Este trabalho foi apoiado pela &quot;Agence Nationale de la Recherche&quot; conceder ANR-09-JCJC-0117-01 e &quot;Neuropôle de Recherche Francilien-NERF&quot; subvenção para Romain Chery. Agradecemos a Françoise Lefebvre para o desenvolvimento de software em C + + / Qt, e Laurent e Pinot Batiste Janvier para ajudar no desenvolvimento da configuração da imagem óptica.

1. Preparar o animal para geração de imagens (de acordo com recomendações europeias para o cuidado e uso de animais de laboratório, a Directiva 86/609/CEE) <ol><li> 6 a 8 semanas de idade C57BL6 camundongos machos são anestesiados com uma mistura de quetamina (10mg/kg) e xilazina (100mg/kg) injetados intraperitonealmente. Cirurgia começa quando o mouse não responde mais à pata traseira pinch. Durante todo o experimento o animal é colocado em uma almofada de aquecimento. Temperatura do corpo é continuamente monitorizada e mantida a 37 ° C. Profundidade da anestesia é mantida durante toda a cirurgia e sessões de imagens por verificar a ausência de membro se retirar. A injecção subcutânea de 20% do cocktail anestésico inicial é administrados por outra via. </li><li> Usando clippers, remover os pêlos do couro cabeludo. Limpe a pele exposta do cabelo residual usando gaze estéril embebida em soro fisiológico. </li><li> Posicione o mouse no quadro estereotáxico. O focinho tem de ser no mesmo plano que a parte de trás da cabeça,, a fim de definir a superfície do bulbo olfativo com a horizontal. Segura firmemente ouvido do nariz e bares, a fim de impedir os movimentos durante o exame. </li><li> Aplicar pomada oftálmica nos olhos do animal para evitar a secagem e dor. </li><li> Desinfectar todos os instrumentos cirúrgicos com etanol 70 ° e na área do couro cabeludo com varreduras sucessivas de betadine. </li><li> Para remover a pele que cobre o crânio, começar por fazer uma incisão na pele com uma tesoura na parte de trás da cabeça entre as orelhas. Em seguida, corte em ambos os lados em direção à base da orelha e no sentido ântero-posterior para a testa ao longo das pálpebras. Terminar de remover o couro cabeludo, cortando a pele em cima do focinho perto do bar nariz. </li><li> Sob observação binocular, use um cotonete embebido em soro fisiológico para retirar delicadamente o periósteo na parte superior do crânio. Use uma pinça para remover o tecido remanescente e raspe a superfície do crânio com um bisturi para ter uma preparação limpo. </li><li>O OB é uma estrutura simétrica composta de duas hemibulbs que estão localizados entre as pálpebras. Eles são limitados no rostral e na direção caudal por um seio venoso, e separados pela sutura sagital. Coloque um pedaço de esponja de gelatina absorvível embebida com água destilada no osso acima do OB. É importante manter esta área do osso úmido durante todo o experimento. </li></ol> 2. Preparando a janela craniana <ol><li> Retire a esponja de gelatina e começar por delicadamente raspando o osso com n ° 10 lâmina de bisturi. Mantenha um ângulo constante de 45 ° entre a lâmina eo osso, e mova a lâmina do pálpebras para o lado sagital da área do bulbo. Não aplique pressão vertical sobre o osso ou arranhar o osso acima do seio venoso. </li><li> Durante o processo de desbaste, parar a cada 5min e coloque uma esponja de gelatina hidratada no osso para esfriar a preparação. Swab do crânio com a esponja para remover o pó de osso. </li><li> Manter varrição erefrigeração alternadamente até visualizar as trabéculas, a camada de osso esponjoso. A vasculatura fina do OB deve ser visível nesta fase. Parar de coçar o osso, e começar a usar a ponta do bisturi de forma perpendicular para &quot;desenhar&quot; uma área retangular que envolve o OB. Nesta fase n ° 11 lâmina de bisturi pode ser usado. Mantenha a cirurgia dentro dos limites dos seios venosos que deve ser segura de qualquer curso bisturi. </li><li> Dig gradualmente a vala formada retangular usando movimentos sucessivos do bisturi. Limpe a ponta do bisturi periodicamente para limpá-lo e mantê-la afiada. Ser mais cautelosos da profundidade da ponta para evitar tocar na superfície dura. </li><li> A fim de obter uma idéia da espessura do osso remanescente, empurre-o suavemente com a ponta de um par de fórceps. Se as dobras retalho ósseo sob pressão, passar para a próxima etapa. </li><li> De acordo com uma gota de solução salina, use a ponta do bisturi orientados horizontalmente para levantar o retalho ósseo. A remoção do retalho tem que ser feito carefully para evitar arrancando o osso remanescente. </li><li> Uma vez que a superfície da OB é exposta, verificar a ausência de qualquer hemorragia ou anastomose dos vasos sanguíneos. Ferindo a dura ou a superfície do tecido irá reduzir as chances de obtenção de sinais ópticos. Limpe a área com uma esponja de gelatina embebida em solução salina, a fim de manter a umidade do bulbo. </li><li> Aplicar cimento dental poliacrilato para formar um bem sobre o osso ao redor da janela. </li><li> Coloque uma gota de baixo ponto de fusão de agarose (1,2%) sobre a dura-máter, e colocar uma tampa de vidro estéreis as dimensões da janela. Durante a sessão de imagens, uma pequena quantidade de agarose podem ser adicionados a fim de compensar a desidratação. Agarose impedirá que o OB do movimento com a respiração e irá proporcionar uma superfície plana para imagem óptica. </li></ol> 3. Configuração de imagem óptica para o mapeamento de atividade olfativa <ol><li> A estimulação olfativa deve ser definido com precisão no tempo e intensidade do uso de um olfatômetro. Usamos uma versão personalizada modificada do sistema de perfusão multivial Valvebank 8II de Automatize Científica associada a um compressor de ar básico (ar comprimido respirável seria adequado também). Este sistema permite o controle preciso da válvula, e rápido externo. Soluções de odores puros são diluídos em óleo mineral na concentração escolhida. Para ativar os aldeídos dorsal OB, como hexanal são comumente usados. Um volume preciso da odorant diluída (20 a 50μl) é carregado em um filtro de papel e colocados em um reservatório da seringa. Através do sistema de perfusão, pressão de ar controlada é entregue ao sistema, garantindo uma taxa constante de odorizado entrega fluxo de ar para o nariz de animais durante a abertura da válvula. Odorante é entregue através de uma tubulação de Tygon R-3603 de vácuo (Saint-Gobain Corporation) transportando ar a uma taxa de fluxo de ~ 1000ml/min. Evitar a contaminação entre odores e quantidades residuais de odores na tubulação. Se disponível, a reprodutibilidade do estímulo odorante pode ser controlled através do uso de um detector de ionização de chama (microFID Photovac 2020). </li><li> A configuração óptica está ligado. Ele consiste de um resfriado entrelaçado 12 bits câmera CCD (ORCA AG Hamamatsu) associado com um estereomicroscópio de fluorescência (Leica MZ16), um olfatômetro controlado por computador e lâmpadas de excitação estabilizado com filtros de interferência apropriado bandpass. Um esquema que descreve a nossa configuração é fornecido na figura 2. Intrínseca