of the spores were prepared. Field trials of the formulations for the control of an H. armigera infestation in pigeon peas were carried out by randomized block design. The infestation control levels obtained with oil and aqueous formulations (78.0% and 70.9%, respectively) were better than the 63.4% obtained with chemical pesticide.

Development of Metarhizium anisopliae as a Mycoinsecticide: From Isolation to Field Performance

Here, we report the different stages involved in the knowledge-based development of an effective mycoinsecticide, including the isolation, identification, screening, and selection of the "best-fit" entomopathogenic fungus, Metarhizium anisopliae, for the control of insect pests in agriculture.

Desenvolvimento de<em&gt; Metarhizium anisopliae</em&gt; Como um Mycoinsecticide: do isolamento ao desempenho do campo

A major concern when developing commercial mycoinsecticides is the kill speed compared to that of chemical insecticides. Therefore, isolation and ...

Ambiente

Microfluidic Tools for Probing Fungal-Microbial Interactions at the Cellular Level

Filamentous fungi are successful inhabitants of soil and play a major role in soil ecosystems, such as in the decomposition of organic and inorganic matter, as well as regulation of nutrient levels. There they also find numerous opportunities to interact with a variety of other microbes such as bacteria or other fungi. Studying fungal interactions at the cellular level, however, can be challenging owing to the black box-like nature of soil. New microfluidic tools are being developed for the study of fungal interactions; two platforms designed to study bacterial-fungal and fungal-fungal interactions are highlighted. Within these microchannels, fungal-microbial interactions can be monitored in controlled physico-chemical environments at higher temporal and spatial resolution than previously possible. Application of these tools have yielded numerous novel biological insights, such as the observation of bacterial polar attachment to hyphae or revealing uncharacterised fungal-fungal antagonisms. A key feature of these methodologies regards the ease of use of this tool by non-experts, yielding highly translatable technologies for use in microbiology labs.

Owing to the opacity of soil, interactions between its constituent microbes cannot easily be visualised with cellular resolution. Here, two microfluidic tools are presented, which offer new opportunities for investigating fungal-microbial interactions. The devices are versatile and simple to use, enabling high spatiotemporal control and high-resolution imaging at the cellular level.

Ferramentas microfluídicas para sondar interações fúngicas-microbianas no nível celular

Filamentous fungi are successful inhabitants of soil and play a major role in soil ecosystems, such as in the decomposition of organic and inorganic ...

Culturing and Genetically Manipulating Entomopathogenic Nematodes

Entomopathogenic nematodes in the genera Heterorhabditis and Steinernema are obligate parasites of insects that live in the soil. The main characteristic of their life cycle is the mutualistic association with the bacteria Photorhabdus and Xenorhabdus, respectively. The nematode parasites are able to locate and enter suitable insect hosts, subvert the insect immune response, and multiply efficiently to produce the next generation that will actively hunt new insect prey to infect. Due to the properties of their life cycle, entomopathogenic nematodes are popular biological control agents, which are used in combination with insecticides to control destructive agricultural insect pests. Simultaneously, these parasitic nematodes represent a research tool to analyze nematode pathogenicity and host anti-nematode responses. This research is aided by the recent development of genetic techniques and transcriptomic approaches for understanding the role of nematode secreted molecules during infection. Here, a detailed protocol on maintaining entomopathogenic nematodes and using a gene knockdown procedure is provided. These methodologies further promote the functional characterization of entomopathogenic nematode infection factors.

Entomopathogenic nematodes live in symbiosis with bacteria and together they successfully infect insects by undermining their innate immune system. To promote research on the genetic basis of nematode infection, methods for maintaining and genetically manipulating entomopathogenic nematodes are described.

Culturing e Geneticamente Manipulação Nematodes Entomopatômicos

Entomopathogenic nematodes in the genera Heterorhabditis and Steinernema are obligate parasites of insects that live in the soil. The main characteristic ...