para sinais ópticos Imaging (IOSI), uma lâmpada halógena de 200W de tungstênio (QTH Oriel) acoplado com uma luz anel de fibra (Schott) conectado em torno da objetiva do microscópio são usados ​​para fornecer iluminação estável e uniforme. Para flavoproteína autofluorescência Sinais Imaging (FASI), uma lâmpada de 150W de metal Halide (Leica), com uma guia de luz 5 milímetros núcleo líquido fornecer mesmo excitação localizada da fluorescência através da porta de epi-iluminação do estereomicroscópio. Aquisição de imagens e sincronização de hardware são realizados por software personalizado. A s abertasource micromanager software também pode ser usado para controlar a configuração óptica e aquisição. </li></ol> 4. Imagem óptica <ol><li> Coloque o quadro estereotáxico sob o estereomicroscópio, a janela craniana centrado no campo de visão (ver fig. 2A para um esquema da configuração óptica). </li><li> Sintonize o microscópio para se concentrar nos capilares. Antes de ensaios estímulo (ver descrição em 5) uma imagem da lâmpada é tomada sob a luz 560nm (verde) (anel de fibra), que fornece um bom contraste para imagens de vasos sanguíneos. Esta imagem é usado como um controle anatômica para verificar o estado da preparação e é adquirido várias vezes durante o experimento. </li><li> Para IOS imagem, refletida intensidade da luz é gravado pela câmera CCD em 630 + / -10 nm (vermelho) de iluminação. As imagens são adquiridas em full frame (sem binning) a 5 quadros por segundo que correspondem a um tempo de exposição de cerca de 150ms. Potência da fonte de luz é ajustado para re<html> níveis ach cinza de pelo menos ~ 3000 na área de OB, perto da saturação dos pixels CCD poços. Se o fizer, torna possível para aproveitar a dinâmica 12bits do CCD para capturar alterações de intensidade leve durante a ativação. IOS máximo amplitudes chegar ~ 1%. </li><li> FAS para imagens de fluorescência é adquirido sob excitação de 480nm + /-20nm de luz (azul) epiflurorescence. Um filtro passa-alta em 515nm é configurado para capturar a luz. As imagens são adquiridas em 5 quadros por segundo com um binning de 4 por 4 a maximizar a sensibilidade. Poder de luz de excitação é ajustada de forma semelhante ao IOS com níveis de cinza de 3000 na área de OB. Máxima FAS amplitudes chegar ~ 3%. Para ambas as modalidades de imagem, a profundidade de campo no plano do assunto é o mesmo e foi medido em 0,5 mm para uma ampliação de cerca de 4 vezes. </li><li> Luz devem ser desligados entre ensaios imagem para evitar aquecimento e fotodegradação da preparação. </li></ol>le &quot;&gt; 5. Imagem ensaios <ol><li> Sessão de imagem padrão incluía uma base de 5 a 10s onde o ar só é entregue, seguido pela estimulação odor por 3 a 10s, dependendo da concentração odor escolhido, e 70 a 82s são ainda gravado com um fluxo de ar constante para a recuperação de base (Fig. 2A). No final do julgamento, a luz é desligada e ar puro é entregue durante o período inter julgamento intervalo (1-3 minutos) para lavar as moléculas de odor residual e evitar a habituação sensorial. Odor ensaios foram intercaladas com ensaios em branco (entrega de ar). </li><li> Odor-evoked zonas ativadas são visualizadas como áreas aproximadamente esférica nos mapas e correspondem ao tamanho dos glomérulos individuais (80 a 200μm de diâmetro 9). Processamento de imagens é explicada na Figura 2B. Mapas olfactivos são apresentados na Figura 3. Ao contrário do que qualquer outro sistema sensorial, a relação sinal-ruído na OB foi suficiente para resolver odor evocadas respostas em testes simples (Fig. 3B para IOS e Figo. 3D para FAS). </li><li> Os ratos são sacrificados imediatamente no final da sessão de imagem usando métodos de acordo com recomendações europeias para o cuidado e uso de animais de laboratório. </li></ol> 6. Resultados representante (ver mapas olfactivos na figura 3): <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3336/3336fig1.jpg" /> Figura 1 Organização estrutural do bulbo olfatório em roedores. Neurônios sensoriais olfativos primários, células sensoriais localizadas no epitélio olfatório, expressam o receptor de odorante mesmo e convergem para a mesma glomérulos no OB. Glomérulos olfativos, o neuropils de forma arredondada (círculos tracejada), estão localizados na superfície do OB. Note-se que uma rede muito densa e complexa vascular está presente ao nível glomerular. Abreviações (em cima / para baixo): ONL: camada nervo olfatório; GL: camada glomerular, EPL: camada plexiforme externa; MCL:camada de células mitral; GCL: camada de células granulares. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3336/3336fig2.jpg" /> Figura Reflectância 2 e gravação de sinais de fluorescência in vivo. A. Wide-field configuração de imagem óptica. O cérebro de um rato anestesiado é exposto para vermelho (IOS) ou azul (FAS) de luz, quer através de um anel de fibra anular acoplado à lente óptica ou uma porta de epi-iluminação de um microscópio. Odores são carregadas em frascos lacrados e odorizado ar é entregue ao nariz animal (luz verde: válvula aberta). B. Gravação protocolo e processamento de dados. IOS e FAS são registrados como uma série de ensaios individuais (90 de duração). O diagrama mostra a timeline de um julgamento único: linha de base varia de 5 a 10s, a estimulação de 3 a 10s, e retornar ao valor basal de 70 a 82s. Processamento de imagem requer pixel por pixel de subtração de valores de intensidade durante a linha de base para valores de intensidade durante os períodos de estimulação (por FAS) or estimulação mais o retorno à linha de base (para IOS). Esta diferença é então dividido por valores de base para obter uma variação em% (ver imagens resultantes na fig. 3). <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3336/3336fig3.jpg" /> Figura 3 Odor evocadas mapas atividade no OB usando IOS e FAS imagem. A. Vascularização do OB dorsal visualizado sob luz verde. BC. IOS imaged (trial única versus média de três ensaios, respectivamente) para uma apresentação 10s de hexanal 20%. Setas brancas indicam as regiões de interesse esférica ativadas por esse odor. Estes mapas de ativação foram obtidos utilizando os quadros em média durante o primeiro segundo após o término da estimulação odor (máximo de reflectância variação -0,63% em A e -0,52% em B). Nota as zonas negras de absorbância onde a ativação odor ocorreu. CD. FAS adquiridos seqüencialmente no mesmo mouse para o mesmo odor (trial única versus média de três ensaios respectivosly). Estes mapas de ativação foram obtidos utilizando os quadros em média durante o primeiro segundo após o início da estimulação odor (máximo de fluorescência variação 0,72% na D e 0,66% em E). Note-se que as zonas brancas de emissão de autofluorescência indicado por setas pretas correspondem às zonas negras no IOS. O aspecto granulado visto no mapa FAS é devido ao 4 por 4 binning necessários para a melhoria da sensibilidade. FAS imagens não foram corrigidos de autofluorescência de branqueamento. Dimensões reais de imagens BE: 0,7 mm de largura x 1,2 mm de comprimento.

<ol>
	<li>Grinvald, A., Lieke, E., Frostig, R. D., Gilbert, C. D., Wiesel, T. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+architecture+of+cortex+revealed+by+optical+imaging+of+intrinsic+signals.">Functional architecture of cortex revealed by optical imaging of intrinsic signals.</a> Nature. 324, 361-364 (1986).</li><li>Rubin, B. D., Katz, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging+of+odorant+representations+in+the+mammalian+olfactory+bulb.">Optical imaging of odorant representations in the mammalian olfactory bulb.</a> Neuron. 23, 499-511 (1999).</li><li>Chance, B., Cohen, P., J&amp;246, b. s. i. s., &amp;amp, F., Schoener, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+oxidation-reduction+states+in+vivo.">Intracellular oxidation-reduction states in vivo.</a> Science. 137, 499-508 (1962).</li><li>Shibuki, K., Hishida, R., Murakami, H., Kudoh, M., Kawaguchi, T., Watanabe, M., Watanabe, S., Kouuchi, T., Tanaka, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+imaging+of+somatosensory+cortical+activity+in+the+rat+visualized+by+flavoprotein+autofluorescence.">Dynamic imaging of somatosensory cortical activity in the rat visualized by flavoprotein autofluorescence.</a> J. Physiol. 549 (Pt. 3, 919-9127 (2003).</li><li>Uchida, N., Takahashi, Y. K., Tanifuji, M., Mori, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Odor+maps+in+the+mammalian+olfactory+bulb:+domain+organization+and+odorant+structural+features.">Odor maps in the mammalian olfactory bulb: domain organization and odorant structural features.</a> Nat. Neurosci. 3, 1035-1043 (2000).</li><li>Gurden, H., Uchida, N., Mainen, Z. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensory-evoked+intrinsic+optical+signals+in+the+olfactory+bulb+are+coupled+to+glutamate+release+and+uptake.">Sensory-evoked intrinsic optical signals in the olfactory bulb are coupled to glutamate release and uptake.</a> Neuron. 52, 335-345 (2006).</li><li>Soucy, E. R., Albeanu, D. F., Fantana, A. L., Murthy, V. N., Meister, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precision+and+diversity+in+an+odor+map+on+the+olfactory+bulb.">Precision and diversity in an odor map on the olfactory bulb.</a> Nat. Neurosci. 12, 210-220 (2009).</li><li>Frostig, R. D., Lieke, E. E., Ts'o, D. Y., Grinvald, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+functional+architecture+and+local+coupling+between+neuronal+activity+and+the+microcirculation+revealed+by+in+vivo+high-resolution+optical+imaging+of+intrinsic+signals.">Cortical functional architecture and local coupling between neuronal activity and the microcirculation revealed by in vivo high-resolution optical imaging of intrinsic signals.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87, 6082-6086 (1990).</li><li>Meister, M., Bonhoeffer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuning+and+topography+in+an+odor+map+on+the+rat+olfactory+bulb.">Tuning and topography in an odor map on the rat olfactory bulb.</a> J. Neurosci. 21, 1351-1360 (2001).</li><li>Dunn, A. K., Devor, A., Bolay, H., Andermann, M. L., Moskowitz, M. A., Dale, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+imaging+of+total+cerebral+hemoglobin+concentration,+oxygenation,+and+blood+flow+during+functional+activation.">Simultaneous imaging of total cerebral hemoglobin concentration, oxygenation, and blood flow during functional activation.</a> Opt. Lett. 28, 28-30 (2003).</li><li>L'Heureux, B., Gurden, H., Pain, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autofluorescence+imaging+of+NADH+and+flavoproteins+in+the+rat+brain:+insights+from+Monte+Carlo+simulations.">Autofluorescence imaging of NADH and flavoproteins in the rat brain: insights from Monte Carlo simulations.</a> Optics. Express. 17, 9477-9490 (2009).</li><li>Renaud, R., Gurden, H., Chery, R., Bendhamane, M., Martin, C., Pain, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multispectral+imaging+of+the+olfactory+bulb+activation:+influence+of+realistic+differential+pathlength+correction+factors+on+the+derivation+of+oxygenation+and+total+hemoglobin+concentration+maps+(Proceedings+Paper).">Multispectral imaging of the olfactory bulb activation: influence of realistic differential pathlength correction factors on the derivation of oxygenation and total hemoglobin concentration maps (Proceedings Paper).</a> , (2011).</li></ol>