Imunologia e Infecção

Isolation and Selection of Entomopathogenic Fungi from Soil Samples and Evaluation of Fungal Virulence against Insect Pests

Entomopathogenic fungi (EPF) are one of the microbial control agents for integrated pest management. To control local or invasive pests, it is important to isolate and select indigenous EPF. Therefore, the soil bait method combined with the insect bait (mealworm, Tenebrio molitor) system was used in this study with some modifications. The isolated EPF were then subjected to the virulence test against the agricultural pest Spodoptera litura. Furthermore, the potential EPF strains were subjected to morphological and molecular identifications. In addition, the conidia production and thermotolerance assay were performed for the promising EPF strains and compared; these data were further substituted into the formula of effective conidia number (ECN) for laboratory ranking. The soil bait-mealworm system and the ECN formula can be improved by replacing insect species and integrating more stress factors for the evaluation of commercialization and field application. This protocol provides a quick and efficient approach for EPF selection and will improve the research on biological control agents.

Here we present a protocol based on the&#160;mealworm (Tenebrio molitor)-bait system that was used for isolating and selecting entomopathogenic fungi (EPF) from soil samples. An effective conidia number (ECN) formula is used to select high stress tolerant EPF based on physiological characteristics for pest microbial control in the field.

Isolamento e Seleção de Fungos Entomopatômicos de Amostras de Solo e Avaliação da Virulência Fúngica contra Pragas de Insetos

Entomopathogenic fungi (EPF) are one of the microbial control agents for integrated pest management. To control local or invasive pests, it is important ...

Biologia

Mass Production of Entomopathogenic Fungi, Metarhizium robertsii and Metarhizium pinghaense, for Commercial Application Against Insect Pests

Entomopathogenic fungi of the Metarhizium anisopliae species complex have gained importance as the biological control agents of agricultural insect pests. The increase in pest resistance to chemical insecticides, the growing concerns regarding the negative effects of insecticides on human health, and the environmental pollution from pesticides have led to a global drive to find novel sustainable strategies for crop protection and pest control. Previously, attempts to mass culture such entomopathogenic fungi (EPF) species as Beauveria bassiana have been conducted. However, only limited attempts have been conducted to mass culture Metarhizium robertsii and M. pinghaense for use against insect pests. This study aimed to mass-produce a sufficient number of resilient infective propagules of South African isolates of M. robertsii and M. pinghaense for commercial application. Three agricultural grain products, flaked oats, flaked barley, and rice, were used as the EPF solid fermentation substrates. Two inoculation methods, conidial suspensions and the liquid fungal culture of blastospores were used to inoculate the solid substrates. Inoculation using conidial suspensions was observed to be relatively less effective, as increased levels of contamination were observed on the solid substrates relative to when using the blastospore inoculation method. Flaked oats were found not to be a suitable growth substrate for both M. robertsii and M. pinghaense, as no dry conidia were harvested from the substrate. Flaked barley was found to favor the production of M. robertsii conidia over that of M. pinghaense, and an average of 1.83 g &plusmn; 1.47 g of dry M. robertsii conidia and zero grams of M. pinghaense conidia was harvested from the substrate. Rice grains were found to favor the conidial mass production of both M. pinghaense and M. robertsii isolates, with an average of 8.2 g &plusmn; 4.38 g and 6 g &plusmn; 2 g harvested from the substrate, respectively.

Mass Production of Entomopathogenic Fungi, Metarhizium robertsii and Metarhizium pinghaense, for Commercial Application Against Insect Pests

Entomopathogenic fungi have gained importance as the biological control agents of agricultural insect pests. In this study, the mass production of a sufficient number of resilient infective propagules of South African isolates of both Metarhizium robertsii and M. pinghaense for commercial application against insect pests was successfully conducted using agricultural grain products.