Não temos nada a revelar.

Neste artigo apresentamos técnicas IOS e de imagem para FAS nas gravações vivo de odor evocadas atividades no OB mouse. Para atingir este objetivo relativamente simples e acessível de campo amplo de configuração de imageamento óptico é necessário. A aquisição de imagens de dados requer treinamento para realizar os procedimentos cirúrgicos bem e evitar qualquer prejuízo para a dura-máter ou tecido cerebral. Em particular, hemorragia grave vai absorver fótons registrados para a imagem latente e acabar o experimento. Um dos benefícios de IOS e imagem FAS é evitar a injeção de traçadores fluorescentes, que pode resultar em toxicidade celular ou efeitos colaterais indesejáveis. Eles fazem o possível para enfrentar as questões sobre mapas olfactivos, portanto, a codificação espacial de estímulos sensoriais. Ao contrário do que 2-Desoxiglucose imagem, eles fornecem a possibilidade de odores imagem várias em um único animal. No entanto, uma vez que a penetração fóton é limitada no tecido, IOS e FAS são restritas à parte dorsal da OBe não pode ser gravado a partir de regiões ventral. Imagem do sinal óptico endógena oferece excelente resolução espacial na imagem in vivo. Técnico cálculos melhorias preocupação quantitativa de componentes vasculares na reflectância sinais 8,9, bem como a dinâmica de oxigenação do sangue e volume durante a ativação sensorial 10. Imagem Múltiplos Comprimentos de Onda de abordagens IOS imagem são actualmente desenvolvidos em nosso laboratório para quantificar completamente a concentração de hemoglobina total e oxigenação no OB durante a ativação sensorial. Estas medições espectroscópicas ópticas adicionado ao FAS imagem dará a oportunidade de responder a relação não resolvida entre a dinâmica vascular e intracelular durante a ativação sensorial 11,12.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome de The Regent </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Imalgene </td><td> Merial </td><td></td></tr><tr><td> Rompun </td><td> Bayer </td><td></td></tr><tr><td> Agarose, tipo III-A </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A9793-50G </td></tr><tr><td> Hexanal 98% </td><td> Aldrich </td><td> 115606-100ML </td></tr></tbody></table>