Produção em massa de Fungos Entomopatômicos, Metarhizium robertsii e Metarhizium pinghaense, para Aplicação Comercial Contra Pragas de Insetos

Entomopathogenic fungi of the Metarhizium anisopliae species complex have gained importance as the biological control agents of agricultural insect pests. ...

Comparison of Methods for Isolating Entomopathogenic Fungi from Soil Samples

The goal of the present study is to compare the effectiveness of using insect baits versus artificial selective medium for isolating entomopathogenic fungi (EPF) from soil samples. The soil is a rich habitat for microorganisms, including EPF particularly belonging to the genera Metarhizium and Beauveria, which can regulate arthropod pests. Biological products based on fungi are available in the market mainly for agricultural arthropod pest control. Nevertheless, despite the high endemic biodiversity, only a few strains are used in commercial bioproducts worldwide. In the present study, 524 soil samples were cultured on potato dextrose agar enriched with yeast extract supplemented with chloramphenicol, thiabendazole, and cycloheximide (CTC medium). The growth of fungal colonies was observed for 3 weeks. All Metarhizium and Beauveria EPF were morphologically identified at the genus level. Additionally, some isolates were molecularly identified at the species level. Twenty-four out of these 524 soil samples were also surveyed for EPF occurrence using the insect bait method (Galleria mellonella and Tenebrio molitor). A total of 51 EPF strains were isolated (41 Metarhizium spp. and 10 Beauveria spp.) from the 524 soil samples. All fungal strains were isolated either from croplands or grasslands. Of the 24 samples selected for comparison, 91.7% were positive for EPF using Galleria bait, 62.5% using Tenebrio bait, and 41.7% using CTC. Our results suggested that using insect baits to isolate the EPF from the soil is more efficient than using the CTC medium. The comparison of isolation methods in addition to the identification and conservation of EPF has a positive impact on the knowledge about biodiversity. The improvement of EPF collection supports scientific development and technological innovation.

Entomopathogenic fungal colonies are isolated from tropical soil samples using Tenebrio bait, Galleria bait, as well as selective artificial medium, i.e., potato dextrose agar enriched with yeast extract supplemented with chloramphenicol, thiabendazole, and cycloheximide (CTC medium).

Comparação de métodos para isolar fungos entomopatômicos de amostras de solo

The goal of the present study is to compare the effectiveness of using insect baits versus artificial selective medium for isolating entomopathogenic ...

Isolation, Characterization, and Total DNA Extraction to Identify Endophytic Fungi in Mycoheterotrophic Plants

Mycoheterotrophic plants present one of the most extreme forms of mycorrhizal dependency, having totally lost their autotrophic capacity. As essential as any other vital resource, the fungi with which these plants intimately associate are essential for them. Hence, some of the most relevant techniques in studying mycoheterotrophic species are the ones that enable the investigation of associated fungi, especially those inhabiting roots and subterranean organs. In this context, techniques for identifying culture-dependent and culture-independent endophytic fungi are commonly applied. Isolating fungal endophytes provides a means for morphologically identifying them, analyzing their diversity, and maintaining inocula for applications in the symbiotic germination of orchid seeds. However, it is known that there is a large variety of non-culturable fungi inhabiting plant tissues. Thus, culture-independent molecular identification techniques offer a broader cover of species diversity and abundance. This article aims to provide the methodological support necessary for starting two investigation procedures: a culture-dependent and an independent one. Regarding the culture-dependent protocol, the processes of collecting and maintaining plant samples from collection sites to laboratory facilities are detailed, along with isolating filamentous fungi from subterranean and aerial organs of mycoheterotrophic plants, keeping a collection of isolates, morphologically characterizing hyphae by slide culture methodology, and molecular identification of fungi by total DNA extraction. Encompassing culture-independent methodologies, the detailed procedures include collecting plant samples for metagenomic analyses and total DNA extraction from achlorophyllous plant organs using a commercial kit. Finally, continuity protocols (e.g., polymerase chain reaction [PCR], sequencing) are also suggested for analyses, and techniques are presented here.