imaging odor-evoked activities in the mouse olfactory bulb using optical reflectance and autofluorescence signals

No cérebro, a estimulação sensorial ativa populações de neurônios distribuída entre os módulos funcionais que participam com a codificação do estímulo. Funcionais técnicas de imageamento óptico são vantajosas para visualizar a ativação destes módulos no córtex sensorial com alta resolução espacial. Neste contexto, endógena sinais ópticos que surgem a partir de mecanismos moleculares ligados à neuroenergetics são fontes valiosas de contraste para gravar mapas espaciais de estímulos sensoriais sobre os campos de largura no cérebro de roedores. Aqui, apresentamos duas técnicas com base nas alterações de propriedades ópticas endógena do tecido cerebral durante a ativação. Primeiro os sinais ópticos intrínsecos (IOS) são produzidos por uma alteração local na reflexão da luz vermelha devido a: (i) absorção por alterações no nível de oxigenação do sangue eo volume de sangue (ii) dispersão de fótons. O uso de in vivo IOS para gravar mapas espaciais começou em meados de 1980 com o observatina óptica de mapas de barris whisker no rato e as colunas de orientação do córtex visual do gato 1. IOS imagem da superfície do roedor bulbo olfatório (OB), em resposta a odores mais tarde foi demonstrado pelo grupo de Larry Katz 2. A segunda abordagem se baseia em sinais flavoproteína autofluorescência (FAS), devido a mudanças no estado redox desses intermediários metabólicos mitocondrial. Mais precisamente, a técnica é baseada na fluorescência verde devido ao estado oxidado de flavoproteínas quando o tecido está animado com luz azul. Embora tais sinais estavam provavelmente entre as primeiras moléculas fluorescentes gravadas para o estudo da atividade cerebral pelos estudos pioneiros de Chances Britton e colegas 3, não foi até recentemente que eles têm sido usados ​​para o mapeamento de ativação do cérebro in vivo. FAS imagem foi aplicada pela primeira vez para o córtex somatossensorial em roedores, em resposta à estimulação pata traseira por grupo Katsuei Shibuki 4. O sistema olfativo é de importância central para a sobrevivência da grande maioria das espécies vivas, pois permite a detecção eficiente e identificação de substâncias químicas no ambiente (comida, predadores). O OB é o primeiro relé de processamento da informação olfativa do cérebro. Que recebe projeções aferentes do olfactory principal neurônios sensoriais que detectam as moléculas de odores voláteis. Cada neurônio sensorial expressa apenas um tipo de receptor de odorante e neurônios transportando o mesmo tipo de receptor envia seus processos de nervo para o mesmo bem definido microrregiões de ~ 100μm constituído de três neuropil discreta, o glomérulo olfatório (Fig. 1). Na última década, imagem IOS tem fomentado a exploração funcional do OB 5, 6, 7, que se tornou uma das estruturas mais estudadas sensorial. O mapeamento da atividade OB com FAS imagem não foi realizada ainda. Aqui, we mostrar as etapas sucessivas de um protocolo eficiente para IOS e imagem FAS para mapear odor evocadas atividades no OB mouse.

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Odor-Evoked Activities in the Mouse Olfactory Bulb using Optical Reflectance and Autofluorescence Signals at JoVE.com

Imaging Odor-Evoked Activities in the Mouse Olfactory Bulb using Optical Reflectance and Autofluorescence Signals

Este artigo apresenta os protocolos de sinais ópticos intrínsecos e flavoproteínas imagem sinais autofluorescência para mapear odor evocadas atividades na superfície do bulbo olfatório em ratos.

Atividades de imagem Odor-Evocados no bulbo olfatório do rato usando reflectância óptica e Sinais de autofluorescência

In the brain, sensory stimulation activates distributed populations of neurons among functional modules which participate to the coding of the stimulus. ...

imaging-odor-evoked-activities-mouse-olfactory-bulb-using-optical

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

16.0K visualizações.  UMR8165 Université Paris Sud 11, Paris Diderot 7 – CNRS. Este artigo apresenta os protocolos de sinais ópticos intrínsecos e flavoproteínas imagem sinais autofluorescência para mapear odor evocadas atividades na superfície do bulbo olfatório em ratos.

Vídeo: Imaging Odor-Evoked Activities in the Mouse Olfactory Bulb using Optical Reflectance and Autofluorescence Signals

Analyzing Responses of Mouse Olfactory Sensory Neurons Using the Air-phase Electroolfactogram Recording

Animals depend on olfaction for many critical behaviors, such as finding food sources, avoiding predators, and identifying conspecifics for mating and other social interactions. The electroolfactogram (EOG) recording is an informative, easy to conduct, and reliable method to assay olfactory function at the level of the olfactory epithelium. Since the 1956 description of the EOG by Ottoson in frogs1, the EOG recording has been applied in many vertebrates including salamanders, rabbits, rats, mice, and humans (reviewed by Scott and Scott-Johnson, 2002, ref. 2). The recent advances in genetic modification in mice have rekindled interest in recording the EOG for physiological characterization of olfactory function in knock-out and knock-in mice. EOG recordings have been successfully applied to demonstrate the central role of olfactory signal transduction components3-8, and more recently to characterize the contribution of certain regulatory mechanisms to OSN responses9-12.
Odorant detection occurs at the surface of the olfactory epithelium on the cilia of OSNs, where a signal transduction cascade leads to opening of ion channels, generating a current that flows into the cilia and depolarizes the membrane13. The EOG is the negative potential recorded extracellularly at the surface of the olfactory epithelium upon odorant stimulation, resulting from a summation of the potential changes caused by individual responsive OSNs in the recording field2. Comparison of the amplitude and kinetics of the EOG thus provide valuable information about how genetic modification and other experimental manipulations influence the molecular signaling underlying the OSN response to odor. 
Here we describe an air-phase EOG recording on a preparation of mouse olfactory turbinates. Briefly, after sacrificing the mouse, the olfactory turbinates are exposed by bisecting the head along the midline and removing the septum. The turbinate preparation is then placed in the recording setup, and a recording electrode is placed at the surface of the olfactory epithelium on one of the medial turbinates. A reference electrode is electrically connected to the tissue through a buffer solution. A continuous stream of humidified air is blown over the surface of the epithelium to keep it moist. The vapor of odorant solutions is puffed into the stream of humidified air to stimulate the epithelium. Responses are recorded and digitized for further analysis.

The electroolfactogram (EOG) recording is an informative, easy-to-conduct, and reliable way of assessing olfactory function at the level of the olfactory epithelium. This protocol describes a recording setup, mouse tissue preparation, data collection, and basic data analysis.

Respostas análise de rato Olfactory neurônios sensoriais Usando a gravação Electroolfactogram Air fase

Animals depend on olfaction for many critical behaviors, such as finding food sources, avoiding predators, and identifying conspecifics for mating and ...

Neurociência

Simple and Computer-assisted Olfactory Testing for Mice

Olfaction is highly conserved among species and is required for reproduction and survival.
In humans, olfaction is also one of the senses that is affected with aging and is a strong predictor of neurodegenerative diseases. Thus, olfaction testing is used as a non-invasive diagnostic method to detect neurological deficits early on. In order to understand the mechanisms underlying olfactory network susceptibility, olfactory research in rodents has gained momentum in the past decade.
Here, we present a very simple, time efficient and reproducible olfactory testing method of innate odor perception and sensitivity in mice without the need of any prior food or water restriction. The tests are performed in a familiar environment to the mice, require only the scents and a 2 min session of odorant exposure. The analysis is performed, post-hoc, using computer-assisted commands on ImageJ and can be, therefore, carried out from start to end by one researcher.
This protocol does not require any special hardware or setup and is indicated for any laboratory interested in testing olfactory perception and sensitivity.

We present a simple and unbiased olfactory test in mice. With this protocol olfactory discrimination, preference, avoidance and sensitivity to a novel odor as compared to water can be assessed in single behavioral sessions. This method is indicated for a single experimenter and analysis is based on computer-assisted video processing.

Simples e Testes Olfativo para Ratos assistido por computador

Olfaction is highly conserved among species and is required for reproduction and survival.
In humans, olfaction is also one of the senses that is affected ...