The current article aims to provide detailed and adequate protocols for the isolation of plant-associated endophytic fungi, long-term preservation of isolates, morphological characterization, and total DNA extraction for subsequent molecular identification and metagenomic analyses.

Isolamento, caracterização e extração de DNA total para identificação de fungos endofíticos em plantas micoheterotróficas

Mycoheterotrophic plants present one of the most extreme forms of mycorrhizal dependency, having totally lost their autotrophic capacity. As essential as ...

Bioensaio otimizado para fungos entomopatogênicos contra pulgão mostarda

Assessment of Aphidicidal Effect of Entomopathogenic Fungi against Parthenogenetic Insect, Mustard Aphid, Lipaphis erysimi (Kalt.)

The mustard aphid (L. erysimi) is a pest that infests various cruciferous crops and transmits plant viruses. To achieve eco-friendly pest management, entomopathogenic fungi (EPF) are potential microbial control agents for controlling this pest. Therefore, virulence screening of EPF isolates under Petri dish conditions is necessary before field application. However, the mustard aphid is a parthenogenetic insect, making it difficult to record data during Petri dish experiments. A modified system for detached-leaf bioassays was developed to address this issue, using a micro-sprayer to inoculate conidia onto aphids and prevent drowning by facilitating air-drying after spore suspension. The system maintained high relative humidity throughout the observation period, and the leaf disc remained fresh for over ten days, allowing parthenogenetic reproduction of the aphids. To prevent offspring buildup, a process of daily removal using a painting brush was implemented. This protocol demonstrates a stable system for evaluating the virulence of EPF isolates against mustard aphids or other aphids, enabling the selection of potential isolates for aphid control.

Autor em destaque: manejo ecológico de pragas usando fungos entomopatogênicos contra pulgões da mostarda 

This protocol presents an optimized detached-leaf bioassay system for evaluating the effectiveness of entomopathogenic fungi (EPF) against the mustard aphid (Lipaphis erysimi (Kalt.)), a parthenogenetic insect. The method outlines the data collection process during Petri dish experiments, enabling researchers to consistently measure the virulence of EPF against mustard aphids and other parthenogenetic insects.

Avaliação do Efeito Afidicida de Fungos Entomopatogênicos Contra Insetos Partenogenéticos, Pulgão Mostarda, Lipaphis erysimi (Kalt.)

The mustard aphid (L. erysimi) is a pest that infests various cruciferous crops and transmits plant viruses. To achieve eco-friendly pest management, ...

Estabelecer Entomopatógenos fúngicas como endófitos: Rumo Controle Biológico endofítico

Resumo

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Capítulos neste vídeo

Engenharia Biológica Baseado em enxertos vasculares Usando um biorreator pulsátil

Desenvolvimento de

Ferramentas microfluídicas para sondar interações fúngicas-microbianas no nível celular

Culturing e Geneticamente Manipulação Nematodes Entomopatômicos

Isolamento e Seleção de Fungos Entomopatômicos de Amostras de Solo e Avaliação da Virulência Fúngica contra Pragas de Insetos

Produção em massa de Fungos Entomopatômicos, Metarhizium robertsii e Metarhizium pinghaense, para Aplicação Comercial Contra Pragas de Insetos

Comparação de métodos para isolar fungos entomopatômicos de amostras de solo

Isolamento, caracterização e extração de DNA total para identificação de fungos endofíticos em plantas micoheterotróficas

Avaliação do Efeito Afidicida de Fungos Entomopatogênicos Contra Insetos Partenogenéticos, Pulgão Mostarda, Lipaphis erysimi (Kalt.)

Avaliação do Efeito Afidicida de Fungos Entomopatogênicos Contra Insetos Partenogenéticos, Pulgão Mostarda, Lipaphis erysimi (Kalt.)