Comportamento

Imaging Pheromone Sensing in a Mouse Vomeronasal Acute Tissue Slice Preparation

Peter Karlson and Martin L&uuml;scher used the term pheromone for the first time in 19591 to describe chemicals used for intra-species communication. Pheromones are volatile or non-volatile short-lived molecules2 secreted and/or contained in biological fluids3,4, such as urine, a liquid known to be a main source of pheromones3. Pheromonal communication is implicated in a variety of key animal modalities such as kin interactions5,6, hierarchical organisations3 and sexual interactions7,8 and are consequently directly correlated with the survival of a given species9,10,11. In mice, the ability to detect pheromones is principally mediated by the vomeronasal organ (VNO)10,12, a paired structure located at the base of the nasal cavity, and enclosed in a cartilaginous capsule. Each VNO has a tubular shape with a lumen13,14 allowing the contact with the external chemical world. The sensory neuroepithelium is principally composed of vomeronasal bipolar sensory neurons (VSNs)15. Each VSN extends a single dendrite to the lumen ending in a large dendritic knob bearing up to 100 microvilli implicated in chemical detection16. Numerous subpopulations of VSNs are present. They are differentiated by the chemoreceptor they express and thus possibly by the ligand(s) they recognize17,18. Two main vomeronasal receptor families, V1Rs and V2Rs19,20,21,22, are composed respectively by 24023 and 12024 members and are expressed in separate layers of the neuroepithelium. Olfactory receptors (ORs)25 and formyl peptide receptors (FPRs)26,27 are also expressed in VSNs.
Whether or not these neuronal subpopulations use the same downstream signalling pathway for sensing pheromones is unknown. Despite a major role played by a calcium-permeable channel (TRPC2) present in the microvilli of mature neurons28 TRPC2 independent transduction channels have been suggested6,29. Due to the high number of neuronal subpopulations and the peculiar morphology of the organ, pharmacological and physiological investigations of the signalling elements present in the VNO are complex.
Here, we present an acute tissue slice preparation of the mouse VNO for performing calcium imaging investigations. This physiological approach allows observations, in the natural environment of a living tissue, of general or individual subpopulations of VSNs previously loaded with Fura-2AM, a calcium dye. This method is also convenient for studying any GFP-tagged pheromone receptor and is adaptable for the use of other fluorescent calcium probes. As an example, we use here a VG mouse line30, in which the translation of the pheromone V1rb2 receptor is linked to the expression of GFP by a polycistronic strategy.

In mice, the ability to detect pheromones is principally mediated by the vomeronasal organ (VNO). Here, an acute tissue slice preparation of VNO for performing calcium imaging is described. This physiological approach allows observations of subpopulations and/or individual neurons in a living tissue and is convenient for receptor-ligand identification.

Imagem Pheromone Sensing em um Preparação Slice rato Vomeronasal aguda do tecido

Peter Karlson and Martin L&uuml;scher used the term pheromone for the first time in 19591 to describe chemicals used for intra-species communication. ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of the olfactory epithelium continuously give rise to new sensory neurons that extend their axons into the olfactory bulb, where they face the challenge to integrate into existing circuitry. Because of this particular feature, the olfactory system represents a unique opportunity to monitor axonal wiring and guidance, and to investigate synapse formation. Here we describe a procedure for in vivo labeling of sensory neurons and subsequent visualization of axons in the olfactory system of larvae of the amphibian Xenopus laevis. To stain sensory neurons in the olfactory organ we adopt the electroporation technique. In vivo electroporation is an established technique for delivering fluorophore-coupled dextrans or other macromolecules into living cells. Stained sensory neurons and their axonal processes can then be monitored in the living animal either using confocal laser-scanning or multiphoton microscopy. By reducing the number of labeled cells to few or single cells per animal, single axons can be tracked into the olfactory bulb and their morphological changes can be monitored over weeks by conducting series of in vivo time lapse imaging experiments. While the described protocol exemplifies the labeling and monitoring of olfactory sensory neurons, it can also be adopted to other cell types within the olfactory and other systems.

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

We describe a protocol for in vivo labeling of olfactory sensory neurons by electroporation and subsequent confocal laser-scanning or multiphoton microscopy to visualize neuronal morphology and its development over time.

O Sistema Olfativo como um modelo para estudar os padrões de crescimento axonal e Morfologia<em&gt; In Vivo</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

<meta charset="utf8"></head><body>Projetando um olfatômetro flexível e econômico para experimentos olfativos com roedores

Constructing an Olfactometer for Rodent Olfactory Behavior Studies

The use of olfactometers to study rodent behavior and brain activity during olfactory tasks is crucial for understanding brain circuits. These sophisticated devices allow researchers to precisely control and deliver odor stimuli, enabling the investigation of complex olfactory processes in rodents. Although commercially available olfactometers are convenient, they present challenges when technical issues arise, often requiring costly assistance and potentially disrupting research timelines. This article details the construction of a custom olfactometer specifically designed for mouse olfactory behavior experiments, providing a comprehensive list of parts and step-by-step instructions. The olfactometer is controlled through MATLAB, offering a user-friendly interface for researchers. Importantly, the open-source code allows users to modify and adapt the system, tailoring behavioral tasks to meet specific experimental needs. Building a customized olfactometer empowers users with the knowledge and capability to perform custom experimental design and troubleshooting independently, saving both time and resources. This approach not only enhances research flexibility but also fosters a deeper understanding of the equipment's functionality, ultimately leading to more robust and reliable olfactory studies in rodents.

<meta charset="utf8"></head><body>Construindo um Olfatômetro para Estudos de Comportamento Olfativo de Roedores Espectroscopia de Infravermelho Próximo Estudo de Hipervarredura em Aconselhamento Ps

This protocol describes the construction of an olfactometer for go/no-go olfactory behavior experiments. Step-by-step instructions, along with images, are provided to ensure the successful construction of the olfactometer. Information for troubleshooting issues encountered during the process is also included.

Construindo um olfatômetro para estudos de comportamento olfativo de roedores

The use of olfactometers to study rodent behavior and brain activity during olfactory tasks is crucial for understanding brain circuits. These ...

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. However, there is piling evidence that olfaction is not solely limited to chemical sensitivity, but also includes temperature sensitivity. Premetamorphic Xenopus laevis are translucent animals, with protruding nasal cavities deprived of the cribriform plate separating the nose and the olfactory bulb. These characteristics make them well suited for studying olfaction, and particularly thermosensitivity. The present article describes the complete procedure for measuring temperature responses in the olfactory bulb of X. laevis larvae. Firstly, the electroporation of olfactory receptor neurons (ORNs) is performed with spectrally distinct dyes loaded into the nasal cavities in order to stain their axon terminals in the bulbar neuropil. The differential staining between left and right receptor neurons serves to identify the &#947;-glomerulus as the only structure innervated by contralateral presynaptic afferents. Secondly, the electroporation is combined with focal bolus loading in the olfactory bulb in order to stain mitral cells and their dendrites. The 3D brain volume is then scanned under line-illumination microscopy for the acquisition of fast calcium imaging data while small temperature drops are induced at the olfactory epithelium. Lastly, the post-acquisition analysis allows the morphological reconstruction of the thermosensitive network comprising the &#947;-glomerulus and its innervating mitral cells, based on specific temperature-induced Ca2+ traces. Using chemical odorants as stimuli in addition to temperature jumps enables the comparison between thermosensitive and chemosensitive networks in the olfactory bulb.

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

Here we describe a protocol for measuring and analyzing temperature responses in the olfactory bulb of Xenopus laevis. Olfactory receptor neurons and mitral cells are differentially stained, after which calcium changes are recorded, reflecting a sensitivity of some neural networks in the bulb to temperature drops induced at the nose.

Gravação induzida pela temperatura actividade neuronal através de monitoramento das alterações de cálcio no bulbo olfativo de<em&gt; Xenopus laevis</em

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. ...

Live-cell Measurement of Odorant Receptor Activation Using a Real-time cAMP Assay

The enormous sizes of the mammalian odorant receptor (OR) families present difficulties to find their cognate ligands among numerous volatile chemicals. To efficiently and accurately deorphanize ORs, we combine the use of a heterologous cell line to express mammalian ORs and a genetically modified biosensor plasmid to measure cAMP production downstream of OR activation in real time. This assay can be used to screen odorants against ORs and vice versa. Positive odorant-receptor interactions from the screens can be subsequently confirmed by testing against various odor concentrations, generating concentration-response curves. Here we used this method to perform a high-throughput screening of an odorous compound against a human OR library expressed in Hana3A cells and confirmed that the positively-responding receptor is the cognate receptor for the compound of interest. We found this high-throughput detection method to be efficient and reliable in assessing OR activation and our data provide an example of its potential use in OR functional studies.

Characterizing the function of odorant receptors serves an indispensable part in the deorphanization process. We describe a method to measure the activation of odorant receptors in real time using a cAMP assay.

Viver-pilha medição de odorante Receptor de ativação usando um ensaio de campo em tempo real

The enormous sizes of the mammalian odorant receptor (OR) families present difficulties to find their cognate ligands among numerous volatile chemicals. ...

An Objective and Reproducible Test of Olfactory Learning and Discrimination in Mice

Olfaction is the predominant sensory modality in mice and influences many important behaviors, including foraging, predator detection, mating, and parenting. Importantly, mice can be trained to associate novel odors with specific behavioral responses to provide insight into olfactory circuit function. This protocol details the procedure for training mice on a Go/No-Go operant learning task. In this approach, mice are trained on hundreds of automated trials daily for 2&#8211;4 weeks and can then be tested on novel Go/No-Go odor pairs to assess olfactory discrimination, or be used for studies on how odor learning alters the structure or function of the olfactory circuit. Additionally, the mouse olfactory bulb (OB) features ongoing integration of adult-born neurons. Interestingly, olfactory learning increases both the survival and synaptic connections of these adult-born neurons. Therefore, this protocol can be combined with other biochemical, electrophysiological, and imaging techniques to study learning and activity-dependent factors that mediate neuronal survival and plasticity.

Here, we train mice on an associative learning task to test odor discrimination. This protocol also allows for studies on learning-induced structural changes in the brain.

Atividades de imagem Odor-Evocados no bulbo olfatório do rato usando reflectância óptica e Sinais de autofluorescência

Resumo

Explore mais vídeos

Capítulos neste vídeo

Respostas análise de rato Olfactory neurônios sensoriais Usando a gravação Electroolfactogram Air fase

Simples e Testes Olfativo para Ratos assistido por computador

Imagem Pheromone Sensing em um Preparação Slice rato Vomeronasal aguda do tecido

O Sistema Olfativo como um modelo para estudar os padrões de crescimento axonal e Morfologia

Construindo um olfatômetro para estudos de comportamento olfativo de roedores

Construindo um olfatômetro para estudos de comportamento olfativo de roedores

Construindo um olfatômetro para estudos de comportamento olfativo de roedores

Gravação induzida pela temperatura actividade neuronal através de monitoramento das alterações de cálcio no bulbo olfativo de

Viver-pilha medição de odorante Receptor de ativação usando um ensaio de campo em tempo real

Uma objetiva e reproduzível teste de aprendizagem olfactiva e discriminação em ratos